• ISSN 1008-505X
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UPLC-MS/MS同时测定土壤中19种植物激素方法的建立和验证

卢玉秋 宋阿琳 唐治玉 李艳玲 董炜灵 王恩召 唐治喜 范分良

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UPLC-MS/MS同时测定土壤中19种植物激素方法的建立和验证

    作者简介: 卢玉秋 E-mail:luyuqiu_1106@163.com;
    通讯作者: 范分良, E-mail:fanfenliang@caas.cn
  • 基金项目: 国家重点研发计划项目(2016YFD0200109,2016YFD0800707);国家自然科学基金(41571297);基本科研业务费项目(1610132019011,1610132019021)。

Establishment and validation of UPLC-MS/MS method for simultaneous determination of 19 phytohormones in soil

    Corresponding author: FAN Fen-liang, E-mail:fanfenliang@caas.cn
  • 摘要: 【目的】本文旨在建立土壤中多种植物激素的提取及超高效液相色谱串联质谱法,并用此方法同时测定土壤中茉莉酸、吲哚-3-乙酸、反式玉米素,玉米素核苷、异戊烯基腺嘌呤、吲哚-3-丁酸、N6-异戊烯基腺嘌呤、独脚金内酯、玉米素、二氢玉米素核苷、吲哚-3-丙酸、吲哚-3-乙酸甲酯、二氢玉米素、吲哚-3-羧酸、茉莉酸甲酯、油菜素内酯、脱落酸、赤霉素、水杨酸共19种植物激素含量。【方法】以根标土壤为试验材料,采用异丙醇︰水︰甲酸 (80︰19︰1,V/V/V) 作为提取剂,经过超声、离心后得到植物激素提取液,提取液于常温条件下真空浓缩至干,采用甲醇进行复溶,得到植物激素待测液。采用Waters ACQUITYUPLC® HSST3色谱柱对19种植物激素进行分离,以0.30 mmol/L甲酸铵水溶液 (含0.01%甲酸) 作为流动相A和0.30 mmol/L甲酸铵乙腈 (含0.01%甲酸) 作为流动相B进行梯度洗脱,流速为0.3 mL/min,柱温为30℃;采用超高效液相色谱串联质谱,多反应监测离子模式进行定性定量分析,其中,茉莉酸、吲哚-3-乙酸、反式玉米素、玉米素核苷、异戊烯基腺嘌呤、吲哚-3-丁酸、N6-异戊烯基腺嘌呤、独脚金内酯、玉米素、二氢玉米素核苷、吲哚-3-丙酸、吲哚-3-乙酸甲酯、二氢玉米素、吲哚-3-羧酸、茉莉酸甲酯、油菜素内酯采用正离子模式扫描,脱落酸、赤霉素、水杨酸采用负离子模式扫描;采用外标法测定植物激素回收率。【结果】在本试验浓度范围内,上述19种植物激素浓度与对应峰面积的相关系数 (r) 均大于0.99,检出限介于0.02~1.06 ng/g之间,19种植物激素的加标回收率为70.2%~117%,相对标准偏差介于0.20%~7.3%之间。采用优化后的实验方法测定土壤中的植物激素,结果检测出吲哚-3-乙酸、吲哚-3-羧酸、吲哚-3-乙酸甲酯、水杨酸和独角金内酯5种植物激素,含量为0.55~5.79 ng/g。【结论】本方法前处理不需要过夜浸提,加入二氯甲烷后,超声离心浓缩复溶后可直接进样检测,大大缩短了样品的前处理时间,超高效液相色谱串联质谱法操作简单,选择性好,灵敏度高,可实现土壤样品中多种植物激素的同时检测,为土壤中植物激素的深入研究提供了一种有效的研究方法。
  • 图 1  19种植物激素标准溶液正离子 (a)、负离子 (b) 模式总离子流图

    Figure 1.  Total ion chromatogram (TIC) of 19 phytohormones standard solutions with positive and negative ions scan mode

    表 1  梯度洗脱程序

    Table 1.  Gradient elution procedure

    时间(min)
    Time
    流动相
    Mobile phase
    时间(min)
    Time
    流动相
    Mobile phase
    0~2 90% A 10~11 40%~30% A
    2~4 90%~80% A 11~12 30%~20% A
    4~6 80%~60% A 12~14 20%~15% A
    6~8 60%~50% A 14~18 15%~90% A
    8~10 50%~40% A 18~20 90% A
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    表 2  19种植物激素优化后的质谱参数

    Table 2.  Optimized mass spectrometric parameters of 19 phytohormones

    植物激素
    Phytohormone
    离子模式
    Scan mode
    保留时间(min)
    Retention time
    母离子/子离子(m/z)
    Precursor/product
    锥孔电压(V)
    Cone voltage
    碰撞能量(V)
    Collision energy
    脱落酸(ABA)
    Abscisic acid
    8.96 263.2/153.0* −82 −14
    263.2/219.1
    赤霉素(GA3)
    Gibberellic acid
    7.37 345.2/143.2* −120 −20
    345.2/220.9
    茉莉酸(JA)
    Jasmonic acid
    + 10.22 211.2/133.4* 109 19
    211.2/151.0
    吲哚-3-乙酸(IAA)
    Indole-3-acetic acid
    + 8.68 176.1/130.1* 94 20
    176.1/103.0
    反式玉米素(tZ)
    Trans-zeatin
    + 3.68 220.2/136.1* 55 23
    220.2/202.0
    玉米素核苷(tZR)
    Trans-zeatin riboside
    + 5.61 352.2/220.1* 52 23
    352.2/202.0
    异戊烯基腺嘌呤(IPR)
    Isopentenyladenosine
    + 7.49 336.2/204.1* 28 23
    336.2/148.0
    吲哚-3-丁酸(IBA)
    Indole-3-butyricacid
    + 10.29 204.1/186.0* 98 17
    204.1/157.9
    N6-异戊烯基腺嘌呤(IP)
    N6-isopentenyladenine
    + 6.94 204.1/136.1* 144 18
    204.1/148.1
    独脚金内酯(SL)
    5-Deoxy-strigol
    + 14.84 331.3/234.0* 39 14
    331.3/217.1
    玉米素(cZ)
    Cis-zeatin
    + 4.34 220.0/136.0* 38 22
    220.0/202.1
    二氢玉米素核苷(DZR)
    Dihydrozeatin riboside
    + 5.60 354.2/222.1* 33 23
    354.2/136.2
    吲哚-3-丙酸(IPA)
    3-Indole propionic acid
    + 9.45 190.1/130.1* 81 19
    190.1/171.9
    吲哚-3-乙酸甲酯(MeIAA)
    Indole-3-acetic acid methyl ester
    + 11.06 190.1/130.0* 43 17
    190.1/103.0
    水杨酸(SA)
    Salicylic acid
    8.37 137.1/93.0* −31 −21
    137.1/45.0
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    表 3  19种植物激素的线性方程、相关系数及检测限

