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稻虾共作模式下稻田土壤氨氧化微生物丰度和群落结构的特征

王蓉 朱杰 金涛 刘章勇

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稻虾共作模式下稻田土壤氨氧化微生物丰度和群落结构的特征

    作者简介: 王蓉E-mail:WRchangda@163.com;
    通讯作者: 金涛, E-mail:jintao165@126.com
  • 基金项目: 国家重点研发计划项目(2017YFD0301400);国家重点研发计划项目(2017YFD0800102)。

Characteristics of ammonia oxidation microbial abundance and community structure in paddy soils of rice–crayfish symbiosis farming system

    Corresponding author: JIN Tao, E-mail:jintao165@126.com ;
  • 摘要: 【目的】研究稻虾共作模式下土壤氨氧化微生物数量、群落多样性及群落结构,深入了解该模式下的土壤微生态环境的演变。【方法】试验点在湖北省荆州市长江大学农学院基地,设置稻虾共作模式 (CR) 与常规中稻种植模式 (MR),借助荧光定量PCR技术与Illumina Miseq高通量测序平台,分析了土壤氨氧化细菌 (AOB) 与古菌 (AOA) 丰度、多样性及群落结构。【结果】与MR模式相比,CR模式显著提高了土壤硝态氮、总碳及总氮含量,对土壤pH、碱解氮及土壤碳氮比无显著影响。CR模式土壤AOA与AOB amoA基因拷贝数为3.13 × 105和7.01 × 105 copies/g干土,MR模式土壤AOA、AOB amoA基因拷贝数为1.41 × 105和3.87 × 105 copies/g干土,两个模式土壤AOB的数量均显著高于AOA,CR模式土壤AOA、AOB的数量均显著高于MR模式 (P < 0.05)。α群落多样性指数表明,相比MR,CR模式显著降低了土壤AOA群落多样性,对AOB群落多样性无显著影响。Venn结果分析,CR模式增加了AOA amoA基因的物种,改变了AOB amoA基因的物种组成,且AOB amoA物种数量下降。在属水平上,norank_c_environmental_samples_p_Thaumarchaeotaunclassified_k_norank_d_Archaeanorank_c_environmental_samples_p_Crenarchaeotanorank_p_environmental_samples_k_norank为AOA的优势类群,相对丰度占AOA amoA基因总序列的99.25%~99.46%,CR模式显著提高了norank_c_environmental_samples_p_Crenarchaeota在AOA群落属水平的相对丰度;unclassified_k_norank_d_Bacterianorank_f_environmental_samplesnorank_o_environmental_samples_c_Betaproteobacteriaunclassified_o_Nitrosomonadales为AOB的优势类群,相对丰度共占97.78%~98.49%,且CR模式显著增加了norank_o_environmental_samples_c_Betaproteobacteriaunclassified_o_Nitrosomonadales在AOB群落属水平的相对丰度。冗余分析 (RDA) 结果显示,土壤基本理化性质对于土壤AOA、AOB群落结构影响有着相似的趋势,其中对AOA、AOB群落结构影响最大的因子是硝态氮,其次分别为总碳、铵态氮、碱解氮、pH。根据RDA投影距离分析,稻虾共作模式对土壤AOA群落结构的影响大于AOB,且MR与稻虾共作模式土壤AOB的群落结构具有一定的相似度。【结论】稻虾共作模式显著降低了AOA群落多样性,而对AOB群落无显著影响;稻虾共作模式显著增加了AOA与AOB的丰度并显著影响了群落结构组成。土壤硝态氮、总碳、铵态氮、碱解氮、pH含量是导致土壤微生物数量、多样性及群落结构变化的主要原因。
  • 图 1  稻虾共作模式和常规中稻模式土壤AOA amoA和AOB amoA基因丰度

    Figure 1.  Abundance of AOA amoA and AOB amoA in integrated rice-crayfish farming system and conventional middle rice systme

    图 2  稻虾共作模式和常规中稻模式土壤AOA amoA和AOB amoA基因微生物物种分类学组成Venn图

    Figure 2.  Venn drawings of AOA amoA and AOB amoA gene species taxonomy of rice-crayfish farming system and conventional middle rice system

    图 3  稻虾共作模式和常规中稻模式下土壤AOB amoA基因群落属水平组成 (相对丰度 > 0.1%)

    Figure 3.  Genus distribution of AOB amoA gene community in fields under rice–crayfish farming system (CR) and conventional middle rice system (MR) (relative abundance > 0.1%)

    图 4  AOA和AOB群落结构与土壤理化性质的冗余分析

    Figure 4.  Redundancy analysis (RDA) between AOA and AOB community structures and soil properties

    表 1  荧光定量PCR扩增引物及反应程序[11]

