• ISSN 1008-505X
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不同土壤玉米根际挥发性有机物组成和微生物群落特征

李艳玲 宋阿琳 卢玉秋 王恩召 唐治喜 刘雄舵 范分良

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不同土壤玉米根际挥发性有机物组成和微生物群落特征

    作者简介: 李艳玲 E-mail:liyanling_2015@163.com;
    通讯作者: 范分良, E-mail:fanfenliang@caas.cn
  • 基金项目: 国家重点研发计划项目(2016YFD0200109,2016YFD0800707);国家自然科学基金(41571297);中国农业科学院农业资源与农业区划研究所应急性项目(1610132018108,1610132018107)。

Volatile organic compound compositions and microbial community properties in maize rhizosphere among different soils

    Corresponding author: FAN Fen-liang, E-mail:fanfenliang@caas.cn
  • 摘要: 【目的】土壤理化性质和微生物群落的差异显著影响玉米根际挥发性有机物 (volatile organic compounds,VOCs) 的产生和释放。对根际VOCs的深入研究有望为充分挖掘根际生物学潜力和根际调控做出积极贡献。【方法】采集山东德州、河北涞水、河北保定、江西南昌、河南孟津、河南商丘等6个地区的旱地耕层土壤进行为期两个月的玉米盆栽试验,利用顶空固相微萃取联合气相色谱–质谱联用检测技术对根际土壤挥发性有机物进行了分析鉴定,利用实时荧光定量PCR技术对根际细菌和真菌进行了定量分析,利用高通量测序技术对根际细菌16S和真菌ITS进行了测序。【结果】从6个旱地土壤中共检测出44种VOCs,主要是烷烃、烯烃、酯类、胺类、有机酸和芳香类化合物,其中多种化合物与植物或微生物的生长代谢密切相关。胺类化合物N-Benzyl-N-ethyl-p-isopropylbenzamide和D-2-Bromolysergic acid diethylamide在6个土壤中均被检出,占总量的54.2%;其次检出最多的是烷烃和烯烃,占总量的31.1%和7.6%。江西南昌土壤释放的VOCs在数量和丰富度上均显著高于其他土壤,且大部分为烷烃和烯烃类化合物;从河北保定土壤中检出了6种特有的有机酸和酯类化合物。供试6种土壤中,河南商丘和河北保定的细菌数量显著高于其他四个地方。南昌土壤真菌数量显著较高,但其细菌数量、丰富度和多样性均显著低于其他土壤。6种土壤中的主要细菌依次为Thaumarchaeota(奇古菌门)、Actinobacteria(放线菌门)、Proteobacteria(变形菌门)、Chloroflexi(绿弯菌门)、Acidobacteria(酸杆菌门)、Firmicutes(厚壁菌门) 和 Unclassified(未分类门),占总细菌群落的92.1%;主要真菌依次为Ascomycota(子囊菌门)、Basidiomycota(担子菌门) 和 Chytridiomycota(壶菌门),占总真菌群落的98.3%。绿弯菌门仅在南昌土壤中占绝对优势,而南昌土壤中奇古菌门和变形菌门的相对丰度显著比其他地区少;子囊菌门在6种土壤中均为绝对优势真菌门。玉米根际释放的VOCs数量和丰富度与pH、硝态氮、细菌多样性和真菌多样性呈显著负相关 (P < 0.05),与铵态氮和真菌数量呈极显著正相关 (P < 0.01);与主要细菌门中的奇古菌门、变形菌门和酸杆菌门呈显著负相关 (P < 0.05),与绿弯菌门呈极显著正相关 (P < 0.01),但是与主要真菌门相关性不显著。【结论】理化性质不同的玉米根际土壤中,微生物群落结构与组成存在显著差异。pH是影响微生物生长的重要因素,酸性土壤中的真菌数量显著高于中性土壤,但是其细菌数量、微生物群落丰富度和多样性均显著小于中性土壤。VOCs的产生和释放受土壤、微生物和植物等众多因素的影响,土壤有机质含量越高、透气性越好、微生物数量越多时,释放的VOCs越丰富。
  • 图 1  不同采样点玉米根际土壤释放的VOCs数量与组成

    Figure 1.  Quantity and composition of VOCs emitted from different maize rhizosphere soils

    图 2  不同采样点玉米根际土壤细菌 (A) 和真菌 (B) 群落组成

    Figure 2.  Community composition of bacteria (A) and fungi (B) in different maize rhizosphere soils

    图 3  不同采样点玉米根际土壤细菌 (A) 和真菌群落 (B) 的主坐标分析

    Figure 3.  Principal coordinate analysis of bacterial (A) and fungi communities (B) in different maize rhizosphere soils

    表 1  供试土壤基本理化性质

    Table 1.  Basic physicochemical properties of the tested soils

    指标
    Parameter
    山东德州
    Dezhou, Shandong
    河北涞水
    Laishui, Hebei
    河南孟津
    Mengjin, Henan
    江西南昌
    Nanchang, Jiangxi
    河南商丘
    Shangqiu, Henan
    河北保定
    Baoding, Hebei
    pH7.09 ± 0.037.07 ± 0.057.14 ± 0.014.42 ± 0.007.08 ± 0.066.75 ± 0.04
    有机质 OM (g/kg)23.67 ± 1.0514.92 ± 0.4120.07 ± 0.3113.70 ± 0.9319.98 ± 0.2830.54 ± 0.81
    全氮 Total N (g/kg)1.26 ± 0.010.86 ± 0.021.10 ± 0.000.65 ± 0.001.20 ± 0.011.18 ± 0.02
    硝态氮 NO3-N (mg/kg)52.48 ± 0.5320.04 ± 0.6437.08 ± 0.524.23 ± 0.0925.85 ± 1.8323.77 ± 0.20
    速效磷 Available P (mg/kg)39.64 ± 0.9717.25 ± 0.7110.23 ± 0.813.06 ± 0.0931.74 ± 0.4451.65 ± 0.89
    速效钾 Available K (mg/kg)211.00 ± 0.0097.17 ± 1.53147.81 ± 8.1767.52 ± 3.53187.46 ± 1.7676.85 ± 0.67
    黏粒含量 (< 0.002 mm, %)
    Clay content
    6.56 ± 0.043.05 ± 0.024.32 ± 0.125.20 ± 0.212.96 ± 0.021.48 ± 0.00
    粉粒含量 (0.002~0.05 mm, %)
    Silt content
    51.06 ± 0.1351.87 ± 0.0853.62 ± 0.3330.27 ± 0.7256.14 ± 0.1024.33 ± 0.40
    砂粒含量 (0.05~2 mm, %)
    Sand content
    42.38 ± 0.1645.08 ± 0.0942.06 ± 0.3464.53 ± 0.9340.90 ± 0.1174.19 ± 0.40
    面积平均粒径 (μm)
    Surface mean diameter
    8.87 ± 0.0414.59 ± 0.0711.91 ± 0.1911.84 ± 0.4214.73 ± 0.0627.66 ± 0.07
    体积平均粒径 (μm)
    Volume median diameter
    58.13 ± 0.2056.28 ± 0.1360.00 ± 0.4084.11 ± 1.0658.02 ± 0.1190.97 ± 1.09
    体积比表面积 (m2/cm3)
    Surface density
    0.67 ± 0.000.41 ± 0.000.51 ± 0.010.51 ± 0.020.41 ± 0.000.22 ± 0.00
    质量比表面积 (cm2/g)
    Mass specific surface area
    1949 ± 8.721184 ± 5.391452 ± 24.21463 ± 50.61173 ± 4.69625 ± 1.55
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    表 2  玉米根际土壤化学性质