    Table 3.  Linearity, correlation coefficient and detection limits of 19 phytohormones

    植物激素Phytohormone 浓度范围Concentration (ng/mL) 线性方程Calibration equation r 检出限LOD (ng/g)
    ABA 1~100 y = 504.11x + 1358.5 0.9983 0.081
    GA3 1~100 y = 49.749x − 76.76 0.9986 0.675
    JA 10~100 y = 206.63x + 634.72 0.9962 0.529
    IAA 1~100 y = 1260.3x + 802.69 0.9968 0.243
    tZ 0.2~100 y = 4445.8x − 1214.1 0.9973 0.082
    tZR 0.5~100 y = 624.91x + 822.18 0.9980 0.134
    IPR 0.5~100 y = 1525.1x + 1479.2 0.9972 0.138
    IBA 0.5~100 y = 1112.5x + 976.26 0.9969 0.083
    IP 1~100 y = 902.03x − 739.67 0.9967 0.112
    SL 0.2~100 y = 18781x − 19805 0.9979 0.017
    cZ 0.2~100 y = 10570x − 12317 0.9987 0.026
    DZR 0.5~100 y = 1275.7x − 692.89 0.9960 0.072
    IPA 1~100 y = 1146.7x − 421.64 0.9974 0.165
    MeIAA 0.2~100 y = 10415x − 6982.3 0.9987 0.055
    SA 5~100 y = 3977.6x + 82657 0.9974 0.581
    DZ 0.2~100 y = 2604.4x − 199.5 0.9987 0.070
    ICA 5~100 y = 325.93x + 2073.6 0.9967 0.340
    MeJA 10~100 y = 533.57x + 1067.1 0.9986 0.925
    BL 5~100 y = 37.489x − 33.225 0.9970 1.057
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    表 4  19种植物激素在土壤中的回收率和相对标准偏差 (n = 5)

    Table 4.  Recovery rate and relative standard deviation of 19 phytohormones in soil