    Table 1.  Real-time PCR amplification of primers and reaction procedures

    目标基因
    Target gene
    引物
    Primer
    引物序列
    Sequence
    PCR反应条件
    PCR condition
    AOAArch-amoAF Arch-amoARSTAATGGTCTGGCTTAGACGGCGGCCATCCATCTGTATGTPCR反应体系为20 μL,包括,10 μL 2 × syberMIX (with ROX),0.2 μL两种上、下游引物 (10 μmol/L),1 μL稀释8倍后的样品,用RNase-Free ddH2O补足至20 μL。程序设置:95℃/2 min;95℃/10 s,53℃/34 s,72℃/32 s,共40个循环。
    The PCR was carried out in a reaction volume of 20 μL. Include:10 μL 2 × syberMIX (with ROX),0.2 μL Forward Primer (10 μM),0.2 μL Reverse Primer (10 μM),the 1 μL sample was diluted 8-fold,RNase-Free ddH2O up to 20 μL. The PCR cycling conditions were as follows:95℃ 2 min; 95℃ 10 s,53℃ 34 s,72℃ 32 s,40 cycles.
    AOBamoA-1F amoA-2RGGGGTTTCTACTGGTGGTCCCCTCKGSAAAGCCTTCTTCPCR反应体系为20 μL,包括,10 μL 2 × syberMIX (with ROX),0.2 μL两种上、下游引物 (10 μmol/L),1 μL稀释8倍后的样品,用RNase-Free ddH2O补足至20 μL。程序设置:95℃/2 min;95℃/10 s,55℃/34 s,72℃/32 s,共40个循环。
    The PCR was carried out in a reaction volume of 20 μL. Include:10 μL 2 × syberMIX (with ROX),0.2 μL Forward Primer (10 μM),0.2 μL Reverse Primer (10 μM),the 1 μL sample was diluted 8-fold,RNase-Free ddH2O up to 20 μL. The PCR cycling conditions were as follows:95℃ 2 min; 95℃ 10 s,55℃ 34 s,72℃ 32 s,40 cycles.
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    表 2  稻虾共作和常规中稻模式稻田土壤理化性质

    Table 2.  Physicochemical properties in paddy fields under integrated rice–crayfish farming and conventional middle rice systems

    模式
    System
    pH碱解氮
    Alk.-hydr. N
    (mg/kg)
    硝态氮
    NO3-N
    (mg/kg)
    铵态氮
    NH4+-N
    (mg/kg)
    全碳
    Total C
    (g/kg)
    全氮
    Total N
    (g/kg)
    碳氮比
    C/N
    常规中稻MR7.47 ± 0.07 a136.17 ± 8.19 a0.31 ± 0.03 b13.61 ± 3.41 a18.16 ± 0.18 b1.86 ± 0.01 b9.78 ± 0.12 a
    稻虾共作CR7.41 ± 0.15 a141.28 ± 3.59 a0.40 ± 0.01 a19.84 ± 4.01 a18.59 ± 0.14 a1.94 ± 0.02 a9.58 ± 0.10 a
    注(Note):数据为平均值 ± 标准误;同列数据后不同小写字母表示两模式间差异显著 (P < 0.05)。MR—Conventional middle rice pattern; CR—Rice–crayfish culture pattern; values are means ± SD; values followed by different lowercase letters indicate significant difference between the two systems (P < 0.05).
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    表 3  稻虾共作模式和常规中稻模式土壤氨氧化微生物群落α多样性指数

    Table 3.  Alpha diversity indices of soil ammonia oxidizers in integrated rice–crayfish farming systemand conventional middle rice system

    模式
    System
    Ace指数
    Ace index
    Chao指数
    Chao index
    Shannon指数
    Shannon index
    Simpson指数
    Simpson index
    Sobs指数
    Sobs index
    氨氧化古菌群落 AOA community
    常规中稻MR49.79 ± 4.00 a49.53 ± 4.02 a1.73 ± 0.07 a0.26 ± 0.01 b47.67 ± 4.26 a
    稻虾共作CR33.26 ± 1.33 b32.42 ± 0.96 b1.54 ± 0.06 a0.36 ± 0.01 a32.33 ± 0.88 b
    氨氧化细菌群落 AOB community
    常规中稻MR34.03 ± 3.22 a33.67 ± 3.22 a1.38 ± 0.05 a 0.3 ± 0.01 a 33 ± 3.51 a
    稻虾共作CR26.13 ± 4.17 a26.00 ± 4.04 a1.32 ± 0.04 a0.32 ± 0.01 a 26 ± 4.04 a
    注(Note):数据为平均值 ± 标准误;同列数据后不同小写字母表示两模式间差异显著 (P < 0.05)。CR—Rice–crayfish culture pattern; MR—Conventional middle rice pattern; values are means ± SD; values followed by different lowercase letters indicate significant difference between the two systems (P < 0.05).
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    表 4  稻虾共作模式和常规中稻模式下土壤AOA amoA基因群落属水平物种组成 (相对丰度 > 0.1%)

    Table 4.  Species composition of AOA amoA gene community at gene levels under integrated rice–crayfish farming system and conventional middle rice system (relative abundance > 0.1%)

    AOA属水平物种
    AOA species at gene levels
    相对丰度Relative abundance (%)
    常规中稻模式Middle rice system稻虾共作模式Cray fishing–rice system
    Nitrososphaera 0.70 0.29
    norank_c_environmental_samples_p_Crenarchaeota11.0125.93
    norank_c_environmental_samples_p_Thaumarchaeota56.7940.96
    norank_p_environmental_samples_k_norank 1.63 2.19
    unclassified_k_norank_d_Archaea29.8230.38
    unclassified_k_norank_d_Bacteria 0.04 0.24
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    表 5  稻虾共作模式和常规中稻模式下土壤AOA属水平群落组成 (F值)

    Table 5.  Community composition of soil AOA genus under integrated rice–crayfish farming system and conventional middle rice system (F-value)

