• ISSN 1008-505X
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间作小麦和接种AM真菌协同提高蚕豆抗枯萎病能力和根际微生物碳代谢活性

董艳 赵骞 吕家兴 董坤

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间作小麦和接种AM真菌协同提高蚕豆抗枯萎病能力和根际微生物碳代谢活性

    作者简介: 董艳E-mail:dongyanyx@163.com;
    通讯作者: 董坤, E-mail:dongkun19722004@aliyun.com
  • 基金项目: 国家自然科学基金项目(31860596,31560586)。

Synergistic effects of intercropping with wheat and inoculation with arbuscular mycorrhizal fungi on improvement of anti-Fusarium wilt and rhizosphere microbial carbon metabolic activity of faba bean

    Corresponding author: DONG Kun, E-mail:dongkun19722004@aliyun.com
  • 摘要: 【目的】接种丛枝菌根 (arbuscular mycorrhizal,AM) 真菌和间作均是防治蚕豆枯萎病的有效方法,从土壤微生物学角度研究两者协同减轻蚕豆枯萎病的机理,对控制蚕豆枯萎病传播具有重要意义。【方法】利用盆栽试验方法,进行了间作和接种AM真菌摩西管柄囊霉 (Funneliformis mosseae,Fm) 和扭形球囊霉 (Glomus tortuosum,Gt) 试验。设蚕豆单作对照 (MF)、蚕豆小麦间作 (IF)、蚕豆单作接种Fm (MFFm)、蚕豆小麦间作接种Fm (IFFm)、蚕豆单作接种Gt (MFGt)、蚕豆小麦间作接种Gt (IFGt) 6个处理。于蚕豆开花期 (生长70天) 取土壤样品,测定蚕豆幼苗生长、枯萎病发生、根际镰刀菌数量和微生物碳代谢活性。【结果】间作显著增加蚕豆幼苗干重93.0%、降低蚕豆枯萎病病情指数71.4%,接菌显著增加蚕豆幼苗干重55.3%、降低病情指数76.6%,其中接种Fm真菌对蚕豆幼苗干重的影响更大,对病情指数的抑制效果更好。间作接菌显著增加蚕豆幼苗干重100%、降低病情指数89.8%。Biolog微平板测试结果显示,间作提高根际微生物碳代谢活性32.3%;接菌提高微生物活性85.4%;间作接菌提高微生物活性122%。主成分分析结果表明,间作和接菌均明显改变了根际微生物的群落结构,并主要改变了对碳水化合物类、氨基酸和羧酸类碳源的利用。相关性分析结果显示,枯萎病发病率和病情指数与根际镰刀菌数量呈极显著正相关关系,与AWCD值、Shannon多样性指数和丰富度指数均呈极显著负相关。【结论】蚕豆与小麦间作和接菌对抑制蚕豆枯萎病和促进蚕豆生长均具有积极效应,间作显著提高了AM真菌的定殖率,二者协同提高了根际微生物活性,改变了微生物群落结构,并抑制了病原菌增殖,进而控制蚕豆枯萎病发生。
  • 图 1  间作和接菌处理蚕豆幼苗、小麦干重

    Figure 1.  Dry weight of faba bean seedlings and wheat under treatments of intercropping and inoculation of AM fungi

    图 2  不同处理下根际微生物碳源利用平均颜色变化率 (AWCD)

    Figure 2.  AWCD of faba bean rhizosphere soil in different treatments

    图 3  不同处理对蚕豆根际微生物利用六类碳源的影响

    Figure 3.  Effect of different treatments on utilization of six types of carbon source

    图 4  不同处理对蚕豆根际微生物群落多样性指数的影响

    Figure 4.  Effects of different treatments on microbial community diversity index of faba bean rhizosphere microbe

    图 5  不同处理条件下根际微生物碳源代谢主成分分析

    Figure 5.  Principal component analysis (PCA) of rhizosphere microbial community carbon source metabolism in different treatments

    表 1  AM真菌蚕豆小麦侵染率 (%)

    Table 1.  AM fungal colonization rate on faba bean and wheat

    处理Treatment 蚕豆Faba bean 小麦Wheat
    MF 0.0 ± 0.0 d
    IF 0.0 ± 0.0 d 0.0 ± 0.0 c
    MFFm 68.28 ± 0.96 b
    IFFm 82.56 ± 2.56 a 40.90 ± 3.93 a
    MFGt 55.71 ± 2.18 c
    IFGt 66.30 ± 1.91 b 30.29 ± 1.98 b
    注(Note):MF—单作接种尖孢镰刀菌 Monocropping and inoculation with FOF; IF—间作接种尖孢镰刀菌 Intercropping and inoculation with FOF; MFFm—单作接种摩西管柄囊霉和尖孢镰刀菌 Monocropping and inoculation with F. mosseae and FOF; IFFm—间作接种摩西管柄囊霉和尖孢镰刀菌 Intercropping and inoculation with F. mosseae and FOF; MFGt—单作接种扭形球囊霉和尖孢镰刀菌 Monocropping and inoculation with G. tortuosum and FOF; IFGt—间作接种扭形球囊霉和尖孢镰刀菌 Intercropping and inoculation with G. tortuosum and FOF; 同列数据后不同字母表示不同处理间在 5% 水平上差异显著 Values followed by different letters in a column indicate significantly different among treatments (P < 0.05).
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    表 2  间作及接种AM真菌处理下蚕豆根际镰刀菌数量、枯萎病发病率和病情指数

    Table 2.  Fusarium oxysporum density in rhizosphere soil incidence and index of faba bean Fusarium wilt under treatments of intercropping and inoculation of AM fungi