    植物激素
    Phytohormone
    浓度Concentration (ng/mL) 回收率 (%)
    Recovery
    相对标准偏差 (%)
    RSD
    加标Spiked 未加标Non-spiked 检测Detected
    ABA 5.00 0.00 3.83 76.6 5.5
    20.00 0.00 21.26 106 3.1
    50.00 0.00 58.47 117 0.8
    GA3 5.00 0.00 5.79 116 2.0
    20.00 0.00 17.56 87.8 2.1
    50.00 0.00 49.24 98.5 3.9
    SA 20.00 6.56 26.93 102 3.5
    50.00 6.56 61.60 110 2.3
    100.00 6.56 97.52 91 1.7
    IP 5.00 0.00 5.39 108 3.4
    20.00 0.00 20.83 104 5.7
    50.00 0.00 47.26 94.5 3.6
    SL 5.00 1.15 5.43 85.6 1.8
    20.00 1.15 18.06 84.6 1.7
    50.00 1.15 41.19 80.1 0.2
    cZ 5.00 0.00 5.05 101 1.7
    20.00 0.00 18.37 91.8 2.0
    50.00 0.00 43.43 86.9 3.1
    DZR 5.00 0.00 4.66 93.3 1.2
    20.00 0.00 16.69 83.5 1.5
    50.00 0.00 43.54 87.1 1.8
    IPA 5.00 0.00 5.45 109 1.6
    20.00 0.00 19.78 99 2.0
    50.00 0.00 51.06 102 2.4
    MeIAA 5.00 0.91 6.19 106 1.7
    20.00 0.91 21.87 105 5.4
    50.00 0.91 35.99 70.2 3.3
    DZ 5.00 0.00 3.75 75.0 1.1
    20.00 0.00 14.62 73.1 1.2
    50.00 0.00 37.44 74.9 1.3
    ICA 5.00 9.65 15.13 109 1.9
    20.00 9.65 28.40 93.8 6.4
    50.00 9.65 58.85 98.4 3.0
    MeJA 20.00 0.00 17.34 86.7 7.3
    50.00 0.00 48.62 97.2 2.1
    100.00 0.00 71.07 71.1 1.1
    BL 20.00 0.00 17.58 87.9 2.5
    50.00 0.00 48.89 97.8 2.5
    100.00 0.00 95.01 95 4.2
    JA 20.00 0.00 15.68 78.4 3.0
    50.00 0.00 57.21 114 2.4
    100.00 0.00 84.70 84.7 3.6
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  • [1] 薛岚. " 植物激素作用的分子机理”重大研究计划结束[J]. 中国科学基金, 2017, (1): 95. Xue L. " Molecular mechanism of plant hormone action” the end of a major research project[J]. Bulletin of National Science Foundation of China, 2017, (1): 95.
    [2] Tien T M, Gaskins M H, Hubbell D H. Plant growth substances produced by Azospirillum brasilense and their effect on the growth of pearl millet (Pennisetum americanum L.)[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1979, 37(5): 1016–1024.
    [3] Morris R O. Genes Specifying auxin and cytokinin biosynthesis in phytopathogens[J]. Annual Review of Plant Biology, 2003, 37(1): 509–538.
    [4] Lichter A, Barash I, Valinsky L, et al. The genes involved in cytokinin biosynthesis in Erwinia herbicola pv. gypsophilae: characterization and role in gall formation[J]. Journal of Bacteriology, 1995, 177(15): 4457. doi: 10.1128/jb.177.15.4457-4465.1995
    [5] Rojas M C, Hedden P, Gaskin P, et al. The P450-1 gene of Gibberella fujikuroi encodes a multifunctional enzyme in gibberellin biosynthesis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2001, 98(10): 5838. doi: 10.1073/pnas.091096298
    [6] Cassãn F, Bottini R, Schneider G, et al. Azospirillum brasilense and Azospirillum lipoferum hydrolyze conjugates of GA20 and metabolize the resultant aglycones to GA1 in seedlings of rice dwarf mutants[J]. Plant Physiology, 2001, 125(4): 2053–2058. doi: 10.1104/pp.125.4.2053
    [7] Frankenberger W T, Poth M. Biosynthesis of indole-3-acetic acid by the pine ectomycorrhizal fungus Pisolithus tinctorius[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1987, 53(12): 2908.
    [8] Atzorn R, Crozier A, Wheeler C T, et al. Production of gibberellins and indole-3-acetic acid by Rhizobium phaseoli in relation to nodulation of Phaseolus vulgaris roots[J]. Planta, 1988, 175(4): 532–538. doi: 10.1007/BF00393076
    [9] Badenochjones J, Summons R E, Djordjevic M A, et al. Mass spectrometric quantification of indole-3-acetic acid in Rhizobium culture supernatants: relation to root hair curling and nodule initiation[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1982, 44(2): 275.
    [10] 鲁哲, 邹振华, 路婧, 等. 植物激素测定方法述评[J]. 作物研究, 2011, 25(5): 531–534. Lu Z, Zhou Z H, Lu J, et al. Research progress on determination of phytohormones[J]. Crop Research, 2011, 25(5): 531–534. doi: 10.3969/j.issn.1001-5280.2011.05.28
    [11] Solomon E P, Berg L R, Martin D W. Biology (6th ed.)[M]. New York: McGraw-Hill Science/Engineering/Math, 2002.
    [12] Thimann K V, Bonner J. The mechanism of the action of the growth substance of plants[J]. Political Studies, 1933, 113(781): 126–149.
    [13] 李艳华. 基于质谱技术的植物激素高效分析方法研究[D]. 北京: 中国农业科学院硕士学位论文, 2011.
    Li Y H. Study on high efficiency analysis of plant hormones based on mass spectrometry[D]. Beijing: MS Thesis of Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2011.
    [14] 白玉, 杜甫佑, 刘虎威. 植物激素检测技术研究进展[J]. 生命科学, 2010, 22(1): 36–44. Bai Y, Tu F Y, Liu H W. Recent development in determination of plant hormones[J]. Chinese Bullentin of Life Sciences, 2010, 22(1): 36–44.
    [15] Fu J H, Sun X H, Wang J D, et al. Progress in quantitative analysis of plant hormones[J]. Chinese Science Bulletin, 2011, 56(z1): 355–366.
    [16] Weiler E W. Radioimmunoassays for trans-zeatin and related cytokinins[J]. Planta, 1980, 149(2): 155–162. doi: 10.1007/BF00380877
    [17] 刘志勇, 沈春章, 董元彦. 气相色谱法速测油菜中的乙烯释放量[J]. 化学与生物工程, 2006, 23(2): 55–56. Liu Z Y, Shen C Z, Dong Y Y. Determination of ethylene release rate in rape by gas chromatography[J]. Chemistry & Bioengineering, 2006, 23(2): 55–56. doi: 10.3969/j.issn.1672-5425.2006.02.020
    [18] 胡佩, 刘德辉, 胡锋, 等. 蚓粪中的植物激素及其对绿豆插条不定根发生的促进作用[J]. 生态学报, 2002, 22(8): 1211–1214. Hu P, Liu D H, Hu F, et al. Plant hormones in earthworm casts and their promotion on adventitious root formation of mung bean cutting[J]. Acta Ecologica Sinica, 2002, 22(8): 1211–1214. doi: 10.3321/j.issn:1000-0933.2002.08.006
    [19] 马有宁. 液相串联质谱测定水稻37种内源激素方法的研究[D]. 北京: 中国农业科学院硕士学位论文, 2011.
    Ma Y N. Quantitative analysis of 37 phytohormones in Oryza Sativa by high-performance liquid chromatography-mass spectrometry[D]. Beijing: MS Thesis of Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2011.
    [20] Engelberth J, Schmelz E A, Alborn H T, et al. Simultaneous quantification of jasmonic acid and salicylic acid in plants by vapor-phase extraction and gas chromatography-chemical ionization-mass spectrometry[J]. Analytical Biochemistry, 2003, 312(2): 242–250. doi: 10.1016/S0003-2697(02)00466-9
    [21] Feng J Z, You J J, Xing Y X, et al. Study on the extraction, purification and quantification of jasmonic acid, abscisic acid and indole-3-acetic acid in plants[J]. Phytochemical Analysis, 2008, 19(6): 560. doi: 10.1002/pca.v19:6
    [22] Li P. Simultaneous determination of 13 phytohormones in oilseed rape tissues by liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry and the evaluation of the matrix effect[J]. Journal of Separation Science, 2011, 34(6): 640. doi: 10.1002/jssc.v34.6
    [23] Pan X, Welti R, Wang X. Quantitative analysis of major plant hormones in crude plant extracts by high-performance liquid chromatography-mass spectrometry[J]. Nature Protocols, 2010, 5(6): 986. doi: 10.1038/nprot.2010.37