    AOA群落属水平组成
    AOA community composition at the gene levels
    常规中稻模式
    Middle rice system
    稻虾共作模式
    Cray fishing–rice system
    Nitrososphaera219.33 ± 10.65 a100.33 ± 42.46 a
    norank_c_environmental_samples_p_Crenarchaeota3440.67 ± 630.84 b8863 ± 884.41 a
    norank_c_environmental_samples_p_Thaumarchaeota17743.33 ± 337.30 a13997.67 ± 1573.61 a
    norank_p_environmental_samples_k_norank510.67 ± 200.70 a749 ± 239.28 a
    unclassified_k_norank_d_Archaea9316 ± 1257.08 a10381 ± 1575.32 a
    unclassified_k_norank_d_Bacteria14 ± 4.36 a81.67 ± 32.34 a
    unclassified_p_Proteobacteria0.00 ± 0.00 a1.33 ± 1.33 a
    注(Note):数据为平均值 ± 标准误 Values are means ± SD; 同行数据后不同小写字母表示两种模式稻田土壤群落水平差异显著 (P < 0.05) Values followed by different lowercase letters in a row indicate significant difference between the two system fields in different community composition (P < 0.05).
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    表 6  稻虾共作模式和常规中稻模式下土壤AOB属水平群落组成显著性分析 (F值)

    Table 6.  Significant analysis of community composition of soil AOB genus under integrated rice-crayfish farming system and conventional middle rice system (F-value)

    AOB群落属水平组成
    AOB community composition at the gene levels
    常规中稻模式
    Middle rice system
    稻虾共作模式
    Crayfishing–rice system
    environmental_samples_f_Nitrosomonadaceae147.67 ± 123.83 b915.67 ± 240.52 a
    Nitrosomonas50.33 ± 20.30 a492.67 ± 399.85 a
    Nitrosospira328.00 ± 328.00 a10.33 ± 10.33 a
    norank_c_environmental_samples_p_Proteobacteria61.00 ± 61.00 a0.00 ± 0.00 a
    norank_f_environmental_samples13998.67 ± 2197.26 a9480.67 ± 1371.96 a
    norank_o_environmental_samples_c_Betaproteobacteria8497.33 ± 499.03 b12234.67 ± 982.71 a
    unclassified_c_Betaproteobacteria0.00 ± 0.00 a43.33 ± 29.63 a
    unclassified_f_Nitrosomonadaceae1.33 ± 1.33 a65.33 ± 40.92 a
    unclassified_k_norank_d_Bacteria15264.33 ± 1739.02 a11350.67 ± 77.17 a
    unclassified_o_Nitrosomonadales1380.33 ± 892.56 a109 ± 58.43a
    unclassified_p_Proteobacteria10.67 ± 2.90 a48.00 ± 28.93 a
    注(Note):数据为平均值 ± 标准误 Values are means ± SD. 数字后不同小写字母表示两种模式稻田土壤群落水平差异显著 (P < 0.05) Values followed by different lowercase letters indicate significant difference between the two system fields in different community composition (P < 0.05).
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出版历程
  • 收稿日期:  2018-10-27
  • 网络出版日期:  2019-11-20
  • 刊出日期:  2019-11-01

稻虾共作模式下稻田土壤氨氧化微生物丰度和群落结构的特征

    作者简介:王蓉E-mail:WRchangda@163.com
    通讯作者: 金涛, jintao165@126.com
  • 1. 长江大学农学院/湿地生态与农业利用教育部工程研究中心,湖北荆州 434025
  • 2. 湖北省襄阳市农业科学院,湖北襄阳 441057
  • 基金项目: 国家重点研发计划项目(2017YFD0301400);国家重点研发计划项目(2017YFD0800102)。
  • 摘要: 【目的】研究稻虾共作模式下土壤氨氧化微生物数量、群落多样性及群落结构,深入了解该模式下的土壤微生态环境的演变。【方法】试验点在湖北省荆州市长江大学农学院基地,设置稻虾共作模式 (CR) 与常规中稻种植模式 (MR),借助荧光定量PCR技术与Illumina Miseq高通量测序平台,分析了土壤氨氧化细菌 (AOB) 与古菌 (AOA) 丰度、多样性及群落结构。【结果】与MR模式相比,CR模式显著提高了土壤硝态氮、总碳及总氮含量,对土壤pH、碱解氮及土壤碳氮比无显著影响。CR模式土壤AOA与AOB amoA基因拷贝数为3.13 × 105和7.01 × 105 copies/g干土,MR模式土壤AOA、AOB amoA基因拷贝数为1.41 × 105和3.87 × 105 copies/g干土,两个模式土壤AOB的数量均显著高于AOA,CR模式土壤AOA、AOB的数量均显著高于MR模式 (P < 0.05)。α群落多样性指数表明,相比MR,CR模式显著降低了土壤AOA群落多样性,对AOB群落多样性无显著影响。Venn结果分析,CR模式增加了AOA amoA基因的物种,改变了AOB amoA基因的物种组成,且AOB amoA物种数量下降。在属水平上,norank_c_environmental_samples_p_Thaumarchaeotaunclassified_k_norank_d_Archaeanorank_c_environmental_samples_p_Crenarchaeotanorank_p_environmental_samples_k_norank为AOA的优势类群,相对丰度占AOA amoA基因总序列的99.25%~99.46%,CR模式显著提高了norank_c_environmental_samples_p_Crenarchaeota在AOA群落属水平的相对丰度;unclassified_k_norank_d_Bacterianorank_f_environmental_samplesnorank_o_environmental_samples_c_Betaproteobacteriaunclassified_o_Nitrosomonadales为AOB的优势类群,相对丰度共占97.78%~98.49%,且CR模式显著增加了norank_o_environmental_samples_c_Betaproteobacteriaunclassified_o_Nitrosomonadales在AOB群落属水平的相对丰度。冗余分析 (RDA) 结果显示,土壤基本理化性质对于土壤AOA、AOB群落结构影响有着相似的趋势,其中对AOA、AOB群落结构影响最大的因子是硝态氮,其次分别为总碳、铵态氮、碱解氮、pH。根据RDA投影距离分析,稻虾共作模式对土壤AOA群落结构的影响大于AOB,且MR与稻虾共作模式土壤AOB的群落结构具有一定的相似度。【结论】稻虾共作模式显著降低了AOA群落多样性,而对AOB群落无显著影响;稻虾共作模式显著增加了AOA与AOB的丰度并显著影响了群落结构组成。土壤硝态氮、总碳、铵态氮、碱解氮、pH含量是导致土壤微生物数量、多样性及群落结构变化的主要原因。