    处理
    Treatment
    发病率 (%)
    Disease incidence
    病情指数
    Disease index
    尖孢镰刀菌数量 (× 102 CFU/g)
    F. oxysporum
    MF 83.3 ± 28.9 a 81.7 ± 27.5 a 331.44 ± 16.44 a
    IF 66.7 ± 28.9 ab 23.3 ± 5.8 bc 119.66 ± 27.1 b
    MFFm 25.0 ± 0.0 cd 5.0 ± 0.0 cd 15.95 ± 3.97e
    IFFm 0.0 ± 0.0 d 0.0 ± 0.0 d 4.59 ± 3.97 e
    MFGt 41.7 ± 14.4 bc 33.3 ± 11.6 b 85.17 ± 3.73 c
    IFGt 50.0 ± 0.0 bc 16.7 ± 2.9 bcd 40.82 ± 11.66 d
    注(Note):MF—单作接种尖孢镰刀菌 Monocropping and inoculation with FOF; IF—间作接种尖孢镰刀菌 Intercropping and inoculation with FOF; MFFm—单作接种摩西管柄囊霉和尖孢镰刀菌 Monocropping and inoculation with F. mosseae and FOF; IFFm—间作接种摩西管柄囊霉和尖孢镰刀菌 Intercropping and inoculation with F. mosseae and FOF; MFGt—单作接种扭形球囊霉和尖孢镰刀菌 Monocropping and inoculation with G. tortuosum and FOF; IFGt—间作接种扭形球囊霉和尖孢镰刀菌 Intercropping and inoculation with G. tortuosum and FOF; 同列数据后不同字母表示不同处理间在 5% 水平上差异显著 Values followed by different letters in a column indicate significantly different among treatments(P < 0.05).
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    表 3  31种碳源与PC1、PC2的相关系数

    Table 3.  31 sole-carbon sources substrates with high Pearson’s correlation coefficients for PC1 and PC2 in the PCA of substrate utilization patterns of soil microbial community

    碳源类别Carbon source 底物Substrate 主成分1 PC1 主成分2 PC2
    碳水化合物Carbohydrates β-甲基-D-葡萄糖苷 β-Methyl-D-glucoside –0.642 0.946
    D-半乳糖酸-γ-内酯D-Galactonic acid-γ-lactone 0.989
    D-木糖D-Xylose 0.998*
    i-赤藓糖醇i-Eryhritol
    D-甘露醇D-Mannitol 0.999*
    N-乙酰基-D-葡萄糖胺N-Acetyl-D-glucosamine 0.991*
    D-纤维二糖D-Cellobiose 0.626 –0.952
    葡萄糖-1-磷酸盐Glucose-1-phosphate –0.959
    α-D-乳糖 α-D-Lactose 0.998
    D,L-α-甘油磷酸盐D,L-α-Glycerol phosphate 0.849
    氨基酸Amino acids L-精氨酸L-Arginine 0.631
    L-天冬酰胺酸L-Asparagine 0.652
    L-苯丙氨酸L-Phenylalanine 0.947
    L-丝氨酸L-Serine 0.997*
    L-苏氨酸L-Threonine –0.871
    葡萄糖-L-谷氨酸Glycyl-L-glutamic acid 0.991*
    羧酸类化合物Carboxylic acids 丙酮酸甲酯Pyruvic acid methyl ester 0.860 –0.785
    D-半乳糖醛酸D-Galacturonic acid
    γ-羟基丁酸 γ-Hydroxybutyric acid –0.994*
    D-葡萄糖胺酸D-Glucosaminic acid 0.944
    衣康酸Itaconic acid –0.705 0.915
    α-丁酮酸 α-Ketobutyric acid 0.862 –0.783
    D-苹果酸D-Malic acid 0.977
    聚合物Polymers 聚山梨醇酯40 Tween-40 0.688
    聚山梨醇酯80 Tween-80
    α-环糊精 α-Cyclodextrin –0.626 0.953
    糖原Glycogen –0.763
    胺类化合物Amines /amides 苯基乙胺Phenylethylamine –0.744
    腐胺Putrescine –0.748
    酚酸类化合物Phenolic acids 2-羟基苯甲酸 2-Hydroxy benzoic acid 0.836
    4-羟基苯甲酸 4-Hydroxy benzoic acid 0.755
    注(Note): “–”表示相关系数, –0.6< r <0.6 Means correlation coefficients, –0.6< r <0.6. *— P < 0.05.
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    表 4  蚕豆枯萎病发病率和病情指数与根际镰刀菌数量、微生物碳代谢活性的相关分析

    Table 4.  Correlation coefficients of disease incidence and disease index with rhizosphere microbial C metabolic activity and F. oxysporum density

    项目
    Item
    发病率
    Disease incidence
    病情指数
    Disease index
    镰刀菌数量
    F. oxysporum amount
    0.741** 0.921**
    AWCD –0.869** –0.736**
    Shannon指数
    Shannon index
    –0.741** –0.593**
    丰富度指数
    Richness index
    –0.743** –0.604**
    注(Note):** —P < 0.01.
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出版历程
  • 收稿日期:  2018-10-08
  • 网络出版日期:  2019-10-15
  • 刊出日期:  2019-10-01