    [24] 曾少华, 高洁莹. 植物激素理化检测方法的研究进展[J]. 农产品加工(学刊), 2013, (9): 62–66. Zeng S H, Gao J Y. Recent development in physical and chemical determination of phytohormones[J]. Academic Periodical of Farm Products Processing, 2013, (9): 62–66.
    [25] Segarra G, Jáuregui O, Casanova E, et al. Simultaneous quantitative LC-ESI-MS/MS analyses of salicylic acid and jasmonic acid in crude extracts of Cucumis sativus under biotic stress[J]. Phytochemistry, 2006, 67(4): 395–401. doi: 10.1016/j.phytochem.2005.11.017
    [26] Zhao H, Peng S, Chen Z, et al. Abscisic acid in soil facilitates community succession in three forests in China[J]. Journal of Chemical Ecology, 2011, 37(7): 785–793. doi: 10.1007/s10886-011-9970-z
    [27] 李秀菊, 董淑富. 施用不同量有机肥的盆栽苹果土壤中生长素及细胞分裂素含量分析简报[J]. 植物生理学报, 1998, (3): 183–185. Li X J, Dong S F. Determination of indole-3-acetic acid and cytokinin in the soil with different organic manure for pot-cultured apple[J]. Plant Physiology Journal, 1998, (3): 183–185.
    [28] Li Y N, Wu H L, Zhu S H, et al. Determination of indole-3-acetic acid in soil using excitation-emission matrix fluorescence with trilinear decomposition-based calibration methods[J]. Analytical Sciences: the International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry, 2009, 25(1): 83. doi: 10.2116/analsci.25.83
    [29] Yu X, Song X, Jing Q, et al. An ultrahigh-performance liquid chromatography method with electrospray ionizationt tandem mass spectrometry for simultaneous quantification of five phytohormones in medicinal plant Glycyrrhiza uralensis under abscisic acid stress[J]. Journal of Natural Medicines, 2015, 69(3): 278. doi: 10.1007/s11418-015-0889-5
    [30] Toledo R A D, Vaz C M P. Use of a graphite-polyurethane composite electrode for electroanalytical determination of indole-3-acetic acid in soil samples[J]. Microchemical Journal, 2007, 86(2): 161–165. doi: 10.1016/j.microc.2007.02.002
    [31] Yuan C L, Mou C X, Wu W L, et al. Effect of different fertilization treatments on indole-3-acetic acid producing bacteria in soil[J]. Journal of Soils and Sediments, 2011, 11(2): 322–329. doi: 10.1007/s11368-010-0315-2
    [32] 曹慧, 陈小珍, 祝颖, 等. QuEChERS/超高效液相色谱-串联质谱技术同时测定食品中13种植物生长调节剂残留[J]. 化学试剂, 2013, 35(11): 1005–1009. Cao H, Chen X Z, Zhu Y, et al. Determination of plant growth regulator in food by QuEChERS and ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chemical Reagents, 2013, 35(11): 1005–1009.
    [33] Du F, Ruan G, Liu H. Analytical methods for tracing plant hormones[J]. Analytical & Bioanalytical Chemistry, 2012, 403(1): 55.
    [34] Frankenberger W T, Brunner W. Method of detection of auxin-indole-3-acetic acid in soils by high-performance liquid-chromatography[J]. Journal of the Soil Science Society of America, 1983, 47(2): 237–241. doi: 10.2136/sssaj1983.03615995004700020012x
    [35] Sarwar M, Arshad M, Martens D A, et al. Tryptophan-dependent biosynthesis of auxins in soil[J]. Plant and Soil, 1992, 147(2): 207–215. doi: 10.1007/BF00029072
    [36] 邓文红, 张俊琦. UPLC-MS/MS测定油蒿叶片中4种内源植物激素[J]. 植物学研究, 2015, 4(1): 1–7. Deng W H, Zhang J J. Determination of four endogenous phytohormones in artemisia ordosica leaves by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Botanical Research, 2015, 4(1): 1–7. doi: 10.11913/PSJ.2095-0837.2015.10001
    [37] 范俊岗. 刺槐、国槐根际土壤中氨基酸和IAA的含量[J]. 辽宁大学学报(自然科学版), 1994, (3): 92–96. Fan J G. The content of amino acid and IAA in rhizosphere soil of Robinia Pseudoacacia and Sophora Japonica[J]. Journal of Liaoning University (Natural Sciences Edition), 1994, (3): 92–96.
    [38] 徐生坚, 曹慧, 陈小珍. 超高效液相色谱-串联质谱法测定粮谷中6种植物生长调节剂残留[J]. 食品科学, 2013, 34(18): 218–222. Xu S J, Cao H, Chen X Z. Determination of plant growth regulator residues in grains by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Food Science, 2013, 34(18): 218–222. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201318044
    [39] 王芳, 陈子林. 茉莉酸类植物激素分析研究进展[J]. 生命科学, 2010, 22(1): 45–58. Wang F, Chen Z L. Advance in the analysis of plant hormone jasmonates[J]. Chinese Bulletin of Life Sciences, 2010, 22(1): 45–58.
    [40] 章虎, 钱鸣蓉, 李振, 等. 高效液相色谱-串联质谱快速测定稻米中氯虫苯甲酰胺残留[J]. 农药, 2010, 49(12): 906–908. Zhang H, Qian M R, Li Z, et al. Determination of Chlorantraniliprole Residue in Rices by HPLC-MS/MS[J]. Agrochemicals, 2010, 49(12): 906–908. doi: 10.3969/j.issn.1006-0413.2010.12.017
  • [1] 陈伟马国瑞李春九 . 植物激素对离子吸收运输和分布的影响. 植物营养与肥料学报, 1997, 3(3): 193-200. doi: 10.11674/zwyf.1997.0301
    [2] 库文珍彭克勤张雪芹童建华周浩萧浪涛 . 低钾胁迫对水稻苗期矿质营养吸收和植物激素含量的影响 . 植物营养与肥料学报, 2009, 15(1): 69-75. doi: 10.11674/zwyf.2009.0110
    [3] 廖德华刘俊丽刘健健杨晓峰陈潇顾冕陈爱群 . 植物激素响应和调控丛枝菌根共生研究进展. 植物营养与肥料学报, 2016, 22(6): 1679-1689. doi: 10.11674/zwyf.15298
    [4] 王运华周晓峰 . 硼对棉花叶柄中无机营养、酚、酶活性和激素影响的研究. 植物营养与肥料学报, 1994, 1(1): 61-66. doi: 10.11674/zwyf.1994.0108
    [5] 江红梅殷中伟史发超刘彩月程明芳范丙全 . 一株耐盐溶磷真菌的筛选、鉴定及其生物肥料的应用效果. 植物营养与肥料学报, 2018, 24(3): 728-742. doi: 10.11674/zwyf.17468
    [6] 张志强1李春花黄绍文高伟唐继伟 . 土壤及畜禽粪肥中四环素类抗生素固相萃取-高效液相色谱法的优化与初步应用. 植物营养与肥料学报, 2013, 19(3): 713-726. doi: 10.11674/zwyf.2013.0323
    [7] 刘国栋李继云李振声 . 植物高效利用土壤磷营养的化学机理. 植物营养与肥料学报, 1995, 1(3-4): 72-78. doi: 10.11674/zwyf.1995.0311
    [8] 曾欣刘树元李朝辉赵守龙林梦露李晓珊刘文莉 . 十种湿生植物根际真菌群落参数和土壤肥力的比较. 植物营养与肥料学报, 2015, 21(3): 815-822. doi: 10.11674/zwyf.2015.0330
    [9] 艾超孙静文王秀斌梁国庆何萍周卫 . 植物根际沉积与土壤微生物关系研究进展. 植物营养与肥料学报, 2015, 21(5): 1343-1351. doi: 10.11674/zwyf.2015.0530
    [10] 李忠徽王旭东 . 灌施木醋液对土壤性质和植物生长的影响. 植物营养与肥料学报, 2014, 20(2): 510-516. doi: 10.11674/zwyf.2014.0229
    [11] 任豫霜朱丹姜伟李玖燃张磊 . 酸性土壤中接种耐酸根瘤菌对豆科植物根际微生态的影响. 植物营养与肥料学报, 2017, 23(4): 1077-1088. doi: 10.11674/zwyf.16362
    [12] . 植物砷的生理和分子生物学研究进展—从土壤、根际到植物吸收、运输及耐性. 植物营养与肥料学报, 2010, 16(5): 1264-1275. doi: 10.11674/zwyf.2010.0530
    [13] 王庆仁李继云李振声 . 植物高效利用土壤难溶态磷研究动态及展望. 植物营养与肥料学报, 1998, 4(2): 107-116. doi: 10.11674/zwyf.1998.0202
    [14] 张德闪李洪波申建波 . 集约化互作体系植物根系高效获取土壤养分的策略与机制. 植物营养与肥料学报, 2017, 23(6): 1547-1555. doi: 10.11674/zwyf.17238
    [15] 李春俭马玮张福锁 . 根际对话及其对植物生长的影响. 植物营养与肥料学报, 2008, 14(1): 178-183. doi: 10.11674/zwyf.2008.0129
    [16] 张福锁 . 根分泌物与禾本科植物对缺铁胁迫的适应机理. 植物营养与肥料学报, 1995, 1(1): 17-23. doi: 10.11674/zwyf.1995.0103
    [17] 李书田林葆 . 土壤中植物有效硫的评价. 植物营养与肥料学报, 1998, 4(1): 75-83. doi: 10.11674/zwyf.1998.0112
    [18] 石辉赵晓光 . 土壤和植物中元素含量的Zipf法则描述. 植物营养与肥料学报, 2004, 10(6): 680-682. doi: 10.11674/zwyf.2004.0625
    [19] 杨俊兴郑国砥胡健杨军郭俊娒周小勇曹柳焦玉字 . 湿地植物铅的富集特征及根际铅移动性的影响因素研究. 植物营养与肥料学报, 2018, 24(4): 1058-1067. doi: 10.11674/zwyf.17214
    [20] 贾利华王鑫张蕊林德立邱睿邢国珍刘娜郑文明 . 根际微生物群落介导植物磷胁迫应答与免疫调控的整合机制. 植物营养与肥料学报, 2019, 25(2): 321-327. doi: 10.11674/zwyf.17441
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出版历程
  • 收稿日期:  2018-04-12
  • 网络出版日期:  2019-06-27
  • 刊出日期:  2019-06-01