    Table 2.  Chemical properties of maize rhizosphere soils

    采样点
    Sampling point
    pH铵态氮 (mg/kg)
    NH4+-N
    硝态氮 (mg/kg)
    NO3-N
    速效磷 (mg/kg)
    Available P
    速效钾 (mg/kg)
    Available K
    山东德州Dezhou, Shandong7.01 ± 0.04 a1.00 ± 0.05 b198.88 ± 9.21 a47.62 ± 1.09 b181.85 ± 2.10 a
    河北涞水Laishui, Hebei6.44 ± 0.05 c1.31 ± 0.14 b93.96 ± 13.09 c18.41 ± 0.63 f124.68 ± 1.85 b
    河南孟津Mengjin, Henan6.74 ± 0.07 b1.62 ± 0.20 b201.23 ± 7.00 a24.91 ± 0.78 e122.68 ± 1.85 bc
    江西南昌Nanchang, Jiangxi4.13 ± 0.05 d59.61 ± 1.83 a0.61 ± 0.21 d30.87 ± 2.12 d115.88 ± 3.16 c
    河南商丘Shangqiu, Henan6.94 ± 0.02 a0.92 ± 0.04 b147.17 ± 21.56 b40.01 ± 3.65 c106.29 ± 4.44 d
    河北保定Baoding, Hebei6.50 ± 0.04 c1.06 ± 0.20 b98.23 ± 8.27 c64.70 ± 0.54 a64.71 ± 1.02 e
    注(Note):同列数据后不同小写字母表示处理间差异达到显著水平 (P < 0.05) Data followed by different letters in the same column mean significant differences between the treatments (P < 0.05).
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    表 3  玉米根际土壤释放的挥发性有机物

    Table 3.  Volatile organic compounds released from maize rhizosphere soils

    编号No.保留时间 Retention (min)化合物名称Compound nameCAS登录号CAS number
    1 3.4623-Pentanone, 2,4-dimethyl-000565-80-0
    2 5.403Oxime-, methoxy-phenyl-1000222-86-6
    3 6.159Octane, 2-bromo-000557-35-7
    4 6.944Phenol, 4-butyl-001638-22-8
    5 6.982Heptane, 2,2,4,6,6-pentamethyl-013475-82-6
    6 7.5842-Methyl-2-bornene072540-93-3
    7 7.714Heptanoic acid, 3,5,5-triethyl-1000160-77-1
    8 7.883Propane, 1-(1,1-dimethylethoxy)-2-methyl-033021-02-2
    9 8.018Heptane, 2,2,3,3,5,6,6-heptamethyl-007225-67-4
    10 8.167Heptadecane, 8-methyl-013287-23-5
    11 8.3021-Hexene, 4,4-diethyl-1000160-42-0
    12 8.485Sulfurous acid, 2-ethylhexyl nonyl ester1000309-19-2
    13 8.668Propanoic acid, phenyl ester000637-27-4
    14 8.8172,2-Dimethyl-3-heptene trans019550-75-5
    15 8.904Undecane, 5-methyl-001632-70-8
    16 8.937Ether, 6-methylheptyl vinyl010573-35-0
    17 8.986Oxalic acid, 2-ethylhexyl isohexyl ester1000309-38-8
    18 9.063Hexane, 3,3,4-trimethyl-016747-31-2
    19 9.217Dodecane, 2,6,10-trimethyl-003891-98-3
    20 9.337Hexacosane000630-01-3
    21 9.409Octane, 1,1'-oxybis-000629-82-3
    22 9.515Sulfurous acid, 2-ethylhexyl heptadecyl ester1000309-20-0
    2310.0591-Hexene, 2,4,4-triethyl-1000156-96-5
    2410.4212-Pentene, 4,4-dimethyl-026232-98-4
    2510.8544-Nonene, 5-butyl-007367-38-6
    2610.916(Z)-3-Hexene, 2,2,5,5-tetramethyl-000692-47-7
    2710.979Cyclohexane, 1,2,3-trimethyl-001678-97-3
    2811.278Tetradecane000629-59-4
    2911.3744,4-Dimethyl-1-hexene001647-08-1
    3011.432Pentane, 3,3-diethyl-001067-20-5
    3112.9152,4,4-Trimethyl-1-hexene051174-12-0
    3213.098Sulfurous acid, dodecyl 2-ethylhexyl ester1000309-19-5
    3313.401Tridecane, 3-methyl-006418-41-3
    3415.809(2S,4R)-p-Mentha-[1(7),8]-diene 2-hydroperoxide1000292-74-4
    3515.992N-Benzyl-N-ethyl-p-isopropylbenzamide015089-22-2
    3616.3911,3-Cyclopentadiene, 1,2,3,4,5-pentamethyl-004045-44-7
    3716.517Guaia-1(10),11-diene1000374-19-7
    3818.452D-2-Bromolysergic acid diethylamide000478-84-2
    3918.631Morpholine, 4-octadecyl-016528-77-1
    4021.183Undecanoic acid isopropyl ester, 10-hydroxy-11-morpholin-4-yl-1000303-32-4
    4121.804Palmitoleic acid000373-49-9
    4222.011n-Hexadecanoic acid000057-10-3
    4322.988(Z)-9-Octadecenamide000301-02-0
    4424.871Supraene007683-64-9
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    表 4  玉米根际土壤细菌和真菌数量及其多样性

    Table 4.  Quantity and diversity of bacteria and fungi in maize rhizosphere soils

    采样点
    Sampling point
    微生物数量 (copies/g, soil)
    Number of microorganisms
    丰富度
    Richness
    香农–威尔指数
    Shannon–Wiener index
    辛普森指数
    Simpson index
    Chao1指数
    Chao1 index
    细菌 (× 109)
    Bacteria
    真菌 (× 107)
    Fungus
    细菌
    Bacteria
    真菌
    Fungi
    细菌
    Bacteria
    真菌
    Fungi
    细菌
    Bacteria
    真菌
    Fungi
    细菌
    Bacteria
    真菌
    Fungi
    山东德州
    Dezhou, Shandong
    3.51 ± 0.48 b0.13 ± 0.03 b4726 ± 144 ab127 ± 8 a6.21 ± 0.06 a2.28 ± 0.13 a0.99 ± 0.001 a0.81 ± 0.02 a6409 ± 153 ab195 ± 14 a
    河北涞水
    Laishui, Hebei
    3.28 ± 0.39 b0.14 ± 0.06 b4499 ± 177 b105 ± 18 ab6.44 ± 0.14 a1.87 ± 0.21 ab0.99 ± 0.002 a0.73 ± 0.05 a5889 ± 191 bc207 ± 31 a
    河南孟津
    Mengjin, Henan
    3.06 ± 0.45 b0.28 ± 0.13 b5015 ± 234 ab112 ± 9 ab6.55 ± 0.12 a1.76 ± 0.26 ab1.00 ± 0.001 a0.64 ± 0.07 a6718 ± 260 a187 ± 16 ab
    江西南昌
    Nanchang, Jiangxi
    2.81 ± 0.15 b4.20 ± 0.59 a3859 ± 153 c 81 ± 16 b5.47 ± 0.12 b1.32 ± 0.17 c0.98 ± 0.004 b0.45 ± 0.05 b5539 ± 169 c126 ± 23 c
    河南商丘
    Shangqiu, Henan
    4.84 ± 0.49 a0.20 ± 0.07 b5059 ± 112 a 88 ± 8 b6.13 ± 0.19 a1.83 ± 0.23 ab0.99 ± 0.003 a0.70 ± 0.07 a6912 ± 114 a146 ± 13 ab
    河北保定
    Baoding, Hebei
    4.93 ± 0.36 a0.19 ± 0.09 b4836 ± 161 ab114 ± 7 ab6.10 ± 0.22 a2.31 ± 0.33 a0.99 ± 0.003 a0.76 ± 0.07 a6589 ± 172 a160 ± 11 ab
    注(Note):同列数据后不同小写字母表示处理间差异达到显著水平 (P < 0.05) Data followed by different letters in the same column mean significant differences among treatments (P < 0.05).
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    表 5  玉米根际VOCs数量和丰富度与土壤理化性质和微生物群落间的相关性分析