间作小麦和接种AM真菌协同提高蚕豆抗枯萎病能力和根际微生物碳代谢活性

    作者简介:董艳E-mail:dongyanyx@163.com
    通讯作者: 董坤, dongkun19722004@aliyun.com
  • 1. 云南农业大学资源与环境学院,昆明 650201
  • 2. 云南农业大学动物科学技术学院,昆明 650201
  • 基金项目: 国家自然科学基金项目(31860596,31560586)。
  • 摘要: 【目的】接种丛枝菌根 (arbuscular mycorrhizal,AM) 真菌和间作均是防治蚕豆枯萎病的有效方法,从土壤微生物学角度研究两者协同减轻蚕豆枯萎病的机理,对控制蚕豆枯萎病传播具有重要意义。【方法】利用盆栽试验方法,进行了间作和接种AM真菌摩西管柄囊霉 (Funneliformis mosseae,Fm) 和扭形球囊霉 (Glomus tortuosum,Gt) 试验。设蚕豆单作对照 (MF)、蚕豆小麦间作 (IF)、蚕豆单作接种Fm (MFFm)、蚕豆小麦间作接种Fm (IFFm)、蚕豆单作接种Gt (MFGt)、蚕豆小麦间作接种Gt (IFGt) 6个处理。于蚕豆开花期 (生长70天) 取土壤样品,测定蚕豆幼苗生长、枯萎病发生、根际镰刀菌数量和微生物碳代谢活性。【结果】间作显著增加蚕豆幼苗干重93.0%、降低蚕豆枯萎病病情指数71.4%,接菌显著增加蚕豆幼苗干重55.3%、降低病情指数76.6%,其中接种Fm真菌对蚕豆幼苗干重的影响更大,对病情指数的抑制效果更好。间作接菌显著增加蚕豆幼苗干重100%、降低病情指数89.8%。Biolog微平板测试结果显示,间作提高根际微生物碳代谢活性32.3%;接菌提高微生物活性85.4%;间作接菌提高微生物活性122%。主成分分析结果表明,间作和接菌均明显改变了根际微生物的群落结构,并主要改变了对碳水化合物类、氨基酸和羧酸类碳源的利用。相关性分析结果显示,枯萎病发病率和病情指数与根际镰刀菌数量呈极显著正相关关系,与AWCD值、Shannon多样性指数和丰富度指数均呈极显著负相关。【结论】蚕豆与小麦间作和接菌对抑制蚕豆枯萎病和促进蚕豆生长均具有积极效应,间作显著提高了AM真菌的定殖率,二者协同提高了根际微生物活性,改变了微生物群落结构,并抑制了病原菌增殖,进而控制蚕豆枯萎病发生。

    English Abstract

    • 随着农业现代化水平的提高,以高投入及高产出、种植品种单一、复种指数高和大量施肥和施药等为特点的集约化种植已成为我国重要的农业生产模式[1]。由于对作物土传病原微生物生长繁殖规律和传播扩散途径的认识不足,随着集约化种植不断推广与发展,作物土传病害在我国呈蔓延趋势[1]。蚕豆 (Vcia faba L.) 是世界温带和亚热带地区一种重要的食用豆类作物,在中国的栽培历史超过2100年[2]。近年来随着蚕豆生产的不断发展,加之种植习惯和环境条件等原因,蚕豆连作现象日益普遍,造成土传枯萎病普遍发生[3]。枯萎病是云南省蚕豆生产上的重要病害,在蚕豆整个生育期都有发生,发生流行时间长,发病规律复杂,一旦发生较难防治,目前已经成为限制蚕豆高产稳产的主要因素之一[4]

      生产上控制土传枯萎病的方法有土壤高温消毒[5]、土壤厌氧消毒[6]、施用生物有机肥[7]、抗性育种和化学农药施用[8]等措施,这些措施均主要是降低土壤中病原菌的数量,可在不同程度上减轻枯萎病,但传统的单一防治方式均有一定的局限性,不能及时有效地改善连作状况[8],而且化学防治还会导致农产品农药残留和环境污染等问题。在土壤生态系统中,有些微生物在抑制土传病原物、促进作物健康生长方面具有重要作用,如丛枝菌根 (arbuscular mycorrhizal,AM) 真菌正是这样的生防菌[9]。AM真菌能够拮抗由真菌、线虫、细菌等病原体引起的土传性植物病害,诱导宿主植物增强对病虫害的耐/抗病性。当前,利用AM真菌开展病虫害的生物防治已经引起生态学家和植物病理学家的广泛关注[10]。例如,接种集球囊霉 (Glomus fasciculatum) 降低了仙客来枯萎病和炭疽病的发病率和病情指数[11],接种聚丛球囊霉 (Glomus aggregatum) 降低了香蕉枯萎病的危害[12]。但这些研究均是在单作条件下开展的,有关间作系统接种AM真菌对土传病害的影响尚不清楚。

      作物根部土壤中微生物群落结构及其组成变化能反映土壤生态现状及变化趋势,对作物健康十分重要[13]。单一作物持续连作条件下,土壤中微生物多样性降低,根际生态平衡被打乱,根际有害微生物在酸性条件下大量繁殖,土壤由“细菌型”转变成“真菌型”,由“健康型”转变成“致病型”,土壤微生物整体代谢活性降低[14]。因此提高根际微生物活性并改善其群落结构有助于提高土壤健康程度,增加对土传病害的抑制能力。接种幼套球囊霉 (Glomus etunicatum) 显著提高西瓜根际微生物数量并降低尖孢镰刀菌和真菌数量,最终降低西瓜枯萎病的发病率和病情指数[15]。土壤微生物多样性和群落结构与地上作物组成密切相关,间作系统中由于种植两种以上的作物 (或品种),不同作物的根系分泌物组成不同,从而引起土壤微生物多样性的变化,已经成为缓解作物连作障碍的有效措施[16]。我们的前期研究表明,小麦与蚕豆间作控制蚕豆枯萎病与根际微生物活性和群落结构变化有关[17-18],但有关该间作系统中接种AM真菌对蚕豆根际微生物代谢功能多样性的影响及其与枯萎病发生的关系尚不清楚。因此,本研究以小麦与蚕豆间作体系为对象,研究蚕豆枯萎病发生、镰刀菌数量和根际微生物代谢功能多样性对接种AM真菌的响应,明确间作及AM真菌协同控制枯萎病的微生物学机制,为土传病害防控提供有效、安全、环境友好的方法。