UPLC-MS/MS同时测定土壤中19种植物激素方法的建立和验证

    作者简介:卢玉秋 E-mail:luyuqiu_1106@163.com
    通讯作者: 范分良, fanfenliang@caas.cn
  • 1. 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所/农业部植物营养与肥料重点实验室,北京 100081
  • 2. 中国计量科学研究院,北京100029
  • 3. 中南大学,长沙 410083
  • 基金项目: 国家重点研发计划项目(2016YFD0200109,2016YFD0800707);国家自然科学基金(41571297);基本科研业务费项目(1610132019011,1610132019021)。
  • 摘要: 【目的】本文旨在建立土壤中多种植物激素的提取及超高效液相色谱串联质谱法,并用此方法同时测定土壤中茉莉酸、吲哚-3-乙酸、反式玉米素,玉米素核苷、异戊烯基腺嘌呤、吲哚-3-丁酸、N6-异戊烯基腺嘌呤、独脚金内酯、玉米素、二氢玉米素核苷、吲哚-3-丙酸、吲哚-3-乙酸甲酯、二氢玉米素、吲哚-3-羧酸、茉莉酸甲酯、油菜素内酯、脱落酸、赤霉素、水杨酸共19种植物激素含量。【方法】以根标土壤为试验材料,采用异丙醇︰水︰甲酸 (80︰19︰1,V/V/V) 作为提取剂,经过超声、离心后得到植物激素提取液,提取液于常温条件下真空浓缩至干,采用甲醇进行复溶,得到植物激素待测液。采用Waters ACQUITYUPLC® HSST3色谱柱对19种植物激素进行分离,以0.30 mmol/L甲酸铵水溶液 (含0.01%甲酸) 作为流动相A和0.30 mmol/L甲酸铵乙腈 (含0.01%甲酸) 作为流动相B进行梯度洗脱,流速为0.3 mL/min,柱温为30℃;采用超高效液相色谱串联质谱,多反应监测离子模式进行定性定量分析,其中,茉莉酸、吲哚-3-乙酸、反式玉米素、玉米素核苷、异戊烯基腺嘌呤、吲哚-3-丁酸、N6-异戊烯基腺嘌呤、独脚金内酯、玉米素、二氢玉米素核苷、吲哚-3-丙酸、吲哚-3-乙酸甲酯、二氢玉米素、吲哚-3-羧酸、茉莉酸甲酯、油菜素内酯采用正离子模式扫描,脱落酸、赤霉素、水杨酸采用负离子模式扫描;采用外标法测定植物激素回收率。【结果】在本试验浓度范围内,上述19种植物激素浓度与对应峰面积的相关系数 (r) 均大于0.99,检出限介于0.02~1.06 ng/g之间,19种植物激素的加标回收率为70.2%~117%,相对标准偏差介于0.20%~7.3%之间。采用优化后的实验方法测定土壤中的植物激素,结果检测出吲哚-3-乙酸、吲哚-3-羧酸、吲哚-3-乙酸甲酯、水杨酸和独角金内酯5种植物激素,含量为0.55~5.79 ng/g。【结论】本方法前处理不需要过夜浸提,加入二氯甲烷后,超声离心浓缩复溶后可直接进样检测,大大缩短了样品的前处理时间,超高效液相色谱串联质谱法操作简单,选择性好,灵敏度高,可实现土壤样品中多种植物激素的同时检测,为土壤中植物激素的深入研究提供了一种有效的研究方法。

    English Abstract

    • 植物激素是植物体内可自身合成的微量有机物,在非常低的浓度条件下就能参与并调控植物的生长、发育过程[1]。除植物外,微生物也能产生植物激素,如固氮螺菌[2]、土壤杆菌[3]、草生欧文氏杆菌[4]能够分泌细胞分裂素,赤霉菌[5]、巴西固氮螺菌[6]能分泌赤霉素,豆包菌[7]、固氮螺菌[2]、根瘤菌[8]、土壤杆菌[9]能够分泌生长素,这些微生物分泌的植物激素释放到土壤中,共同参与调控植物的生长发育。由于土壤基质成分复杂且土壤中植物激素含量极低,这在很大程度上增加了检测的困难,前人关于土壤中植物激素的提取和检测,大部分关注的只是一种或两种植物激素,土壤中多种植物激素的快速提取及同时检测鲜有报道,因此,土壤中植物激素的定性定量研究目前仍然是植物激素研究领域的难点之一。