    English Abstract

    • 土壤是生物圈内发生氮素循环的主要场所,而土壤微生物是推动氮循环过程的主要成员。其中,由微生物所驱动的过程主要包括了固氮作用、氨化作用、硝化作用和反硝化作用四个过程[1-2]。氨氧化作用作为硝化作用的限速步骤,影响着整个硝化作用的进程[3]。因此,大批学者开展了对氨氧化细菌 (ammonia oxidizing bacteria,AOB)与古菌 (ammonia oxidizing archaea,AOA) 的研究工作。稻虾共作是一种利用稻田浅水环境,通过在稻田四周开挖环形沟、加高加固田埂、辅以防逃设施,既种稻又养虾的高效生态种养模式。其共生原理是以废养缺、互利共生、化害为利。稻虾共作的优点主要有以下几个方面[4-6]:一是种养结合、共生互利,小龙虾可食除一些虫草,其粪便能够增加土壤有机质,有利于水稻生产;二是循环安全,稻虾共作减少了化肥、农药的使用量,有效改善了农田生态环境,提高了稻米和小龙虾的品质;三是节约土地、提高收益,稻虾共作可以充分利用低湖冷浸田,提高土地利用率,降低生产成本。当前,我国农业正面临资源与环境约束和农民增收难度加大的难题,稻虾生态种养高效模式的兴起,被农业部誉为“现代农业的一次革命”,在长江中下游地区得到了大面积的推广。

      由于稻虾田常年浸泡,长期处于厌氧或干湿交替的状态,硝化–反硝化作用强烈,显著影响由微生物驱动的土壤氮循环过程,因此稻虾共作模式下土壤微生物的数量、群落多样性及结构对于发展稻虾共作高效生态友好型农业具有重要意义。长期以来,人们一直认为氨氧化作用的主要参与者是氨氧化细菌,后有研究发现氨氧化古菌也参与了氨氧化作用,并且具有与氨氧化细菌相同的氨单加氧酶参与编码的基因amoA,这些研究发现为研究参与土壤氮素的硝化过程微生物提供了新的思路。随着荧光定量PCR、DGGE、高通量测序等分子技术在我国的快速发展,针对氨氧化微生物的研究主要集中在不同类型农田土壤,如酸性红壤、碱性潮土、旱地土壤以及土壤含水量、不同施肥模式与pH等因素下氨氧化细菌与古菌的群落丰度、多样性及群落组成进行了系统的研究[7-8]。其中有研究表明农田环境中AOA的数量远高于AOB的数量[9];He等[10]通过对酸性红壤的研究发现,AOA和AOB在稻田土壤的丰度均与土壤硝化潜势 (PNR) 呈显著正相关关系,且在红壤中AOA的丰度远高于AOB,此外,土壤pH对AOA的结构组成的影响强度高于AOB;有研究发现高氮量化肥的投入可显著增加AOB的数量并改变AOB的群落组成,但对AOA无显著影响[11];杨亚东等[12]研究发现华北平原地区碱性小麦土壤表层AOB比AOA对氮肥的响应更灵敏,且施氮可以显著改变AOB的数量及结构,但对AOA无显著影响;刘若瑄等[13]研究证明相比氨氧化古菌,氨氧化细菌对土壤水分的响应更加显著。