      • 供试蚕豆品种为89-147(Vicia faba L. cv. 89-147),小麦品种为云麦53(Tricumaestivum L.cv. Yunmai 53),均来自云南省农业科学院。

        供试病原菌尖孢镰刀菌蚕豆专化型 Fusarium oxysporum f. fabae(FOF) 的分离和培养参照董艳等[17]的方法进行分离和培养。

        供试土壤为连作蚕豆11年的土壤,采集于云南省安宁市禄脿镇上村。土壤有机质含量14.7 g/kg、氮1.25 g/kg、碱解氮62.9 mg/kg、速效磷35.2 mg/kg、速效钾 61.3 mg/kg、pH 7.02。供试菌种为 摩西管柄囊霉Funneliformis mossea (BGCGZ01A,记为Fm) 和扭形球囊霉Glomus tortuosum (BGCNM03A,记为Gt),均购自北京市农林科学院植物营养与资源研究所[17]。接种菌根菌剂以玉米和苜蓿为宿主植物进行扩繁,每10 g菌剂含有700个孢子。

      • 试验设2种种植模式和3种AM真菌接种方式,共6个处理 (所有处理均接种FOF),即:1)MF,蚕豆单作 (对照);2) IF,蚕豆与小麦间作;3)MFFm,单作接种Fm;4)IFFm,间作接种Fm;5)MFGt,单作接种Gt;6)IFGt,间作接种Gt。每个处理3次重复,共计18盆。

        土培盆栽试验于2012年10月至2013年2月在云南农业大学温室中进行。将AM真菌和1.8 g灭菌土混合均匀后装入塑料盆中,2种AM真菌的接种量均为54 g,不接菌的处理,接入54 g灭菌的AM菌剂以维持与其他处理间的微生物平衡。为保证蚕豆的正常生长,蚕豆播种前以基肥的形式施入N(尿素) 75 mg/kg、P2O5(普钙) 100 mg/kg、K2O(硫酸钾) 100 mg/kg。

        蚕豆种子用10%的H2O2进行30 min消毒后,用灭菌水冲洗干净后将种子转移到25℃下恒温催芽,蚕豆发芽后播种至塑料盆中,覆盖0.2 kg经高压蒸汽灭菌的土壤。蚕豆单作处理每盆播种蚕豆6株,间作处理每盆播种蚕豆3株、小麦12株,试验为随机排列。生长期间每隔2 天用称重法补充去离子水,水分保持在田间最大持水量的75%左右,光照时间为12 h/d,期间不进行任何农药处理。待蚕豆长至3叶期时,采用伤根法接种,尖孢镰刀菌孢子悬浮液浓度为4 × 105 cfu/mL,接种量为15 mL。

      • 按董艳等[17-18]的5级分类法进行枯萎病调查,每个重复调查3株蚕豆,调查完成后计算发病率和病情指数。

      • 蚕豆播种后70 d进行采样,将采集的根际土壤置于4℃保存,一周内完成镰刀菌数量和微生物代谢功能多样性测定。尖孢镰刀菌计数参照Booth[19]的方法采用PCNB培养基进行培养。土壤微生物代谢功能多样性采用Biolog ECO板 (ECO MicroPlate,美国) 进行测定,具体操作参照董艳等[17-18]方法进行。

      • 土壤微生物碳源代谢活性用平均微孔颜色吸光值 (average well color development,AWCD) 来描述[17-18],计算公式如下:

        式中,Ci为第i种碳源的吸光度值;R为对照孔的吸光度值;31为碳源的数目。

        用Shannon-Wiener多样性指数来描述微生物群落代谢多样性[17-18],计算公式如下:

        式中,Pi为第i孔的相对吸光值与整个微平板的相对吸光值总和的比值。

        群落丰富度指数 (S) 用碳源代谢孔的数目表示[17-18]

        试验所得数据采用SAS 8.0软件进行单因素方差分析、主成分分析和相关分析 (大小采用Pearson指数),差异显著性采用最小显著差异法 (LSD) 进行检验。

      • 不接菌条件下,蚕豆和小麦根系均无AM真菌侵染;单作条件下,接种Fm对蚕豆根系的侵染率比Gt高18.4%;间作条件下,Fm对蚕豆、小麦根系的侵染率比Gt分别高24.5%和30.7%。接种同种AM真菌条件下,间作系统蚕豆根系的AM真菌侵染率均显著高于单作,其中Fm、Gt分别比单作系统高20.9%和19.0% (表1)。

        表 1  AM真菌蚕豆小麦侵染率 (%)