      植物中的激素最早使用生物鉴定法进行测定,它通过植物激素作用于植物组织或者器官后可产生生理生化变化,然后通过该变化的大小即可推算出植物激素的含量[10],如Went建立的燕麦鞘弯曲测定法测定生长素[11]、Thimann和Bonner建立的燕麦叶鞘切断伸长法测定生长素[12]等,生物测定法简单,但灵敏度和选择性较差[13];随后发展了免疫检测法[14],包括放射免疫分析和酶联免疫法,免疫检测法专一性强、选择性和灵敏度高[15],不过抗体容易发生交叉反应,且制备抗体时间长[16];之后发展了色谱法[17-18],该方法具有高分离特性,能够实现多种植物激素的同时测定,但对样品的前处理要求高,且对复杂基质样品定性定量存在误差[19];如今,色谱质谱联用技术[20-23]已经逐渐发展成为植物激素检测的主要方法[23],它结合了色谱具有对复杂样品的高分离能力和质谱拥有的高灵敏度、高选择性特点,大大提高了植物组织中激素检测的灵敏度[24],以及定性和定量的准确度[25]。相比之下,关于土壤中植物激素检测报道则少得多[26-28],目前检测的方法主要集中在电化学法[29-30]、比色法[31]、免疫检测法[27, 32]和色谱法[33-35]。这些方法较色谱质谱联用技术相比,操作步骤复杂,灵敏度更低,而且对复杂样品基质的定性定量常常不如人意[19]。少量采用色谱质谱联用技术的研究,大多采用过夜浸提,但关注的植物激素种类单一,以往的研究没有成功的进行过土壤样品依次提取从而同时测定多种植物激素的方法,因此,有必要探索同时检测土壤中多种植物激素的方法,系统深入探明土壤植物激素的种类和含量。

      本研究以中国科学院植物研究所试验地玉米根际土壤为研究对象,以超高效液相色谱–串联质谱法(UPLC-MS/MS)为研究手段,旨在建立和验证一种能同时测定土壤中生长素类、细胞分裂素类、赤霉素类、脱落酸类、水杨酸类、茉莉酸类、独脚金内酯、油菜素内酯8大类植物激素的方法。

      • Agilent1290超高效液相色谱仪、ABQtrap5500质谱仪,质谱仪配置有电喷雾电离接口及Analyst数据处理系统;超声波清洗仪;赛默飞RC10-22T真空离心浓缩机;Sigma3k15离心机;Mettler Toledo电子天平 (0.001 g);0.22 μm尼龙针头滤器。

      • 甲酸为分析纯,异丙醇、二氯甲烷、乙腈、甲醇为色谱纯 (购自北京万诚博达科贸有限公司);实验室用水产自Milli-Qplus超纯水机;脱落酸 (ABA)、赤霉素 (GA3)、茉莉酸 (JA)、吲哚-3-乙酸 (IAA)、反式玉米素 (tZ)、玉米素核苷 (tZR)、异戊烯基腺嘌呤 (IPR)、吲哚-3-丁酸 (IBA)、N6-异戊烯基腺嘌呤 (IP)、独脚金内酯 (SL)、玉米素 (cZ)、二氢玉米素核苷 (DZR)、吲哚-3-丙酸 (IPA)、吲哚-3-乙酸甲酯 (MeIAA)、水杨酸 (SA)、二氢玉米素 (DZ)、吲哚-3-羧酸 (ICA)、茉莉酸甲酯 (MeJA)、油菜素内酯 (BL) (购自OlChemImLtd,Olomouc,Czech Republic)。

      • 供试土壤为中国科学院植物研究所试验地玉米根际土壤,其化学性质如下:有机质11.55 g/kg,全氮0.68 g/kg,全磷0.57 g/kg,硝态氮16.71 mg/kg,铵态氮6.99 mg/kg,速效磷42.78 mg/kg,有效钾65.64 mg/kg,pH为7.61。

        提取步骤如下:1) 准确称取0.5 g (精确到0.001 g) 保存于−20℃冰箱的根际土壤样品于50 mL离心管;2) 加入5 mL异丙醇∶水∶甲酸(80∶19∶1,V/V/V);3) 在涡旋仪上涡旋30 s;4) 用超声波清洗仪于常温、100 W条件下超声30 min;5) 加入1 mL二氯甲烷,继续用超声波清洗仪于常温、100 W条件下超声30 min;6) 于9000 rpm、4℃的条件下离心10 min,将上清液转移至15 mL离心管;7) 在常温条件下用真空离心浓缩机对上清液进行离心浓缩;8) 用300 μL甲醇进行复溶;9) 复溶液过0.22 μm尼龙针头滤器,得到植物激素待测液;10) 采用UPLC-MS/MS法测定植物激素。

      • 色谱条件:Waters ACQUITYUPLC ® HSS T3色谱柱 (2.1 mm × 150 mm,1.8 μm);分别以0.30 mmol/L甲酸铵水溶液 (含0.01%甲酸) 作为流动相A和0.30 mmol/L甲酸铵乙腈 (含0.01%甲酸) 作为流动相B;进样量5 μL,流速0.30 mL/min,柱温30℃,梯度洗脱程序如表1所示。

        表 1  梯度洗脱程序

        Table 1.  Gradient elution procedure

        时间(min)
        Time
        流动相
        Mobile phase
        时间(min)
        Time
        流动相
        Mobile phase
        0~2 90% A 10~11 40%~30% A
        2~4 90%~80% A 11~12 30%~20% A
        4~6 80%~60% A 12~14 20%~15% A
        6~8 60%~50% A 14~18 15%~90% A
        8~10 50%~40% A 18~20 90% A

        质谱条件:离子源采用电喷雾离子源;扫描方式分别进行正/负离子模式扫描;检测方式为多反应离子监测 (MRM);气帘气压 (CUR) 20 Psi;碰撞气压 (CAD) medium;喷雾电压 (IS) 5500 V/–4500 V;离子源温度550℃;雾化气压 (GS1) 20 Psi;辅助气压 (GS2) 0 Psi;流速0.30 mL/min。

      • 对玉米根际土壤植物激素提取液进行浓缩、复溶、过滤后,采用UPLC-MS/MS法进行检测,以各植物激素标准品的定性离子对 (m/z) 及对应的的保留时间(RT)作为依据进行定性分析,以各植物激素标准品的定量离子对 (m/z) 所对应峰面积进行定量,并采用外标法计算回收率。测试设置5个重复,实验数据用Excel2010及Origin8.5软件进行分析。

      • 本试验选择Waters ACQUITYUPLC ® HSS T3反相色谱柱来分离各植物激素,分别以0.30 mmol/L甲酸铵水溶液 (含0.01%甲酸) 作为流动相A和0.30 mmol/L甲酸铵乙腈 (含0.01%甲酸) 作为流动相B,最后采用上述1.3所述的梯度洗脱程序,实现了19种植物激素的完全分离。图1为19种植物激素标准溶液正、负离子扫描模式总离子流图 (TIC),其中 (a)、(b) 分别为正离子、负离子扫描模式TIC图。