    Table 5.  Pearson correlation analysis of abundance and richness of VOCs in maize rhizosphere soils with soil physiochemical properties and microbial community

    项目ItemVOCs数量AbundanceVOCs丰富度Richness
    理化性质
    Physicochemical property
    pH–0.773**–0.947**
    铵态氮NH4+ 0.810** 0.972**
    硝态氮NO3–0.513**–0.755**
    速效磷Available P–0.250 –0.112
    速效钾Available K0.021–0.061
    微生物数量和多样性
    Microbial quantity and diversity
    细菌数量Bacterial abundance–0.292 –0.308
    真菌数量Fungal abundance 0.825** 0.935**
    细菌多样性Bacterial diversity–0.558**–0.693**
    真菌多样性Fungal diversity–0.524**–0.401*
    主要细菌丰度
    Abundance of major bacteria
    奇古菌门Thaumarchaeota–0.561**–0.560**
    放线菌门Actinobacteria0.0410.107
    变形菌门Proteobacteria–0.462* –0.605**
    绿弯菌门Chloroflexi 0.845** 0.972**
    酸杆菌门Acidobacteria–0.475**–0.666**
    厚壁菌门Firmicutes–0.068 –0.169
    主要真菌丰度
    Abundance of major fungi
    子囊菌门Ascomycota0.2380.148
    担子菌门Basidiomycota–0.168 –0.074
    壶菌门Chytridiomycota–0.100 –0.102
    注(Note):* —P < 0.05;** —P < 0.01.
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出版历程
  • 收稿日期:  2018-10-16
  • 网络出版日期:  2019-09-26
  • 刊出日期:  2019-10-01

不同土壤玉米根际挥发性有机物组成和微生物群落特征

    作者简介:李艳玲 E-mail:liyanling_2015@163.com
    通讯作者: 范分良, fanfenliang@caas.cn
  • 1. 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所/农业部植物营养与肥料重点实验室,北京 100081
  • 2. 湖南工业大学生命科学与化学学院,湖南株洲 412007
  • 基金项目: 国家重点研发计划项目(2016YFD0200109,2016YFD0800707);国家自然科学基金(41571297);中国农业科学院农业资源与农业区划研究所应急性项目(1610132018108,1610132018107)。
  • 摘要: 【目的】土壤理化性质和微生物群落的差异显著影响玉米根际挥发性有机物 (volatile organic compounds,VOCs) 的产生和释放。对根际VOCs的深入研究有望为充分挖掘根际生物学潜力和根际调控做出积极贡献。【方法】采集山东德州、河北涞水、河北保定、江西南昌、河南孟津、河南商丘等6个地区的旱地耕层土壤进行为期两个月的玉米盆栽试验,利用顶空固相微萃取联合气相色谱–质谱联用检测技术对根际土壤挥发性有机物进行了分析鉴定,利用实时荧光定量PCR技术对根际细菌和真菌进行了定量分析,利用高通量测序技术对根际细菌16S和真菌ITS进行了测序。【结果】从6个旱地土壤中共检测出44种VOCs,主要是烷烃、烯烃、酯类、胺类、有机酸和芳香类化合物,其中多种化合物与植物或微生物的生长代谢密切相关。胺类化合物N-Benzyl-N-ethyl-p-isopropylbenzamide和D-2-Bromolysergic acid diethylamide在6个土壤中均被检出,占总量的54.2%;其次检出最多的是烷烃和烯烃,占总量的31.1%和7.6%。江西南昌土壤释放的VOCs在数量和丰富度上均显著高于其他土壤,且大部分为烷烃和烯烃类化合物;从河北保定土壤中检出了6种特有的有机酸和酯类化合物。供试6种土壤中,河南商丘和河北保定的细菌数量显著高于其他四个地方。南昌土壤真菌数量显著较高,但其细菌数量、丰富度和多样性均显著低于其他土壤。6种土壤中的主要细菌依次为Thaumarchaeota(奇古菌门)、Actinobacteria(放线菌门)、Proteobacteria(变形菌门)、Chloroflexi(绿弯菌门)、Acidobacteria(酸杆菌门)、Firmicutes(厚壁菌门) 和 Unclassified(未分类门),占总细菌群落的92.1%;主要真菌依次为Ascomycota(子囊菌门)、Basidiomycota(担子菌门) 和 Chytridiomycota(壶菌门),占总真菌群落的98.3%。绿弯菌门仅在南昌土壤中占绝对优势,而南昌土壤中奇古菌门和变形菌门的相对丰度显著比其他地区少;子囊菌门在6种土壤中均为绝对优势真菌门。玉米根际释放的VOCs数量和丰富度与pH、硝态氮、细菌多样性和真菌多样性呈显著负相关 (P < 0.05),与铵态氮和真菌数量呈极显著正相关 (P < 0.01);与主要细菌门中的奇古菌门、变形菌门和酸杆菌门呈显著负相关 (P < 0.05),与绿弯菌门呈极显著正相关 (P < 0.01),但是与主要真菌门相关性不显著。【结论】理化性质不同的玉米根际土壤中,微生物群落结构与组成存在显著差异。pH是影响微生物生长的重要因素,酸性土壤中的真菌数量显著高于中性土壤,但是其细菌数量、微生物群落丰富度和多样性均显著小于中性土壤。VOCs的产生和释放受土壤、微生物和植物等众多因素的影响,土壤有机质含量越高、透气性越好、微生物数量越多时,释放的VOCs越丰富。

    English Abstract

    • 根际是根—土壤—微生物相互作用的热区,微生物是根际中最为活跃的组分[1]。在根际互作过程中,微生物受到各种生物或非生物因素的调控,进而形成具有特定结构与功能的根际微生物群落[2]。根际微生物能够直接增强植物获得养分的能力[3],或通过参与土壤养分循环过程,提高土壤养分的生物有效性,间接改变植物养分的获得量[4]。同时,根际微生物还能够通过释放多种信号物质来影响植物的生长发育和系统抗性[5],包括脂多糖、肽聚糖、鞭毛蛋白、几丁质等生物活性物质[6-8],水杨酸、茉莉酸、乙烯等激素类化合物[9],AHL等群体感应信号分子[10],DAPG和绿脓菌素等抗菌剂[11-12],以及近年来引起学术界高度关注的另一类特殊的信号物质——挥发性有机物 (volatile organic compounds,VOCs)。已报道的VOCs大多是烷烃、烯烃、醇、苯醚、醛、酮、萜烯等100~500 Da的小分子化合物,具有低分子量、低沸点、高蒸汽压、弱极性、亲脂性的特点[13],因而具有能够长距离传播、介导有机体间非直接接触的相互作用和低浓度即可被感知等优势,在长距离的根际互作中起着重要作用,在未来农业生态系统中具有广泛的应用前景。然而相关报道大多是在实验室条件下,研究少数几种微生物释放的VOCs与特定植物生长间的相互关系,较少考虑土壤因素[14],对于自然条件下玉米根际VOCs的产生与释放特征更是知之甚少。