      由于稻虾田土壤长期处于淹水的状态,仅在水稻晒田期出现短期土壤落干情况,导致稻虾田长期浸泡水下形成了特殊的区域小环境,氧化还原过程强烈并显著影响着由微生物驱动的地球生物化学循环。有研究表明[6],稻虾轮作的常年泡水特点加剧了土壤潜育化过程且随着年限的增长,土壤易氧化态有机碳含量高于常规稻田模式。蔡晨等[14]对江汉平原稻虾轮作模式下水稻土的土壤理化性质研究结果显示,长期稻虾轮作可增加土壤pH、氮磷钾等养分。前人对稻虾田间杂草多样性调查的结果显示,稻虾轮作模式下由于龙虾的活动导致稻田杂草发生率下降且降低了杂草的多样性及丰富度[15]。佀国涵等[16]研究结果显示稻虾轮作模式增加了土壤微生物活性及群落多样性。综上所述,稻虾共作模式对土壤环境影响较大,且有研究证实土壤氨氧化微生物对环境因子的响应较大。迄今为止,关于稻虾共作模式的研究主要集中在该模式的生态种养技术、经济效益以及对稻田土壤理化性质的影响等方面[16-17],却鲜有关于稻虾土壤氨氧化微生物方面的研究报道。因此,开展稻虾共作模式下土壤氨氧化微生物群落演变规律的研究对于稻虾共作模式的推广具有重要意义。本研究通过设置常规中稻模式与稻虾共作种养模式,在研究土壤基本理化性质的基础上,借助荧光定量PCR和Illumina Miseq高通量测序平台等分子生物学技术研究土壤氨氧化微生物的基因丰度及群落结构,旨在揭示稻虾共作模式下土壤氨氧化作用的原理,为稻虾共作模式的生态研究和推广提供理论和实际指导,为稻虾共作田间管理提供参考依据。

      • 试验位于江汉平原腹地的湖北省荆州市长江大学农学院试验基地,该地水源充沛,温光资源充足,属典型的亚热带季风性气候。试验地土壤基本理化性质为:pH 7.5、有机质38.8 g/kg、全氮0.75 g/kg、全磷0.54 g/kg、速效钾17.09 mg/kg。试验于2014—2016年连续开展两年,设置常规中稻 (MR)和稻虾共作 (CR) 两种模式,并设置3次重复,试验田呈矩形,长12 m、宽5 m。供试水稻品种为“隆两优华占”,小龙虾品种为克氏原鳌虾 (Procambarus clarkii)。所施肥料为尿素 (N 46%)、过磷酸钙 (P2O5 12%)和氯化钾 (K2O 60%),年均纯养分施用量为N 180 kg/hm2、P2O5 75 kg/hm2、K2O 105 kg/hm2。氮肥按基肥∶蘖肥 为6∶4施用,磷肥全部基施,钾肥按基肥∶追肥为5∶5施用。常规中稻模式稻作期田间前期灌水、中期短暂晒田、后期覆水。稻虾共作模式稻作期为每年6月至9月,9月底水稻收获后覆水泡田养虾。虾苗按15 × 104~20 × 104 只/hm2的密度于水稻收获后投放,次年4月中下旬至6月上旬捕捞成虾,捕虾完成后进行下一季水稻种植,如此循环往复。两种模式下的水稻秸秆全量还田,其他田间管理措施完全相同。

      • 土壤样品采集分为两部分。一部分用土钻在田间选取5点采集土样并混合 (5点采样法),存放备土壤基本理化性质测定使用。将土样去除根系、石子等杂物在阴凉处风干,磨碎后过8 mm铁筛,用于土壤全氮、全碳、碱解氮及pH的测定。另外一部分土壤用于土壤微生物的测定,土壤微生物样品于2016年水稻抽穗期采集。需在采样时用谷物采样器采集0—10 cm表层土,去除土壤根系、石子及其他杂物,即刻用锡箔纸包裹好土样,放入液氮带回实验室,存放于−80℃冰箱待测定。

      • 土壤基本理化性质测定参考鲍士旦第三版《土壤农化分析》。土壤全氮、全碳使用元素分析仪 (ECS4024,Costech,Italy) 测定;碱解氮测定采用碱解扩散法;土壤硝态氮、铵态氮含量采用2 mol/L KCl溶液浸提,流动分析仪 (AA3,BRAN + LUEBBE,德国) 测定;pH采用电位法 (水∶土 = 2.5∶1) 测定。

      • 土壤总DNA利用DNA试剂盒 (PowerSoil® DNA Isolation Kit,Mobio,USA) 进行提取。取经−80℃低温保存的土壤鲜样0.25 g,用1%琼脂糖凝胶电泳检测总DNA,提取的DNA的浓度与纯度用NanoDrop ND-1000UVevis分光光度计 (ThermoScientific,Rockwood,TN,USA) 检测。参照电泳检测结果,将PCR产物采用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统,在ABI7500荧光定量PCR仪 (ABI,CA,USA) 上进行定量检测。选取不同的特异性引物对AOA amoA、AOB amoA基因进行PCR扩增,所用的引物序列及扩增所用的体系如表1所示。

        表 1  荧光定量PCR扩增引物及反应程序[11]