        图  1  19种植物激素标准溶液正离子 (a)、负离子 (b) 模式总离子流图

        Figure 1.  Total ion chromatogram (TIC) of 19 phytohormones standard solutions with positive and negative ions scan mode

      • 首先,配制浓度为300 ng/mL的单一标准溶液,采用流动注射的方式,以流速为7 μL/min将单一标准溶液注入离子源,在质荷比m/z 100~500范围内进行扫描,在电喷雾离子源 (ESI)下分别进行正离子模式 (+) 和负离子模式 (–) 全扫描,以确定各标准物质的分子离子峰和最佳的电离方式。结果表明,在电喷雾正离子扫描模式下,JA、IAA、tZ、tZR、IPR、IBA、IP、SL、cZ、DZR、IPA、MeIAA、DZ、ICA、MeJA、BL全扫描的分子离子[M + H]+ 较理想;在电喷雾负离子扫描模式下,ABA、GA3、SA全扫描的分子离子[M – H] 较理想。然后再进行子离子峰 (Product MS2) 扫描,不断的调节碰撞能量 (CE),以确定各标准物质合适的子离子峰,最后进行多反应离子监测扫描 (MRM),分别对19种植物激素的去簇电压 (DP)、碰撞能量 (CE)、入口电压 (EP)、碰撞室出口电压 (CXP) 进行优化,使信号达到最佳的响应值。19种植物激素标准物质优化后的质谱参数见表2

        表 2  19种植物激素优化后的质谱参数

        Table 2.  Optimized mass spectrometric parameters of 19 phytohormones

        植物激素
        Phytohormone
        离子模式
        Scan mode
        保留时间(min)
        Retention time
        母离子/子离子(m/z)
        Precursor/product
        锥孔电压(V)
        Cone voltage
        碰撞能量(V)
        Collision energy
        脱落酸(ABA)
        Abscisic acid
        8.96 263.2/153.0* −82 −14
        263.2/219.1
        赤霉素(GA3)
        Gibberellic acid
        7.37 345.2/143.2* −120 −20
        345.2/220.9
        茉莉酸(JA)
        Jasmonic acid
        + 10.22 211.2/133.4* 109 19
        211.2/151.0
        吲哚-3-乙酸(IAA)
        Indole-3-acetic acid
        + 8.68 176.1/130.1* 94 20
        176.1/103.0
        反式玉米素(tZ)
        Trans-zeatin
        + 3.68 220.2/136.1* 55 23
        220.2/202.0
        玉米素核苷(tZR)
        Trans-zeatin riboside
        + 5.61 352.2/220.1* 52 23
        352.2/202.0
        异戊烯基腺嘌呤(IPR)
        Isopentenyladenosine
        + 7.49 336.2/204.1* 28 23
        336.2/148.0
        吲哚-3-丁酸(IBA)
        Indole-3-butyricacid
        + 10.29 204.1/186.0* 98 17
        204.1/157.9
        N6-异戊烯基腺嘌呤(IP)
        N6-isopentenyladenine
        + 6.94 204.1/136.1* 144 18
        204.1/148.1
        独脚金内酯(SL)
        5-Deoxy-strigol
        + 14.84 331.3/234.0* 39 14
        331.3/217.1
        玉米素(cZ)
        Cis-zeatin
        + 4.34 220.0/136.0* 38 22
        220.0/202.1
        二氢玉米素核苷(DZR)
        Dihydrozeatin riboside
        + 5.60 354.2/222.1* 33 23
        354.2/136.2
        吲哚-3-丙酸(IPA)
        3-Indole propionic acid
        + 9.45 190.1/130.1* 81 19
        190.1/171.9
        吲哚-3-乙酸甲酯(MeIAA)
        Indole-3-acetic acid methyl ester
        + 11.06 190.1/130.0* 43 17
        190.1/103.0
        水杨酸(SA)
        Salicylic acid
        8.37 137.1/93.0* −31 −21
        137.1/45.0
      • 首先取配制好浓度为500 ng/mL的混合标准溶液,依次稀释配制成系列浓度为0.2、0.5、1、5、10、20、50、100 ng/mL的混合标准溶液,采用UPLC-MS/MS进行检测,以植物激素浓度为x轴,所对应的峰面积为y轴,绘制标准曲线,并进行线性回归,得到回归方程和相关系数 (r),以信噪比 (S/N) 为3确定化合物的检出限 (LOD)。结果表明,tZ、SL、cZ、MeIAA、DZ在0.2~100 ng/mL的浓度范围内线性良好,tZR、IPR、IBA、DZR在0.5~100 ng/mL浓度范围内线性良好,ABA、GA3、IAA、IP、IPA在1~100 ng/mL浓度范围内线性良好,SA、ICA、BL在5~100 ng/mL浓度范围内线性良好,JA、MeJA在10~100 ng/mL浓度范围内线性良好,r均大于0.99,LOD介于0.02~1.06 ng/g之间 (表3)。

        表 3  19种植物激素的线性方程、相关系数及检测限

        Table 3.  Linearity, correlation coefficient and detection limits of 19 phytohormones

        植物激素Phytohormone 浓度范围Concentration (ng/mL) 线性方程Calibration equation r 检出限LOD (ng/g)
        ABA 1~100 y = 504.11x + 1358.5 0.9983 0.081
        GA3 1~100 y = 49.749x − 76.76 0.9986 0.675
        JA 10~100 y = 206.63x + 634.72 0.9962 0.529
        IAA 1~100 y = 1260.3x + 802.69 0.9968 0.243
        tZ 0.2~100 y = 4445.8x − 1214.1 0.9973 0.082
        tZR 0.5~100 y = 624.91x + 822.18 0.9980 0.134
        IPR 0.5~100 y = 1525.1x + 1479.2 0.9972 0.138
        IBA 0.5~100 y = 1112.5x + 976.26 0.9969 0.083
        IP 1~100 y = 902.03x − 739.67 0.9967 0.112
        SL 0.2~100 y = 18781x − 19805 0.9979 0.017
        cZ 0.2~100 y = 10570x − 12317 0.9987 0.026
        DZR 0.5~100 y = 1275.7x − 692.89 0.9960 0.072
        IPA 1~100 y = 1146.7x − 421.64 0.9974 0.165
        MeIAA 0.2~100 y = 10415x − 6982.3 0.9987 0.055
        SA 5~100 y = 3977.6x + 82657 0.9974 0.581
        DZ 0.2~100 y = 2604.4x − 199.5 0.9987 0.070
        ICA 5~100 y = 325.93x + 2073.6 0.9967 0.340
        MeJA 10~100 y = 533.57x + 1067.1 0.9986 0.925
        BL 5~100 y = 37.489x − 33.225 0.9970 1.057
      • 为了考察实验方法的重现性以及准确度,分别向玉米根际土壤样品中添加低、中、高3种不同浓度的混合标准溶液,每个添加水平设置5个平行实验,并按照优化后的实验方法进行处理,最后通过计算方法的相对标准偏差(RSD)和加标回收率来衡量其精密度和准确度 (表4),表中未加标浓度为土壤基质样品中含有的植物激素。在3种不同浓度的添加水平下,玉米根际土壤中19种植物激素的回收率介于70.2%~117%之间,精密度介于0.2%~7.3%之间。