      微生物和植物都能够释放丰富的VOCs。许多研究发现,根际微生物可以通过释放VOCs显著地影响植物生长[15-17],诱导植物对病原体的抗性[18-20],促进植物次生代谢物产生[21],或直接抑制植物病原体[22-23]。例如植物促生芽胞杆菌释放的2,3-丁二醇和3-羟基-2-丁酮 (乙偶姻) 能够显著促进拟南芥的生长[24],玉米促生根际细菌运动节杆菌 (Arthrobacteragilis)UMCV2产生的二甲基正十六胺能够促进紫花苜蓿 (Medicago sativa) 的生长和发育[25]。同样,植物也可以通过释放VOCs来抑制病原菌生长或招募更多的有益微生物以抵御病虫害的侵染。Schulz-Bohm等[26]研究发现,植物释放的VOCs可以吸引土壤中远处的细菌向根部迁移,当受到真菌侵染时,根部释放的VOCs化学组分发生改变,从而吸引更多具有抗真菌特性的细菌。玉米植株在被根甲虫幼虫侵袭时会在根际释放大量 (E)-β-石竹烯,从而增强对线虫的吸引力[27]。在镰刀菌侵染下,玉米和其他谷类植物也可以迅速释放出倍半萜[28-29]。在受到致病疫霉接种的影响下,马铃薯植株的类萜释放量会显著升高[30]。土壤理化性质是影响根际细菌和真菌群落结构最重要的因素[31-33],不同性质土壤中根际微生物群落的初始状态不同,且不同的土壤理化性质还可以调节根际碳沉积模式和植物生理特性,间接影响根际微生物群落,进而可能会影响土壤中VOCs的产生[13, 15, 34]。玉米是我国重要的粮食作物,种植区分布广泛,各地农田土壤差异较大。以往的研究多是针对某一玉米主产区,研究不同耕作管理措施对土壤微生物群落的影响[35-36],而关于不同土壤中玉米根际微生物群落特征及其与VOCs的相关性研究还未见报道。

      因此,本研究选择我国华北和华东6个不同地点的农田土进行盆栽试验,利用顶空固相微萃取联合气相色谱–质谱联用检测技术 (Headspace solid phase microextraction-Gas chromatography/mass spectrometry,SPME-GC/MS)、实时荧光定量PCR和高通量测序技术对玉米苗期根际挥发性有机物和微生物群落进行检测鉴定,进而分析比较不同土壤中玉米根际挥发性有机物的变化特征及其产生差异的原因。

      • 分别从我国山东德州、河北涞水、河南孟津、江西南昌、河南商丘、河北保定等6个地区采集耕层 (0—20 cm) 土壤。取回后过3 mm筛,剔除杂质,混匀备用。基础土样pH的测定采用电位法 (水土比为2.5∶1),有机质的测定采用重铬酸钾容量法,全氮的测定采用开氏消煮法,硝态氮的测定采用氯化钙浸提双波长比色法,速效磷的测定采用碳酸氢钠浸提钼锑抗比色法,速效钾的测定采用醋酸铵浸提火焰光度法,土壤机械组成与粒度分析采用激光粒度分析仪法,每个样品测定3个平行[37](表1)。

        表 1  供试土壤基本理化性质

        Table 1.  Basic physicochemical properties of the tested soils

        指标
        Parameter
        山东德州
        Dezhou, Shandong
        河北涞水
        Laishui, Hebei
        河南孟津
        Mengjin, Henan
        江西南昌
        Nanchang, Jiangxi
        河南商丘
        Shangqiu, Henan
        河北保定
        Baoding, Hebei
        pH7.09 ± 0.037.07 ± 0.057.14 ± 0.014.42 ± 0.007.08 ± 0.066.75 ± 0.04
        有机质 OM (g/kg)23.67 ± 1.0514.92 ± 0.4120.07 ± 0.3113.70 ± 0.9319.98 ± 0.2830.54 ± 0.81
        全氮 Total N (g/kg)1.26 ± 0.010.86 ± 0.021.10 ± 0.000.65 ± 0.001.20 ± 0.011.18 ± 0.02
        硝态氮 NO3-N (mg/kg)52.48 ± 0.5320.04 ± 0.6437.08 ± 0.524.23 ± 0.0925.85 ± 1.8323.77 ± 0.20
        速效磷 Available P (mg/kg)39.64 ± 0.9717.25 ± 0.7110.23 ± 0.813.06 ± 0.0931.74 ± 0.4451.65 ± 0.89
        速效钾 Available K (mg/kg)211.00 ± 0.0097.17 ± 1.53147.81 ± 8.1767.52 ± 3.53187.46 ± 1.7676.85 ± 0.67
        黏粒含量 (< 0.002 mm, %)
        Clay content
        6.56 ± 0.043.05 ± 0.024.32 ± 0.125.20 ± 0.212.96 ± 0.021.48 ± 0.00
        粉粒含量 (0.002~0.05 mm, %)
        Silt content
        51.06 ± 0.1351.87 ± 0.0853.62 ± 0.3330.27 ± 0.7256.14 ± 0.1024.33 ± 0.40
        砂粒含量 (0.05~2 mm, %)
        Sand content
        42.38 ± 0.1645.08 ± 0.0942.06 ± 0.3464.53 ± 0.9340.90 ± 0.1174.19 ± 0.40
        面积平均粒径 (μm)
        Surface mean diameter
        8.87 ± 0.0414.59 ± 0.0711.91 ± 0.1911.84 ± 0.4214.73 ± 0.0627.66 ± 0.07
        体积平均粒径 (μm)
        Volume median diameter
        58.13 ± 0.2056.28 ± 0.1360.00 ± 0.4084.11 ± 1.0658.02 ± 0.1190.97 ± 1.09
        体积比表面积 (m2/cm3)
        Surface density
        0.67 ± 0.000.41 ± 0.000.51 ± 0.010.51 ± 0.020.41 ± 0.000.22 ± 0.00
        质量比表面积 (cm2/g)
        Mass specific surface area
        1949 ± 8.721184 ± 5.391452 ± 24.21463 ± 50.61173 ± 4.69625 ± 1.55

        用无菌塑料袋分装土壤,每袋3 kg,每种土壤设5个重复,统一添加足量养分 (N 150 mg/kg、P2O5 100 mg/kg、K2O 100 mg/kg、钙镁50 mg/kg、铁锰硼锌钼铜5 mg/kg),调节含水量至田间持水量的60%,充分混匀,在室温下培养30天,使土壤微生物群落恢复稳定。

        将盛有培养土的塑料袋直接放入盆中。选择质量相近、外形相似的玉米种子 (供试品种为郑单958),用30%双氧水浸泡30 min后,再用无菌水洗净并浸泡24 h,然后平铺置于无菌玻璃大培养皿中,在30℃培养箱中避光培养。种子萌发后,每盆种4株玉米。待幼苗长至2 cm以上进行间苗,最终每盆保留2株长势均匀一致的幼苗。盆栽试验在温室中进行,期间统一浇灌灭菌水,并且定期随机调换盆的位置。