        Table 1.  Real-time PCR amplification of primers and reaction procedures

        目标基因
        Target gene
        引物
        Primer
        引物序列
        Sequence
        PCR反应条件
        PCR condition
        AOAArch-amoAF Arch-amoARSTAATGGTCTGGCTTAGACGGCGGCCATCCATCTGTATGTPCR反应体系为20 μL,包括,10 μL 2 × syberMIX (with ROX),0.2 μL两种上、下游引物 (10 μmol/L),1 μL稀释8倍后的样品,用RNase-Free ddH2O补足至20 μL。程序设置:95℃/2 min;95℃/10 s,53℃/34 s,72℃/32 s,共40个循环。
        The PCR was carried out in a reaction volume of 20 μL. Include:10 μL 2 × syberMIX (with ROX),0.2 μL Forward Primer (10 μM),0.2 μL Reverse Primer (10 μM),the 1 μL sample was diluted 8-fold,RNase-Free ddH2O up to 20 μL. The PCR cycling conditions were as follows:95℃ 2 min; 95℃ 10 s,53℃ 34 s,72℃ 32 s,40 cycles.
        AOBamoA-1F amoA-2RGGGGTTTCTACTGGTGGTCCCCTCKGSAAAGCCTTCTTCPCR反应体系为20 μL,包括,10 μL 2 × syberMIX (with ROX),0.2 μL两种上、下游引物 (10 μmol/L),1 μL稀释8倍后的样品,用RNase-Free ddH2O补足至20 μL。程序设置:95℃/2 min;95℃/10 s,55℃/34 s,72℃/32 s,共40个循环。
        The PCR was carried out in a reaction volume of 20 μL. Include:10 μL 2 × syberMIX (with ROX),0.2 μL Forward Primer (10 μM),0.2 μL Reverse Primer (10 μM),the 1 μL sample was diluted 8-fold,RNase-Free ddH2O up to 20 μL. The PCR cycling conditions were as follows:95℃ 2 min; 95℃ 10 s,55℃ 34 s,72℃ 32 s,40 cycles.
      • 所用的样品均参照正式实验的条件进行,每个样品采用3次重复,同一样本的混合PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测,PCR产物回收采用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒进行切胶,TrisHCL洗脱,检测采用2%琼脂糖凝胶电泳进行。

      • PCR产物回收后测定其浓度,之后根据每个样本测序量的要求,将两种模式的样品混匀,使各模式用于测序的样品DNA浓度保持一致,双末端测序采用Illumina Miseq测序平台进行,本试验的测序工作委托上海美吉生物医药科技公司完成。

        首先根据PE reads之间的overlap关系,将成对的reads拼接为一条序列,同时对reads的质量和merge的效果进行质控过滤,有效序列可依据序列首位两端的barcode和引物序列来区分样品得到,将序列方向进行校正,得到优化数据。

        操作分类单元 (operational taxonomic units,OTU) 是在系统发生学或群体遗传学研究中,为了便于进行分析人为给某一个分类单元 (品系,属,种、分组等) 设置的同一标志。要了解一个样本测序结果中的菌种、菌属等数目信息,就需要对序列进行归类操作 (cluster)。通过归类操作,将序列按照彼此的相似性分归为许多小组,一个小组即一个OTU。可根据不同的相似度水平,对所有序列进行OTU划分,通常在97%相似水平下的OTU进行生物信息统计分析。使用软件Usearch7.1平台,按照97%相似性对非重复序列 (不含单序列) 进行OTU聚类,在聚类过程中去除嵌合体,得到OTU的代表序列。基于OTU分类可进行α多样性分析与β分析。采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分析,得到对应的每个OTU的物种分类信息,并分别在domain (域)、kingdom (界)、phylum (门)、class (纲)、order (目)、family (科)、genus (属)、species (种) 各个分类水平下统计样本的群落组成。

      • 采用软件SPSS22.0对土壤基本理化性质、AOA和AOB amoA基因拷贝数以及群落α多样性指数 (Shannon、ACE、Chao1、Simpson以及Sobs) 进行单因素方差分析与Personal相关性分析。使用R软件工具制作群落柱形图、Venn图。采用CANOCO 5.0 软件对土壤理化性质和AOA,AOB amoA基因群落结构进行冗余分析 (redundancy analysis,RDA)。

      • 常规中稻模式与稻虾共作模式下的土壤理化性质如表2所示。方差分析结果表明,稻虾模式改变了部分土壤理化性质。其中,稻虾共作模式下的土壤全碳、全氮、硝态氮含量均显著高于常规中稻模式,碱解氮含量与铵态氮含量均高于常规中稻模式,差异不显著 (P > 0.05);稻虾共作模式下C/N与pH低于常规中稻模式,差异不显著 (P > 0.05)。研究结果表明,相比常规中稻种植模式,稻虾共作显著增加了土壤硝态氮、全碳、全氮含量,对碱解氮、C/N及pH没有显著影响。

        表 2  稻虾共作和常规中稻模式稻田土壤理化性质

        Table 2.  Physicochemical properties in paddy fields under integrated rice–crayfish farming and conventional middle rice systems

        模式
        System
        pH碱解氮
        Alk.-hydr. N
        (mg/kg)
        硝态氮
        NO3-N
        (mg/kg)
        铵态氮
        NH4+-N
        (mg/kg)
        全碳
        Total C
        (g/kg)
        全氮
        Total N
        (g/kg)
        碳氮比
        C/N
        常规中稻MR7.47 ± 0.07 a136.17 ± 8.19 a0.31 ± 0.03 b13.61 ± 3.41 a18.16 ± 0.18 b1.86 ± 0.01 b9.78 ± 0.12 a
        稻虾共作CR7.41 ± 0.15 a141.28 ± 3.59 a0.40 ± 0.01 a19.84 ± 4.01 a18.59 ± 0.14 a1.94 ± 0.02 a9.58 ± 0.10 a
        注(Note):数据为平均值 ± 标准误;同列数据后不同小写字母表示两模式间差异显著 (P < 0.05)。MR—Conventional middle rice pattern; CR—Rice–crayfish culture pattern; values are means ± SD; values followed by different lowercase letters indicate significant difference between the two systems (P < 0.05).
      • Ace指数、Chao指数、Sobs指数反映了群落的丰富度,指数值越大表示群落丰富度越高。从表3可知,常规中稻模式Ace指数、Chao指数、Sobs指数依次为49.79、49.53、47.67,稻虾共作模式依次为33.26、32.42、32.33,单因素方差分析表明,稻虾共作模式AOA群落三个指数均显著低于常规中稻模式 (表3)。Shannon指数和Simpson指数反映群落的多样性,Shannon指数值越高,表示群落多样性越高,而Simpson指数值越高,表示群落多样性越低。稻虾共作模式AOA的Shannon指数 (1.54)与常规中稻模式 (1.73) 差异不显著,但是稻虾共作模式的Simpson指数 (0.36) 显著高于常规中稻模式 (0.26)。表明较常规中稻模式,稻虾共作模式显著降低了稻田土壤AOA群落丰富度及群落多样性。