        表 4  19种植物激素在土壤中的回收率和相对标准偏差 (n = 5)

        Table 4.  Recovery rate and relative standard deviation of 19 phytohormones in soil

        植物激素
        Phytohormone
        浓度Concentration (ng/mL) 回收率 (%)
        Recovery
        相对标准偏差 (%)
        RSD
        加标Spiked 未加标Non-spiked 检测Detected
        ABA 5.00 0.00 3.83 76.6 5.5
        20.00 0.00 21.26 106 3.1
        50.00 0.00 58.47 117 0.8
        GA3 5.00 0.00 5.79 116 2.0
        20.00 0.00 17.56 87.8 2.1
        50.00 0.00 49.24 98.5 3.9
        SA 20.00 6.56 26.93 102 3.5
        50.00 6.56 61.60 110 2.3
        100.00 6.56 97.52 91 1.7
        IP 5.00 0.00 5.39 108 3.4
        20.00 0.00 20.83 104 5.7
        50.00 0.00 47.26 94.5 3.6
        SL 5.00 1.15 5.43 85.6 1.8
        20.00 1.15 18.06 84.6 1.7
        50.00 1.15 41.19 80.1 0.2
        cZ 5.00 0.00 5.05 101 1.7
        20.00 0.00 18.37 91.8 2.0
        50.00 0.00 43.43 86.9 3.1
        DZR 5.00 0.00 4.66 93.3 1.2
        20.00 0.00 16.69 83.5 1.5
        50.00 0.00 43.54 87.1 1.8
        IPA 5.00 0.00 5.45 109 1.6
        20.00 0.00 19.78 99 2.0
        50.00 0.00 51.06 102 2.4
        MeIAA 5.00 0.91 6.19 106 1.7
        20.00 0.91 21.87 105 5.4
        50.00 0.91 35.99 70.2 3.3
        DZ 5.00 0.00 3.75 75.0 1.1
        20.00 0.00 14.62 73.1 1.2
        50.00 0.00 37.44 74.9 1.3
        ICA 5.00 9.65 15.13 109 1.9
        20.00 9.65 28.40 93.8 6.4
        50.00 9.65 58.85 98.4 3.0
        MeJA 20.00 0.00 17.34 86.7 7.3
        50.00 0.00 48.62 97.2 2.1
        100.00 0.00 71.07 71.1 1.1
        BL 20.00 0.00 17.58 87.9 2.5
        50.00 0.00 48.89 97.8 2.5
        100.00 0.00 95.01 95 4.2
        JA 20.00 0.00 15.68 78.4 3.0
        50.00 0.00 57.21 114 2.4
        100.00 0.00 84.70 84.7 3.6
      • 利用优化后的实验方法对玉米根际土壤植物激素进行测定,对同一份土样设置5个重复,测定结果表明:玉米根际土壤样品中检测出IAA、MeIAA、ICA、SL、SA 5种植物激素,含量分别为1.85 ± 0.05、0.55 ± 0.00、5.79 ± 0.15、0.69 ± 0.00、3.94 ± 0.50 ng/g。

      • 目前,关于植物激素的前处理方法,大多采用有机溶剂过夜浸提,重复浸提2~3次,并用固相微萃取小柱进行纯化,最后上机检测,这些方法前处理耗时长,采用固相微萃取小柱纯化虽然能够净化样品中的部分杂质,但是这种基于除杂的净化方法往往还会产生较大的基质效应[36],而且采用固相萃取小柱纯化不仅需要找到合适的清洗液以及洗脱液,此外活化、平衡、清洗、洗脱过程也很繁琐,损失也大,难以保证多种植物激素的回收率。本文的方法前处理不需要过夜浸提,而且加入二氯甲烷,离心浓缩复溶后不需要通过固相萃取柱即可直接进样分析检测,可以达到理想的分离效果,大大缩短了样品的前处理时间。

        土壤中植物激素的检测方法从化学法[29-30]、酶联免疫法[28, 32]、色谱法[33-35]到色谱质谱联用法[37],测试的灵敏度逐渐变高、专一性逐渐增强、准确度逐渐提高。超高效液相色谱–串联质谱法是近几年发展起来的测定植物激素的新方法[38],它结合了色谱的高分离性能及质谱的高灵敏度特性,大大提高了检测的灵敏度[24],可实现多种植物激素的同时检测。与气相色谱质谱联用相比,UPLC-MS/MS可避免样品分析中繁琐的衍生化过程[39]。与气相色谱及液相色谱法相比,UPLC-MS/MS能减少或消除色谱当前由于工作原理的不同可能存在的定性错误,提高植物激素定性及定量的可靠性[40]。与免疫法相比,UPLC-MS/MS可避免分析过程中抗体产生的交叉反应对结果产生的影响及放射性物质对实验人员身体造成的危害[16]。与化学法相比,UPLC-MS/MS灵敏度更高,选择性更强,能够检测出土壤中存在且浓度更低的植物激素。综上,超高效液相色谱–串联质谱法能为土壤中多种植物激素的同时检测提供一种更为简便、快速、准确的方法。

        本研究建立了土壤中多种植物激素的提取及其超高效液相色谱串联质谱测定法,并测定了土壤中8大类植物激素,最后检测出IAA、ICA、MeIAA、SA、SL 5种植物激素,含量在0.55~5.79 ng/g之间,本方法前处理不需要过夜提取,大大缩短了样品的前处理时间,方法的检测限介于0.02~1.06 ng/g之间,回收率为70.2%~117%,精密度介于0.2%~7.3%之间,该操作简单、灵敏度高、选择性好,适用于土壤中多种植物激素的同时检测。

    参考文献 (40)

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