        2个月后,采集玉米根际土,一份风干,用于测定土壤理化性质;一份保存于4℃,用于检测土壤VOCs;一份保存于 –20℃,用于测定土壤微生物。

      • 土壤pH和铵态氮、硝态氮、速效磷、速效钾等有效养分的测定方法参照文献[37]。

      • 采用顶空固相微萃取 (SPME) 的方法收集土壤释放的挥发性有机物。将土样从冰箱取出后,在室温下放置2 h。分别称取10 g(干土重) 土壤于20 mL玻璃顶空瓶 (配中空螺纹铝盖和聚四氟乙烯隔垫,CNW,DE),统一调节含水量至25%,在25℃条件下培养7天。将50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取纤维装配在SPME手动萃取手柄上 (Supelco, Bellefonte, PA, USA),在25℃条件下顶空萃取10 h,未装样品的顶空瓶作为对照[17, 38-39]。萃取完成后立即用7890A-5975C气相色谱–质谱分析仪 (Agilent Technologies,USA) 进行检测分析。

        色谱条件:进样口温度250℃,进样时间3 min;不分流模式,载气为99.999%的高纯氦气,柱流量为1 mL/min。柱箱升温程序:初始温度50℃,保持2 min,以8℃/min的速度升温至180℃,再以10℃/min的速度升温至240℃,保持6 min。质谱条件:离子化方式为EI,70eV;离子源温度230℃,四级杆温度150℃,传输线温度250℃;扫描方式为全扫描,扫描范围35~450 amu。测得的VOCs质谱在NIST/EPA/NIH数据库中进行比对鉴定[17, 38]

      • 称取0.5 g保存于–20℃的土壤样品,用Fast DNA SPIN Kit for Soil 试剂盒和Fast Prep-24核酸提取仪 (MP Biomedicals,Solon, OH, USA) 提取土壤总DNA,用1%琼脂糖凝胶电泳检验DNA提取质量,用NanoDrop 2000微量分光光度计 (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) 检测其浓度和纯度,保存于–20℃冰箱备用。

        qPCR在Roche LightCycler®480Ⅱ实时荧光定量PCR系统上进行,选用的荧光试剂是SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ。qPCR标准曲线的制作:单克隆转接过夜培养后,用柱式质粒小量抽提试剂盒提取质粒,PicoGreen测定浓度后逐步稀释到108~101拷贝数,保存于–80℃[40]。细菌16S rRNA的扩增引物是357F和518R,真菌18S rRNA的扩增引物是FF390和FR1。扩增体系均为15 μL,包含7.5 μL 2 × SYBRPremix Ex TaqⅡ、0.3 μL50 × ROX Reference Dye、10 μmol/L的前后引物各0.3 μL、2 μL稀释20倍的模板DNA和4.6 μL ddH2O,每个样品3次重复。细菌扩增程序:95℃预变性5 min;95℃解链10 s,52℃退火10 s,72℃延伸20s,45个循环。真菌扩增程序:95℃预变性5 min;95℃解链10 s,52℃退火30 s,72℃延伸45 s,45个循环。

      • 将提取的DNA原液稀释至约5 mg/L作为PCR扩增模板。

        细菌16S rRNAV4-V5可变区序列的扩增引物是515F和806R[32],扩增体系为50 μL,包含5 μL10 × buffer、4 μL dNTP、0.5 μL rTaq(Takara)、10 μmol/L的前后引物各1 μL、2 μL模板DNA和36.5 μL ddH2O,每个样品3次重复。扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃解链45 s,55℃退火35 s,72℃延伸45 s,30个循环;72℃延伸10 min。将3个重复的DNA扩增产物混匀后,用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检验。

        真菌ITS2序列的扩增采用两轮扩增法。第一轮扩增引物为ITS1F和ITS4[41],扩增体系为25 μL,包含2.5 μL10 × buffer、2 μL dNTP、0.25μL rTaq(Takara)、10 μmol/L的前后引物各0.5 μL、1 μL模板DNA和18.25 μL ddH2O,每个样品3次重复。第一轮扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃解链40 s,55℃退火30 s,72℃延伸40 s,20个循环;72℃延伸10 min。第二轮扩增引物为ITS3和ITS4[42, 43],扩增体系为50 μL,包含5 μL10 × buffer、4 μL dNTP、0.5 μL rTaq(Takara)、10 μmol/L的前后引物各1 μL、2 μL第一轮扩增所得模板DNA和36.5μL ddH2O。第二轮扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃解链30 s,55℃退火30 s,72℃延伸40 s,25个循环;72℃延伸10 min。将3个重复的DNA扩增产物混匀后,用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检验。

        用PicoGreen试剂盒测定所得细菌和真菌PCR产物浓度,分别等量混匀后,采用DNA纯化试剂盒 (TIANGEN Biotech, Beijing, China) 进行纯化回收。通过IlluminaHiseq2500平台进行细菌16S和真菌ITS序列测定。

      • 高通量序列用USEARCH软件包分析[44],先去除质量数低于20以及与引物存在错配的序列,再将剩余高质量序列统一修剪至250 bp。序列中的嵌合体用UCHIME过滤[45]。以97%相似性水平通过UPARSE进行OTU聚类[46]。每个样品的细菌和真菌OUT分别抽平至79589和299条序列。以85%的置信水平为标准,在RDP(http://pyro.cme.msu.edu/) 平台对代表序列进行物种分类注释,并在各个分类水平上统计每个样品的群落组成。

        采用Excel 2013和SPSS 21软件进行数据统计分析,利用单因素ANOVO进行方差分析,利用Duncan法进行多重比较 (P < 0.05)。丰富度指数 (Richness)、香农–威尔指数 (Shannon–Wiener index)、辛普森指数 (Simpson index) 和Chao1指数 (Chao1 index) 等微生物多样性指标的计算公式见文献[47]。

      • 不同采样点土壤pH、铵态氮、硝态氮、速效磷、速效钾等指标存在显著差异 (表2)。南昌根际土呈较强酸性,pH值低至4.13,其他土壤均呈中性。南昌土壤的铵态氮含量显著高于其他地点,分别是德州、涞水、孟津、商丘和保定的59.6、45.5、36.8、64.8、56.2倍。硝态氮含量由高到低依次为孟津 > 德州 > 商丘 > 保定 > 涞水 > 南昌,其中德州比商丘高35.1%,商丘比保定高56.6%,而南昌土壤的硝态氮含量仅为涞水的0.6%。速效磷含量变化范围为18.41~64.70 mg/kg,不同土壤间均存在显著差异,含量由高到低依次为保定 > 德州 > 商丘 > 南昌 > 孟津 > 涞水。德州土壤速效钾含量较高,其次是涞水、孟津、南昌、商丘,而保定土壤的速效钾含量相对较低。

        表 2  玉米根际土壤化学性质

        Table 2.  Chemical properties of maize rhizosphere soils

        采样点
        Sampling point
        pH铵态氮 (mg/kg)
        NH4+-N
        硝态氮 (mg/kg)
        NO3-N
        速效磷 (mg/kg)
        Available P
        速效钾 (mg/kg)
        Available K
        山东德州Dezhou, Shandong7.01 ± 0.04 a1.00 ± 0.05 b198.88 ± 9.21 a47.62 ± 1.09 b181.85 ± 2.10 a
        河北涞水Laishui, Hebei6.44 ± 0.05 c1.31 ± 0.14 b93.96 ± 13.09 c18.41 ± 0.63 f124.68 ± 1.85 b
        河南孟津Mengjin, Henan6.74 ± 0.07 b1.62 ± 0.20 b201.23 ± 7.00 a24.91 ± 0.78 e122.68 ± 1.85 bc
        江西南昌Nanchang, Jiangxi4.13 ± 0.05 d59.61 ± 1.83 a0.61 ± 0.21 d30.87 ± 2.12 d115.88 ± 3.16 c
        河南商丘Shangqiu, Henan6.94 ± 0.02 a0.92 ± 0.04 b147.17 ± 21.56 b40.01 ± 3.65 c106.29 ± 4.44 d
        河北保定Baoding, Hebei6.50 ± 0.04 c1.06 ± 0.20 b98.23 ± 8.27 c64.70 ± 0.54 a64.71 ± 1.02 e
        注(Note):同列数据后不同小写字母表示处理间差异达到显著水平 (P < 0.05) Data followed by different letters in the same column mean significant differences between the treatments (P < 0.05).
      • 从6个土壤中共检出44种VOCs,主要是烷烃、烯烃、酯类、胺类、有机酸和芳香类化合物 (表3)。不同土壤释放的VOCs存在显著差异 (图1),其中南昌土壤释放的VOCs在数量和丰富度上均显著大于其他土壤。共检测出35种VOCs,仅从德州、涞水、孟津、商丘和保定土壤中分别检测出4种、3种、3种、3种和8种VOCs。