        表 3  稻虾共作模式和常规中稻模式土壤氨氧化微生物群落α多样性指数

        Table 3.  Alpha diversity indices of soil ammonia oxidizers in integrated rice–crayfish farming systemand conventional middle rice system

        模式
        System
        Ace指数
        Ace index
        Chao指数
        Chao index
        Shannon指数
        Shannon index
        Simpson指数
        Simpson index
        Sobs指数
        Sobs index
        氨氧化古菌群落 AOA community
        常规中稻MR49.79 ± 4.00 a49.53 ± 4.02 a1.73 ± 0.07 a0.26 ± 0.01 b47.67 ± 4.26 a
        稻虾共作CR33.26 ± 1.33 b32.42 ± 0.96 b1.54 ± 0.06 a0.36 ± 0.01 a32.33 ± 0.88 b
        氨氧化细菌群落 AOB community
        常规中稻MR34.03 ± 3.22 a33.67 ± 3.22 a1.38 ± 0.05 a 0.3 ± 0.01 a 33 ± 3.51 a
        稻虾共作CR26.13 ± 4.17 a26.00 ± 4.04 a1.32 ± 0.04 a0.32 ± 0.01 a 26 ± 4.04 a
        注(Note):数据为平均值 ± 标准误;同列数据后不同小写字母表示两模式间差异显著 (P < 0.05)。CR—Rice–crayfish culture pattern; MR—Conventional middle rice pattern; values are means ± SD; values followed by different lowercase letters indicate significant difference between the two systems (P < 0.05).

        表3中AOB结果可知,常规中稻模式的Ace指数、Chao指数、Sobs指数依次为34.03、33.67、33.00,稻虾共作模式依次为26.13、26.00、26.00,两模式AOB多样性指数单因素方差分析差异均不显著。稻虾共作模式的Shannon指数和Simpson指数与常规中稻模式差异均不显著,表明稻虾共作模式对稻田土壤AOB微生物群落丰富度及群落多样性均没有显著影响。

      • AOA和AOB amoA基因定量分析结果显示,稻虾共作模式AOA和AOB的amoA基因丰度分别为3.13 × 105和7.01 × 105 copies/g干土,常规中稻模式的AOA和AOB的amoA基因丰度分别为1.41 × 105和3.87 × 105 copies/g干土,稻虾共作模式AOA和AOB的amoA基因丰度均显著高于常规中稻模式 (P < 0.05) (图1),且在两种模式中,AOB amoA的基因丰度高于AOA amoA的基因丰度。

        图  1  稻虾共作模式和常规中稻模式土壤AOA amoA和AOB amoA基因丰度

        Figure 1.  Abundance of AOA amoA and AOB amoA in integrated rice-crayfish farming system and conventional middle rice systme

      • 对AOA amoA基因物种水平进行Venn分析 (图2),稻虾共作模式和常规中稻模式共有14个相同的物种,其中稻虾共作模式独有物种3个,稻虾共作模式增加了稻田土壤中AOA amoA基因物种种类,增加了AOA物种种类。AOB amoA基因物种水平Venn分析 (图2) 结果显示,稻虾共作模式和常规中稻模式共有10个相同的物种,其中稻虾共作模式独有物种3个,常规中稻模式独有物种4个,两种模式共有不同的物种7个,占两种模式物种总数的41.18%,占相同物种总数的70%。稻虾共作模式改变了稻田土壤中AOB amoA基因的物种组成,减少了AOB amoA物种数目。

        图  2  稻虾共作模式和常规中稻模式土壤AOA amoA和AOB amoA基因微生物物种分类学组成Venn图

        Figure 2.  Venn drawings of AOA amoA and AOB amoA gene species taxonomy of rice-crayfish farming system and conventional middle rice system

      • 样品获得的AOA amoA基因微生物物种分类在3个域、3个界、7个门、8个纲、8个目、8个科、8个属和17个种。将无法分类的序列定义为无法归类,样品获得的AOA amoA基因OTUs在分类学域、界、门、纲、目、科、属、种水平上可归类比例为94.1%、88.2%、76.5%、76.5%、76.5%、76.5%、76.5%和52.9%。