        Table 1.  AM fungal colonization rate on faba bean and wheat

        处理Treatment 蚕豆Faba bean 小麦Wheat
        MF 0.0 ± 0.0 d
        IF 0.0 ± 0.0 d 0.0 ± 0.0 c
        MFFm 68.28 ± 0.96 b
        IFFm 82.56 ± 2.56 a 40.90 ± 3.93 a
        MFGt 55.71 ± 2.18 c
        IFGt 66.30 ± 1.91 b 30.29 ± 1.98 b
        注(Note):MF—单作接种尖孢镰刀菌 Monocropping and inoculation with FOF; IF—间作接种尖孢镰刀菌 Intercropping and inoculation with FOF; MFFm—单作接种摩西管柄囊霉和尖孢镰刀菌 Monocropping and inoculation with F. mosseae and FOF; IFFm—间作接种摩西管柄囊霉和尖孢镰刀菌 Intercropping and inoculation with F. mosseae and FOF; MFGt—单作接种扭形球囊霉和尖孢镰刀菌 Monocropping and inoculation with G. tortuosum and FOF; IFGt—间作接种扭形球囊霉和尖孢镰刀菌 Intercropping and inoculation with G. tortuosum and FOF; 同列数据后不同字母表示不同处理间在 5% 水平上差异显著 Values followed by different letters in a column indicate significantly different among treatments (P < 0.05).
      • 与不接菌的单作处理 (MF) 相比,间作 (IF) 和接菌 (MFFm、MFGt) 均显著降低了蚕豆根际的镰刀菌数量,其中IF处理显著降低63.9%,而MFFm和MFGt处理显著降低95.2%和74.3%。与间作蚕豆 (IF) 相比,接菌 (IFFm、IFGt) 的蚕豆根际镰刀菌数量显著降低96.2%和65.9%,以IFFm处理的效果最好。接菌条件下,间作处理 (IFFm、IFGt) 蚕豆根际镰刀菌数量均低于相应的单作处理 (MFFm、MFGt) (表2)。

        表 2  间作及接种AM真菌处理下蚕豆根际镰刀菌数量、枯萎病发病率和病情指数

        Table 2.  Fusarium oxysporum density in rhizosphere soil incidence and index of faba bean Fusarium wilt under treatments of intercropping and inoculation of AM fungi

        处理
        Treatment
        发病率 (%)
        Disease incidence
        病情指数
        Disease index
        尖孢镰刀菌数量 (× 102 CFU/g)
        F. oxysporum
        MF 83.3 ± 28.9 a 81.7 ± 27.5 a 331.44 ± 16.44 a
        IF 66.7 ± 28.9 ab 23.3 ± 5.8 bc 119.66 ± 27.1 b
        MFFm 25.0 ± 0.0 cd 5.0 ± 0.0 cd 15.95 ± 3.97e
        IFFm 0.0 ± 0.0 d 0.0 ± 0.0 d 4.59 ± 3.97 e
        MFGt 41.7 ± 14.4 bc 33.3 ± 11.6 b 85.17 ± 3.73 c
        IFGt 50.0 ± 0.0 bc 16.7 ± 2.9 bcd 40.82 ± 11.66 d
        注(Note):MF—单作接种尖孢镰刀菌 Monocropping and inoculation with FOF; IF—间作接种尖孢镰刀菌 Intercropping and inoculation with FOF; MFFm—单作接种摩西管柄囊霉和尖孢镰刀菌 Monocropping and inoculation with F. mosseae and FOF; IFFm—间作接种摩西管柄囊霉和尖孢镰刀菌 Intercropping and inoculation with F. mosseae and FOF; MFGt—单作接种扭形球囊霉和尖孢镰刀菌 Monocropping and inoculation with G. tortuosum and FOF; IFGt—间作接种扭形球囊霉和尖孢镰刀菌 Intercropping and inoculation with G. tortuosum and FOF; 同列数据后不同字母表示不同处理间在 5% 水平上差异显著 Values followed by different letters in a column indicate significantly different among treatments(P < 0.05).

        与单作 (MF) 相比,间作 (IF) 降低蚕豆枯萎病的发病率和病情指数20.0%和71.4%;接种Fm、Gt显著降低发病率70.0%和50.0%,显著降低病情指数93.9%和59.2%。表明小麦与蚕豆间作和接种菌根均抑制了蚕豆枯萎病的发生与发展,尤其以接种Fm真菌的效果最好 (表2)。与MF处理相比,间作接菌处理 (IFFm、IFGt) 的蚕豆枯萎病发病率降低100%和40.0%;病情指数降低100%和79.6%。表明小麦与蚕豆间作接菌具有协同降低蚕豆枯萎病的作用,以间作接种Fm的效果最好 (表2)。

      • 图1所示,与单作相比,间作分别显著提高蚕豆地下部和地上部干重100%和83.7%;接种Fm真菌显著提高蚕豆地下部和地上部干重90.6%和44.3%,接种Gt真菌显著提高蚕豆地下部和地上部干重68.3%和25.3%。表明间作和接种AM真菌均促进了蚕豆的生长。

        图  1  间作和接菌处理蚕豆幼苗、小麦干重

        Figure 1.  Dry weight of faba bean seedlings and wheat under treatments of intercropping and inoculation of AM fungi

        与MF相比,间作接菌处理 (IFFm、IFGt) 显著增加蚕豆幼苗地下部干重155%和109%,显著增加地上部干重72.0%和58.0%。IFFm、IFGt分别提高小麦地上部干重77.5%和64.5%,但降低地下部干重48.2%和54.4%。表明间作配合接种AM真菌显著促进蚕豆幼苗地上部和地下部的生长,其中以接种Fm条件下蚕豆幼苗地上部和地下部干重最大,但对于小麦的效应存在差异,接种Fm和Gt真菌促进地上部生长,但使小麦地下部生长受阻。