        表 3  玉米根际土壤释放的挥发性有机物

        Table 3.  Volatile organic compounds released from maize rhizosphere soils

        编号No.保留时间 Retention (min)化合物名称Compound nameCAS登录号CAS number
        1 3.4623-Pentanone, 2,4-dimethyl-000565-80-0
        2 5.403Oxime-, methoxy-phenyl-1000222-86-6
        3 6.159Octane, 2-bromo-000557-35-7
        4 6.944Phenol, 4-butyl-001638-22-8
        5 6.982Heptane, 2,2,4,6,6-pentamethyl-013475-82-6
        6 7.5842-Methyl-2-bornene072540-93-3
        7 7.714Heptanoic acid, 3,5,5-triethyl-1000160-77-1
        8 7.883Propane, 1-(1,1-dimethylethoxy)-2-methyl-033021-02-2
        9 8.018Heptane, 2,2,3,3,5,6,6-heptamethyl-007225-67-4
        10 8.167Heptadecane, 8-methyl-013287-23-5
        11 8.3021-Hexene, 4,4-diethyl-1000160-42-0
        12 8.485Sulfurous acid, 2-ethylhexyl nonyl ester1000309-19-2
        13 8.668Propanoic acid, phenyl ester000637-27-4
        14 8.8172,2-Dimethyl-3-heptene trans019550-75-5
        15 8.904Undecane, 5-methyl-001632-70-8
        16 8.937Ether, 6-methylheptyl vinyl010573-35-0
        17 8.986Oxalic acid, 2-ethylhexyl isohexyl ester1000309-38-8
        18 9.063Hexane, 3,3,4-trimethyl-016747-31-2
        19 9.217Dodecane, 2,6,10-trimethyl-003891-98-3
        20 9.337Hexacosane000630-01-3
        21 9.409Octane, 1,1'-oxybis-000629-82-3
        22 9.515Sulfurous acid, 2-ethylhexyl heptadecyl ester1000309-20-0
        2310.0591-Hexene, 2,4,4-triethyl-1000156-96-5
        2410.4212-Pentene, 4,4-dimethyl-026232-98-4
        2510.8544-Nonene, 5-butyl-007367-38-6
        2610.916(Z)-3-Hexene, 2,2,5,5-tetramethyl-000692-47-7
        2710.979Cyclohexane, 1,2,3-trimethyl-001678-97-3
        2811.278Tetradecane000629-59-4
        2911.3744,4-Dimethyl-1-hexene001647-08-1
        3011.432Pentane, 3,3-diethyl-001067-20-5
        3112.9152,4,4-Trimethyl-1-hexene051174-12-0
        3213.098Sulfurous acid, dodecyl 2-ethylhexyl ester1000309-19-5
        3313.401Tridecane, 3-methyl-006418-41-3
        3415.809(2S,4R)-p-Mentha-[1(7),8]-diene 2-hydroperoxide1000292-74-4
        3515.992N-Benzyl-N-ethyl-p-isopropylbenzamide015089-22-2
        3616.3911,3-Cyclopentadiene, 1,2,3,4,5-pentamethyl-004045-44-7
        3716.517Guaia-1(10),11-diene1000374-19-7
        3818.452D-2-Bromolysergic acid diethylamide000478-84-2
        3918.631Morpholine, 4-octadecyl-016528-77-1
        4021.183Undecanoic acid isopropyl ester, 10-hydroxy-11-morpholin-4-yl-1000303-32-4
        4121.804Palmitoleic acid000373-49-9
        4222.011n-Hexadecanoic acid000057-10-3
        4322.988(Z)-9-Octadecenamide000301-02-0
        4424.871Supraene007683-64-9

        图  1  不同采样点玉米根际土壤释放的VOCs数量与组成

        Figure 1.  Quantity and composition of VOCs emitted from different maize rhizosphere soils

        组分上,N-Benzyl-N-ethyl-p-isopropylbenzamide(No.35) 和D-2-Bromolysergic acid diethylamide(No.38) 在6种土壤中均被检出,分别占总量的48.5%和5.0%,但是孟津土壤释放的D-2-Bromolysergic acid diethylamide(No.38) 显著多于其他土壤,而南昌土壤释放的N-Benzyl-N-ethyl-p-isopropylbenzamide(No.35) 显著少于其他土壤。(Z)-9-Octadecenamide(No.43) 在德州土壤被检出,Supraene(No.44) 在孟津土壤被检出,而Sulfurous acid, dodecyl 2-ethylhexyl ester(No.32)、Tridecane, 3-methyl-(No.33)、Morpholine, 4-octadecyl-(No.39)、Undecanoic acid isopropyl ester,10-hydroxy-11-morpholin-4-(No.40)、Palmitoleic acid(No.41) 和n-Hexadecanoic acid(No.42) 在保定土壤被检出;在南昌土壤中被检出的VOCs有33种,其中相对含量大于2%的依次为Propane, 1-(1,1-dimethylethoxy)-2-methyl-(No.8)、N-Benzyl-N-ethyl-p-isopropylbenzamide(No.35)、Guaia-1(10),11-diene(No.37)、Heptadecane,8-methyl-(No.10)、Dodecane,2,6,10-trimethyl-(No.19)、Propanoic acid, phenyl ester(No.13)、Heptane,2,2,4,6,6-pentamethyl-(No.5) 和Octane, 1,1'-oxybis-(No.21)。

      • 6种不同土壤中玉米根际细菌和真菌种群数量存在差异 (表4)。各处理的细菌数量变化范围为2.8 × 109~4.9 × 109/g,其中保定和商丘的细菌数量较高,与德州、涞水、孟津和南昌的差异达到显著水平。真菌数量变化范围为1.3 × 106/g ~ 4.2 × 107/g,其中孟津、商丘、保定、涞水和德州的真菌数量均显著低于南昌,分别是南昌土壤的6.7%、4.8%、4.5%、3.3%和3.1%。

        表 4  玉米根际土壤细菌和真菌数量及其多样性

        Table 4.  Quantity and diversity of bacteria and fungi in maize rhizosphere soils

        采样点
        Sampling point
        微生物数量 (copies/g, soil)
        Number of microorganisms
        丰富度
        Richness
        香农–威尔指数
        Shannon–Wiener index
        辛普森指数
        Simpson index
        Chao1指数
        Chao1 index
        细菌 (× 109)
        Bacteria
        真菌 (× 107)
        Fungus
        细菌
        Bacteria
        真菌
        Fungi
        细菌
        Bacteria
        真菌
        Fungi
        细菌
        Bacteria
        真菌
        Fungi
        细菌
        Bacteria
        真菌
        Fungi
        山东德州
        Dezhou, Shandong
        3.51 ± 0.48 b0.13 ± 0.03 b4726 ± 144 ab127 ± 8 a6.21 ± 0.06 a2.28 ± 0.13 a0.99 ± 0.001 a0.81 ± 0.02 a6409 ± 153 ab195 ± 14 a
        河北涞水
        Laishui, Hebei
        3.28 ± 0.39 b0.14 ± 0.06 b4499 ± 177 b105 ± 18 ab6.44 ± 0.14 a1.87 ± 0.21 ab0.99 ± 0.002 a0.73 ± 0.05 a5889 ± 191 bc207 ± 31 a
        河南孟津
        Mengjin, Henan
        3.06 ± 0.45 b0.28 ± 0.13 b5015 ± 234 ab112 ± 9 ab6.55 ± 0.12 a1.76 ± 0.26 ab1.00 ± 0.001 a0.64 ± 0.07 a6718 ± 260 a187 ± 16 ab
        江西南昌
        Nanchang, Jiangxi
        2.81 ± 0.15 b4.20 ± 0.59 a3859 ± 153 c 81 ± 16 b5.47 ± 0.12 b1.32 ± 0.17 c0.98 ± 0.004 b0.45 ± 0.05 b5539 ± 169 c126 ± 23 c
        河南商丘
        Shangqiu, Henan
        4.84 ± 0.49 a0.20 ± 0.07 b5059 ± 112 a 88 ± 8 b6.13 ± 0.19 a1.83 ± 0.23 ab0.99 ± 0.003 a0.70 ± 0.07 a6912 ± 114 a146 ± 13 ab
        河北保定
        Baoding, Hebei
        4.93 ± 0.36 a0.19 ± 0.09 b4836 ± 161 ab114 ± 7 ab6.10 ± 0.22 a2.31 ± 0.33 a0.99 ± 0.003 a0.76 ± 0.07 a6589 ± 172 a160 ± 11 ab
        注(Note):同列数据后不同小写字母表示处理间差异达到显著水平 (P < 0.05) Data followed by different letters in the same column mean significant differences among treatments (P < 0.05).

        表4可知,6种土壤的细菌丰富度在3859~5059范围内变动,其中商丘的细菌丰富度最高,与涞水和南昌的差异达到显著水平;南昌的细菌丰富度最低,与其他5个处理均存在显著差异。6种土壤的真菌丰富度在81~127范围内变动,其中德州的真菌丰富度最高,与商丘和南昌差异显著。从香农–威尔指数、辛普森指数和Chao1指数来看,玉米根际土壤细菌和真菌多样性在德州、涞水、孟津、商丘和保定间的差异都不显著,但是均显著高于南昌土壤的细菌和真菌多样性。

      • 从6种土壤中共检测出31个细菌门,其中共有细菌门27个。相对丰度大于2%的细菌有7个,占总细菌群落的92.1%,分别是Thaumarchaeota(奇古菌门)、Actinobacteria(放线菌门)、Proteobacteria(变形菌门)、Chloroflexi(绿弯菌门)、Acidobacteria(酸杆菌门)、Firmicutes(厚壁菌门) 和Unclassified(未分类门),相对丰度依次为23.9%、15.6%、14.9%、12.3%、11.3%、7.9%和6.2%。主要细菌门在不同土壤中的相对丰度存在显著差异 (图2A)。在德州、涞水、孟津、南昌、商丘、保定等6种土壤中,Thaumarchaeota的群落相对丰度分别为29.7%、15.5%、21.2%、5.2%、36.8%、34.9%,Actinobacteria的群落相对丰度分别为14.9%、21.8%、16.0%、17.8 %、12.3%、11.1%,Proteobacteria的群落相对丰度分别为15.3%、21.1%、18.7%、7.2%、13.4%、14.0%,Chloroflexi的群落相对丰度分别为7.6%、3.3%、6.6%、44.7%、5.0%、6.8%,Acidobacteria的群落相对丰度分别为14.5%、16.5%、13.2%、3.3%、10.0%、10.0%,Firmicutes的群落相对丰度分别为4.3%、6.1%、9.5%、6.3%、10.1%、10.9%。

        图  2  不同采样点玉米根际土壤细菌 (A) 和真菌 (B) 群落组成

        Figure 2.  Community composition of bacteria (A) and fungi (B) in different maize rhizosphere soils

        从6种土壤中共检测出7个真菌门,其中共有真菌门5个。相对丰度大于1%的真菌有3个,占总真菌群落的98.3%,分别是Ascomycota(子囊菌门)、Basidiomycota(担子菌门) 和Chytridiomycota(壶菌门),相对丰度依次为93.4%、3.0%和1.9%。主要真菌门在不同土壤中的相对丰度也存在显著差异 (图2B)。Ascomycota在6个处理中均占绝对优势,群落相对丰度占84.0%~98.0%,其中孟津、南昌、商丘与保定间的差异达到显著水平,分别高出16.7%、15.6%、15.2%;Basidiomycota群落相对丰度占0.3%~12.5%,其中保定的相对丰度显著高于其他处理,分别比德州、涞水、孟津、南昌和商丘高8.8%、7.5%、13.4%、7.1%、45.8%;Chytridiomycota群落相对丰度占0.1%~7.8%,其中涞水的相对丰度较其他处理更高。

        基于97%相似度的OTU数据,采用weighted Unifrac算法分别对不同土壤中玉米根际微生物群落结构进行了主坐标分析 (PCoA)。对于细菌群落 (图3A),第一主成分和第二主成分的方差贡献率分别为52.96%和14.42%,累计方差贡献率为67.38%;德州、孟津、商丘和保定的细菌群落结构和组成相似,聚集分布于第三象限;南昌分布于第四象限,在PCoA1轴上与其余5个处理明显分开;涞水分布于第二象限,在PCoA2轴上与其余5个处理明显分开。对于真菌群落 (图3B),第一主成分和第二主成分的方差贡献率分别为19.85%和13.82%,累计方差贡献率为33.67%;德州、涞水、孟津和商丘的真菌群落结构和组成比较相似,主要分布于第四象限;南昌在PCoA1轴上的坐标为负值,与其余5个处理明显分开;保定分布于第一象限,在PCoA2轴上与其余5个处理明显分开。

        图  3  不同采样点玉米根际土壤细菌 (A) 和真菌群落 (B) 的主坐标分析

        Figure 3.  Principal coordinate analysis of bacterial (A) and fungi communities (B) in different maize rhizosphere soils

      • 表5可以看出,玉米根际释放的VOCs数量和丰富度与pH和硝态氮含量呈极显著负相关 (P < 0.01),与铵态氮含量呈极显著正相关。真菌数量与VOCs数量和丰富度呈极显著正相关,细菌多样性与VOCs数量和丰富度呈极显著负相关,真菌多样性与VOCs数量呈极显著负相关,与VOCs丰富度呈显著负相关 (P < 0.05)。主要细菌门中,奇古菌门、变形菌门和酸杆菌门与VOCs数量和丰富度呈显著或极显著负相关,绿弯菌门与VOCs数量和丰富度呈极显著正相关;主要真菌门与玉米根际释放的VOCs数量及丰富度相关性不显著。

        表 5  玉米根际VOCs数量和丰富度与土壤理化性质和微生物群落间的相关性分析

        Table 5.  Pearson correlation analysis of abundance and richness of VOCs in maize rhizosphere soils with soil physiochemical properties and microbial community