      • 图2所示,各处理的AWCD值随培养时间延长而上升,尤其是培养48 h后急剧增加。培养72 h时,与MF相比,间作接菌处理 (IFFm和IFGt) 的AWCD提高111.0%和133.0%。

        图  2  不同处理下根际微生物碳源利用平均颜色变化率 (AWCD)

        Figure 2.  AWCD of faba bean rhizosphere soil in different treatments

      • 从Biolog-ECO板的代谢指纹图谱来看 (图3),蚕豆根际微生物利用6类碳源的能力依次为碳水化合物 (CH) > 氨基酸类 (AA)、羧酸类 (CA) > 聚合物 (PM) > 胺类 (AM) > 酚酸类 (PA)。6类碳源对AM真菌均响应敏感。与MF相比,接种Fm真菌处理 (MFFm) 使根际微生物对CH、AA、CA、PM、AM、PA类碳源的利用显著提高73.2%、130%、27.5%、86.9%、728%和48.9%;接种Gt真菌处理 (MFGt) 使根际微生物对CH、AA、CA、PM类碳源利用显著提高68.7%、114%、80.2%和130%。表明接种AM真菌处理 (MFFm、MFGt) 显著提高了根际微生物对碳源的利用,其中以接种Fm真菌条件下效果较好 (图3)。

        图  3  不同处理对蚕豆根际微生物利用六类碳源的影响

        Figure 3.  Effect of different treatments on utilization of six types of carbon source

        与MF相比,IFFm处理使根际微生物对CH、AA、CA、PM、AM、PA类碳源的利用显著提高63.6%、164%、51.8%、118%、1322%和125%;IFGt处理使根际微生物对CH、AA、CA、PM、AM、PA类碳源显著提高112%、154%、68.5%、76.7%、816%和136%。表明间作条件下配合接种AM真菌能显著提高蚕豆根际微生物对Biolog ECO板中六类碳源的利用。

      • 与MF相比,IF处理显著提高微生物香农多样性指数 (H) 4.3%,接种Fm和Gt真菌使H分别显著提高7.6%和4.4%;间作接菌 (IFFm和IFGt) 使H显著提高10.5%和10.5% (图4)。与MF相比,IF处理显著提高微生物丰富度指数 (S)20.6%;接种Fm和Gt真菌使蚕豆根际微生物的丰富度指数 (S) 显著提高23.8%和20.6%;间作接菌 (IFFm和IFGt) 显著提高S指数36.5%和41.3%。表明小麦与蚕豆间作并接种AM真菌均能显著提高微生物的HS

        图  4  不同处理对蚕豆根际微生物群落多样性指数的影响

        Figure 4.  Effects of different treatments on microbial community diversity index of faba bean rhizosphere microbe

      • 蚕豆单间作处理间根际微生物群落结构在PC1上有较大分离。MFFm和MFGt处理与MF处理在PC1上有较好的分离,表明接菌明显改变了蚕豆根际微生物的群落结构,以接种Fm处理对微生物群落结构的影响大于接种Gt处理。间作接菌处理 (IFFm和IFGt) 与不接菌处理 (IF) 在PC1和PC2上均有明显的分离,表明间作条件下接种菌根能明显改变蚕豆根际微生物的群落结构 (图5)。

        图  5  不同处理条件下根际微生物碳源代谢主成分分析

        Figure 5.  Principal component analysis (PCA) of rhizosphere microbial community carbon source metabolism in different treatments

        表3可看出,在PC1上相关系数较高的碳源有18种,其中碳水化合物类6种,氨基酸类2种、羧酸类5种、聚合物类3种、胺类1种和酚酸类1种。表明不接菌条件下的单间作处理 (MF与IF)、单作条件下不接菌和接菌处理 (即MF与MFFm、MFGt)、间作条件下接菌处理 (IFFm和IFGt) 与不接菌处理 (IF) 间微生物群落结构的差异是由根际微生物利用以下碳源:碳水化合物类 (β-甲基-D-葡萄糖苷、D-半乳糖酸-γ-内酯、D-甘露醇、D-纤维二糖、葡萄糖-1-磷酸盐和α-D-乳糖)、氨基酸类 (L-精氨酸和L-苯丙氨酸)、羧酸类 (丙酮酸甲酯、γ-羟基丁酸、衣康酸、α-丁酮酸和D-苹果酸)、聚合物类 (聚山梨醇酯40和α-环糊精)、胺类 (腐胺) 和酚酸类 (4-羟基苯甲酸) 的差异导致的,反映出碳水化合物类和羧酸类碳源是导致以上处理间微生物群落结构变化的敏感碳源。

        表 3  31种碳源与PC1、PC2的相关系数

        Table 3.  31 sole-carbon sources substrates with high Pearson’s correlation coefficients for PC1 and PC2 in the PCA of substrate utilization patterns of soil microbial community