        项目ItemVOCs数量AbundanceVOCs丰富度Richness
        理化性质
        Physicochemical property
        pH–0.773**–0.947**
        铵态氮NH4+ 0.810** 0.972**
        硝态氮NO3–0.513**–0.755**
        速效磷Available P–0.250 –0.112
        速效钾Available K0.021–0.061
        微生物数量和多样性
        Microbial quantity and diversity
        细菌数量Bacterial abundance–0.292 –0.308
        真菌数量Fungal abundance 0.825** 0.935**
        细菌多样性Bacterial diversity–0.558**–0.693**
        真菌多样性Fungal diversity–0.524**–0.401*
        主要细菌丰度
        Abundance of major bacteria
        奇古菌门Thaumarchaeota–0.561**–0.560**
        放线菌门Actinobacteria0.0410.107
        变形菌门Proteobacteria–0.462* –0.605**
        绿弯菌门Chloroflexi 0.845** 0.972**
        酸杆菌门Acidobacteria–0.475**–0.666**
        厚壁菌门Firmicutes–0.068 –0.169
        主要真菌丰度
        Abundance of major fungi
        子囊菌门Ascomycota0.2380.148
        担子菌门Basidiomycota–0.168 –0.074
        壶菌门Chytridiomycota–0.100 –0.102
        注(Note):* —P < 0.05;** —P < 0.01.
      • 土壤VOCs的萃取效率受水分、温度等环境条件的影响[48],本研究中各处理VOCs的收集和检测均在相同的水分和温度条件下进行。最终从供试的6种土壤中共检测出44种VOCs,主要是烷烃、烯烃、酯类、胺类、有机酸和芳香类化合物,其中检出最多的是胺类化合物N-Benzyl-N-ethyl-p-isopropylbenzamide (No.35) 和D-2-Bromolysergic acid diethylamide (No.38),占总量的54.2%;其次是烷烃和烯烃,占总量的31.1%和7.6%。这些化合物的化学性质与前人报道的植物或微生物释放的挥发性化合物极为相似,因此本研究中检测到的VOCs可能主要来源于玉米根系和根际微生物[5, 13, 15, 49-50]

        本研究从玉米根际土壤检出的VOCs中未发现2,3-丁二醇、乙偶姻、二甲基二硫醚、β-石竹烯等典型的具有促生功能的挥发性物质[5, 13, 24, 27],但其中多种化合物可能与植物或微生物生长代谢密切相关。N-Benzyl-N-ethyl-p-isopropylbenzamide (No.35) 是肺炎克雷伯菌产生的能够有效抑制黄曲霉生长的抗真菌挥发性化合物之一[51],在由细菌分泌的有助于维持微囊藻菌落结构的胞外化合物中也曾被检出[52]。D-2-Bromolysergic acid diethylamide (No.38) 是医学领域研究较多的一种致幻剂[53],然而其在植物根际互作方面的研究还未见报道。Guaia-1 (10), 11-diene (No.37) 具有体外抑菌活性[54]。促生巨大芽孢杆菌菌株XTBG34释放的VOCs中包含Dodecane, 2,6,10-trimethyl- (No.19)[55]。Raza等[17]和Jishma等[56]研究发现,Hexacosane (No.20) 和Tetradecane (No.28) 能促进植物生长,而Heptane, 2,2,4,6,6-pentamethyl- (No.5)、Palmitoleic acid (No.41)、n-Hexadecanoic acid (No.42) 和Supraene (No.44) 会抑制植物生长。2-Methyl-2-bornene (No.6) 可能主要来自土壤中的放线菌[57],具有标记土壤微生物活动和组成的潜在作用[58]。Hussein等[59]研究结果表明 (Z)-9-Octadecenamide (No.43) 会抑制细菌生长。从组成成分上看,南昌玉米根际VOCs组分与许多报道有相似之处。例如,Zhang等[60]研究发现非致病尖刀镰刀菌F.oxysporumCanR-46产生的VOCs主要包括烯烃类、烷类、酯类、有机酸,其中大多数化合物属于烯烃并具有广谱的抗真菌活性。Schulz-Bohm等[26]研究VOCs在苔草Carex arenaria和黄色镰刀菌F. culmorum互作过程中发现,Carex arenaria根释放的VOCs以芳族化合物为主 (49%~51%),能够吸引土壤中较远的细菌向根部迁移,F. culmorum释放的VOCs大部分是萜类 (21%),但是受F. culmorum侵染的植物根际产生了更多的烷烃和单萜烯,有效吸引了具有抗真菌特性的细菌。今后有必要通过购买标准品或有效的分离手段进一步验证各种VOCs的生态功能,阐明其具体来源和作用机制,从而将具有重要生态调节功能的VOCs应用于农业生产中。

        本研究中,玉米根际土壤释放的VOCs在不同土壤间存在差异,尤其是南昌土壤释放的VOCs在数量和种类上均显著大于其他5种土壤。相关性分析结果进一步表明,玉米根际释放的VOCs与土壤理化性质和微生物群落的多个指标呈显著相关关系。一方面,不同土壤的机械组成和理化性质存在较大差异,会影响VOCs在土壤孔隙间及其从土壤向空气扩散的过程[48]。南昌供试土壤为酸性红壤,有机质含量较低,土壤中的层状硅酸盐矿物遭到破坏,砂粒含量较高,其土壤颗粒对VOCs的吸附作用较弱,利于VOCs扩散到空气中[61]。另一方面,通过qPCR和高通量测序结果可知,不同土壤中的根际微生物数量、多样性以及群落结构和组成存在显著差异,影响了土壤中VOCs的产生[13, 15, 34]。VOCs数量和丰富度与真菌数量呈极显著正相关,即当南昌玉米根际土壤中真菌数量显著高于其他土壤时,产生的VOCs也更丰富。同时,GC/MS鉴定结果表明,南昌土壤释放的VOCs大部分是烷烃及其衍生物和烯烃,而大量研究已发现多种真菌会释放丰富的以烷烃、烯烃为主的挥发性物质[5, 26, 31, 48, 60, 62-63]。从保定土壤中检出的6种特有的有机酸和酯类化合物,可能是保定土壤中含量较高的有机质在丰富的土壤细菌的作用下分解产生的次生代谢物,同时由于保定土壤砂粒含量较高、表面积较小,良好的透气性使土壤中的VOCs更多地向空气扩散[17]。门水平上,玉米根际释放的VOCs与不同微生物的相关性存在显著差异,与奇古菌门、变形菌门和酸杆菌门呈显著负相关 (P < 0.05),与绿弯菌门呈极显著正相关 (P < 0.01),今后或许可以据此来方便快捷地监测不同土壤中微生物的动态变化情况。

      • 理化性质不同的玉米根际土壤中,微生物群落结构与组成存在显著差异。pH是影响微生物生长的重要因素,酸性土壤中的真菌数量显著高于中性土壤,但是其细菌数量、微生物群落丰富度和多样性均显著小于中性土壤。玉米根际土壤释放的VOCs主要是烷烃、烯烃、酯类、胺类、有机酸和芳香类化合物,其中多种化合物与植物或微生物的生长代谢密切相关,具有重要的生态学潜能。VOCs的产生和释放受土壤、微生物和植物等众多因素的影响,土壤有机质含量越高、透气性越好、微生物数量越多时,释放的VOCs越丰富。今后,有必要探索更加高效准确的土壤VOCs分析方法,深入探究各类VOCs的生态功能和作用机制,从而使之成为帮助评估土壤质量的重要指标以及调控根际微生物群落的重要手段。

    参考文献 (63)

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