        碳源类别Carbon source 底物Substrate 主成分1 PC1 主成分2 PC2
        碳水化合物Carbohydrates β-甲基-D-葡萄糖苷 β-Methyl-D-glucoside –0.642 0.946
        D-半乳糖酸-γ-内酯D-Galactonic acid-γ-lactone 0.989
        D-木糖D-Xylose 0.998*
        i-赤藓糖醇i-Eryhritol
        D-甘露醇D-Mannitol 0.999*
        N-乙酰基-D-葡萄糖胺N-Acetyl-D-glucosamine 0.991*
        D-纤维二糖D-Cellobiose 0.626 –0.952
        葡萄糖-1-磷酸盐Glucose-1-phosphate –0.959
        α-D-乳糖 α-D-Lactose 0.998
        D,L-α-甘油磷酸盐D,L-α-Glycerol phosphate 0.849
        氨基酸Amino acids L-精氨酸L-Arginine 0.631
        L-天冬酰胺酸L-Asparagine 0.652
        L-苯丙氨酸L-Phenylalanine 0.947
        L-丝氨酸L-Serine 0.997*
        L-苏氨酸L-Threonine –0.871
        葡萄糖-L-谷氨酸Glycyl-L-glutamic acid 0.991*
        羧酸类化合物Carboxylic acids 丙酮酸甲酯Pyruvic acid methyl ester 0.860 –0.785
        D-半乳糖醛酸D-Galacturonic acid
        γ-羟基丁酸 γ-Hydroxybutyric acid –0.994*
        D-葡萄糖胺酸D-Glucosaminic acid 0.944
        衣康酸Itaconic acid –0.705 0.915
        α-丁酮酸 α-Ketobutyric acid 0.862 –0.783
        D-苹果酸D-Malic acid 0.977
        聚合物Polymers 聚山梨醇酯40 Tween-40 0.688
        聚山梨醇酯80 Tween-80
        α-环糊精 α-Cyclodextrin –0.626 0.953
        糖原Glycogen –0.763
        胺类化合物Amines /amides 苯基乙胺Phenylethylamine –0.744
        腐胺Putrescine –0.748
        酚酸类化合物Phenolic acids 2-羟基苯甲酸 2-Hydroxy benzoic acid 0.836
        4-羟基苯甲酸 4-Hydroxy benzoic acid 0.755
        注(Note): “–”表示相关系数, –0.6< r <0.6 Means correlation coefficients, –0.6< r <0.6. *— P < 0.05.

        在PC2上相关系数较高的碳源有16种,其中碳水化合物类5种、氨基酸4种、羧酸类碳源4种、聚合物1种、胺类化合物1种和酚酸类1种。单作条件下MFFm和Gt处理间、MF与IFFm和IFGt处理间微生物群落结构的差异是由根际微生物对以下碳源:糖类 (D,L-α-甘油磷酸盐、D-木糖、N-乙酰基-D-葡萄糖胺、D-纤维二糖、β-甲基-D-葡萄糖苷)、氨基酸类 (葡萄糖-L-谷氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸和L-天冬酰胺酸)、羧酸类 (丙酮酸甲酯、D-葡萄糖胺酸、衣康酸和α-丁酮酸)、聚合物类 (α-环糊精)、胺类 (苯基乙胺) 和酚酸类 (2-羟基苯甲酸) 的利用差异导致的。表明碳水化合物、氨基酸和羧酸类碳源是导致单作条件下Fm和Gt处理间及MF与IFFm和IFGt处理间微生物群落结构差异的敏感碳源。

      • 为明确蚕豆根际微生物碳代谢活性与蚕豆枯萎病发生的关系,将蚕豆根际土壤中尖孢镰刀菌数量、微生物平均颜色变化率、Shannon多样性指数和丰富度指数与枯萎病发病率和病情指数进行相关分析。结果表明,蚕豆枯萎病的发病率与病情指数与根际镰刀菌数量呈极显著正相关,与根际微生物平均颜色变化率、Shannon多样性指数和丰富度指数均呈极显著负相关关系 (表4)。说明蚕豆枯萎病发生及严重程度与根际土壤微生物活性和多样性密切相关,即蚕豆根际微生物碳代谢活性越低,根际镰刀菌数量越多,枯萎病发生越严重。

        表 4  蚕豆枯萎病发病率和病情指数与根际镰刀菌数量、微生物碳代谢活性的相关分析

        Table 4.  Correlation coefficients of disease incidence and disease index with rhizosphere microbial C metabolic activity and F. oxysporum density

        项目
        Item
        发病率
        Disease incidence
        病情指数
        Disease index
        镰刀菌数量
        F. oxysporum amount
        0.741** 0.921**
        AWCD –0.869** –0.736**
        Shannon指数
        Shannon index
        –0.741** –0.593**
        丰富度指数
        Richness index
        –0.743** –0.604**
        注(Note):** —P < 0.01.
      • 近年来我国农作物的土传病害日趋严重,对农作物产量和品质造成严重影响,已成为限制我国农业可持续发展的重要瓶颈[20]。接种摩西管柄囊霉 (F. mosseae) 的西瓜植株枯萎病病情指数降低89.3%[21]。番茄//韭葱和番茄//紫苏系统中,接菌比不接菌处理显著降低番茄枯萎病病指70%和63%[22]。本研究中,与蚕豆单作不接菌处理 (MF) 相比,间作接菌处理 (IFFm、IFGt) 的蚕豆枯萎病发病率降低100%和40.0%;病情指数降低100.0%和79.6% (表2),表明间作接菌是控制蚕豆枯萎病的有效措施,尤其在间作条件下配合接种Fm真菌对蚕豆枯萎病的控制效果最好。旱作水稻与西瓜间作系统接菌对西瓜枯萎病的研究中也观察到相似的结果,即与不接菌的处理相比,接种幼套球囊霉 (Glomus etunicatum) 和根内球囊霉 (Glomus intraradices) 处理的西瓜枯萎病发病率和病情指数明显降低,防治效果分别为40.8%和29.7%[15]

      • 研究表明,连作导致土壤细菌种群数量下降,真菌种群数量上升,细菌与真菌数量比 (B/F) 大幅度降低,微生物代谢类群多样性逐渐下降,土壤微生态平衡和健康受到威胁[23]。因此,研究具有改善土壤生态环境及克服连作土壤中微生物群落失衡引起的连作障碍的防治措施尤为重要。AM真菌对根际微生物区系、多样性和群落结构的影响是AM真菌抑制土传病害的重要机制之一[24]。本研究结果表明,接种Fm和Gt真菌的蚕豆根际微生物活性 (AWCD值) 显著提高,最终降低了蚕豆枯萎病发病率和病情指数,同时促进了蚕豆和小麦的生长。相关分析显示,蚕豆枯萎病发病率和病情指数与根际微生物碳代谢活性和多样性具有极显著负相关关系,原因可能是AM真菌与作物建立共生关系后,真菌菌丝的发育能够促使植物分泌可以吸引土壤微生物的物质,将其释放到根际环境中,土壤微生物利用这些渗出物作为基质,增加其活性和多样性[25]

        在中国古代,人们就开始考虑利用间作种植提高土壤肥力,避免病害。最近的研究表明,合理间作种植能显著增加根际微生物的活性与多样性,抑制土传病害发生[26]。本研究中间作蚕豆根际微生物活性高于单作蚕豆 (图2),原因是间作系统中由于地上部作物种类多样性增加,凋落物的不断积累,供给微生物利用的碳源种类和数量逐渐增加,同时也增加了根系分泌物的分泌速率,进而提高了微生物活性,明显改变了微生物群落结构[27]。马琨等[28]对蚕豆与马铃薯间作系统的研究表明,间作马铃薯根际微生物的平均颜色变化率 (AWCD值) 比对照 (单作马铃薯) 提高36.8%;间作并接种AM真菌 (G. etunicatum)后,马铃薯根际微生物平均颜色变化率比单作提高48.96%,同时提高马铃薯根际微生物群落功能多样性,增强了以羧酸类、多聚化合物、芳香类化合物、氨基酸类化合物为碳源的微生物类群代谢活性。本研究中,间作接菌 (IFFm和IFGt) 条件下蚕豆根际微生物活性最高 (图2),原因可能是间作条件下接种AM真菌,其定殖能力比单作系统更强,间作系统AM真菌通过其在土壤中增殖而增加作物根系分泌物的种类和数量,最终增加根际微生物的活性并改善微生物群落结构失调的状况。如在番茄与黄瓜间作系统接种G. mosseae真菌时,番茄根系分泌糖的量显著高于未接种AMF的处理[29]

        小麦与蚕豆间作系统接种AM真菌降低蚕豆枯萎病发生可能与根际微生物的“竞争效应”有关,如AM真菌与蚕豆共生后,其菌丝会迅速占据相应的生态位,生态位竞争主要包括侵染位点和营养能源两个方面[9, 30]。从侵染位点来看,AM真菌侵染宿主根系形成菌根后,其菌丝会迅速占据相应的生态位点,从而减少病原物的侵染位点并降低其数量[9, 30]。从营养能源来看,AM真菌和病原物的生长都依赖宿主植物提供能量和营养,当来自蚕豆根系的光合产物首先被AM真菌利用时,镰刀菌获取的机会无疑会减少,从而限制镰刀菌的生长和繁殖[9]。此外小麦//蚕豆并接种AM真菌增加根际微生物活性可能对蚕豆连作自毒物质的降解具有重要的贡献,可在一定程度上减轻自毒物质对枯萎病菌的刺激而抑制镰刀菌对蚕豆的侵染。表明间作系统接种AM真菌通过改善微生物群落结构,提高微生物活性和多样性而在蚕豆枯萎病控制中发挥着重要作用。

        小麦与蚕豆间作系统接种AM真菌减轻蚕豆枯萎病的危害还可能与小麦与蚕豆间形成菌丝桥有关,由于菌丝桥形成而促进小麦根系分泌物向蚕豆根际、根表和根内运输,进一步抑制蚕豆专化型尖孢镰刀菌在蚕豆根际的生长和繁殖,从而减轻了蚕豆枯萎病的危害[31]。在旱作水稻与西瓜间作体系接种AM真菌也观察到水稻与西瓜间形成菌丝桥而抑制西瓜枯萎病的危害[21]

        接种AM真菌对土传病害的防效与AM真菌种类有关,西瓜单作条件下接种幼套球囊霉 (G. etunicatum) 对西瓜根际的西瓜专化型尖孢镰刀菌有显著的抑制作用,可有效减轻西瓜枯萎病的发生,但接种根内球囊霉 (G. intraradices) 对根际镰刀菌、西瓜枯萎病的发病率和病情指数均无显著影响[15]。本研究中,单作条件下接种Fm和Gt真菌对枯萎病的控制效果不同,以接种Fm真菌的效果较好,接种Fm真菌后蚕豆根际微生物对碳水化合物类、氨基酸类、胺类和酚酸类碳源的利用强度显著高于Gt真菌处理,暗示了接种不同的AM真菌改变了寄主作物根系分泌物的组分和含量而造成对根际微生物群落结构的影响不同,最终影响对病原真菌的抑制效果。小麦与蚕豆间作条件下接种AM真菌提高了蚕豆根际微生物对碳水化合物类、氨基酸类和羧酸类碳源的利用,改变根际微生物群落结构可能是间作协同AM真菌减轻蚕豆枯萎病危害的重要机制之一。在间作系统中,AM真菌既能与病原物直接发生竞争关系,又能通过宿主间接发挥抗病作用,且与间作抑病有一定的叠加效应。目前有关AM真菌在间作系统抑病过程中所发挥作用的认识十分匮乏,亟待开展系统研究[9]

    参考文献 (31)

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