        在属水平,常规中稻模式具有5个相对丰度大于0.1%的菌属 (表4),按相对丰度从高至低依次是norank_c_environmental_samples_p_Thaumarchaeota (56.79%)、unclassified_k_norank_d_Archaea (29.82%)、norank_c_environmental_samples_p_Crenarchaeota (11.01%)、norank_p_environmental_samples_k_norank (1.63%)、Nitrososphaera (0.7%)。稻虾共作模式具有6个相对丰度大于0.1%的属 (表4),按相对丰度从高至低依次是norank_c_environmental_samples_p_Thaumarchaeota (40.96%)、unclassified_k_norank_d_Archaea (30.38%)、norank_c_environmental_samples_p_Crenarchaeota (25.93%)、norank_p_environmental_samples_k_norank (2.19%)、unclassified_k_norank_d_Bacteria (0.24%)、Nitrososphaera (0.29%)。对AOA属水平上相对丰度大于0.1%的群落物种进行显著性分析 (表5),结果显示norank_c_environmental_samples_p_Crenarchaeota在稻虾共作模式中的相对丰度显著高于常规中稻模式 (P < 0.05)。

        表 4  稻虾共作模式和常规中稻模式下土壤AOA amoA基因群落属水平物种组成 (相对丰度 > 0.1%)

        Table 4.  Species composition of AOA amoA gene community at gene levels under integrated rice–crayfish farming system and conventional middle rice system (relative abundance > 0.1%)

        AOA属水平物种
        AOA species at gene levels
        相对丰度Relative abundance (%)
        常规中稻模式Middle rice system稻虾共作模式Cray fishing–rice system
        Nitrososphaera 0.70 0.29
        norank_c_environmental_samples_p_Crenarchaeota11.0125.93
        norank_c_environmental_samples_p_Thaumarchaeota56.7940.96
        norank_p_environmental_samples_k_norank 1.63 2.19
        unclassified_k_norank_d_Archaea29.8230.38
        unclassified_k_norank_d_Bacteria 0.04 0.24

        表 5  稻虾共作模式和常规中稻模式下土壤AOA属水平群落组成 (F值)

        Table 5.  Community composition of soil AOA genus under integrated rice–crayfish farming system and conventional middle rice system (F-value)

        AOA群落属水平组成
        AOA community composition at the gene levels
        常规中稻模式
        Middle rice system
        稻虾共作模式
        Cray fishing–rice system
        Nitrososphaera219.33 ± 10.65 a100.33 ± 42.46 a
        norank_c_environmental_samples_p_Crenarchaeota3440.67 ± 630.84 b8863 ± 884.41 a
        norank_c_environmental_samples_p_Thaumarchaeota17743.33 ± 337.30 a13997.67 ± 1573.61 a
        norank_p_environmental_samples_k_norank510.67 ± 200.70 a749 ± 239.28 a
        unclassified_k_norank_d_Archaea9316 ± 1257.08 a10381 ± 1575.32 a
        unclassified_k_norank_d_Bacteria14 ± 4.36 a81.67 ± 32.34 a
        unclassified_p_Proteobacteria0.00 ± 0.00 a1.33 ± 1.33 a
        注(Note):数据为平均值 ± 标准误 Values are means ± SD; 同行数据后不同小写字母表示两种模式稻田土壤群落水平差异显著 (P < 0.05) Values followed by different lowercase letters in a row indicate significant difference between the two system fields in different community composition (P < 0.05).

        样品获得的AOB amoA基因微生物物种分类在1个域、1个界、2个门、4个纲、6个目、8个科、11个属和17个种。将无法分类的序列定义为无法归类,样品获得的AOB amoA基因OTUs在分类学域、界、门、纲、目、科、属、种水平上可归类比例为100%、100%、94.1%、88.2%、82.4%、76.5%、70.6%和41.2%。

        在属水平上,常规中稻模式有8个相对丰度大于0.1%的菌属 (图3),相对丰度的大小从高到低依次是unclassified_k_norank_d_Bacteria (38.41%)、norank_f_environmental_samples (35.23%)、norank_o_environmental_samples_c_Betaproteobacteria (21.38%)、unclassified_o_Nitrosomonadales (3.47%)、Nitrosospira (0.37%)、environmental_samples_f_Nitrosomonadaceae (0.15%)、norank_c_environmental_samples_p_Proteobacteria、Nitrosomonas (0.13%)。稻虾共作模式中有10个相对丰度大于0.1%的优势菌属 (图3),相对丰度的大小从高到低依次为norank_o_environmental_samples_c_Betaproteobacteria (35.21%)、unclassified_k_norank_d_Bacteria (32.66%)、norank_f_environmental_samples (27.28%)、environmental_samples_f_Nitrosomonadaceae (2.63%)、Nitrosomonas (1.42%)、unclassified_o_Nitrosomonadales (0.31%)、unclassified_f_Nitrosomonadaceae (0.19%)、unclassified_p_Proteobacteria (0.14%)、unclassified_c_Betaproteobacteria (0.12%)。对AOB属水平上相对丰度大于 > 0.1%的群落物种进行显著性分析 (表6),结果显示稻虾共作模式中environmental_samples_f_Nitrosomonadaceaenorank_o_environmental_samples_c_Betaproteobacteria的相对丰度显著高于常规中稻模式 (P < 0.05)。

        图  3  稻虾共作模式和常规中稻模式下土壤AOB amoA基因群落属水平组成 (相对丰度 > 0.1%)

        Figure 3.  Genus distribution of AOB amoA gene community in fields under rice–crayfish farming system (CR) and conventional middle rice system (MR) (relative abundance > 0.1%)

        表 6  稻虾共作模式和常规中稻模式下土壤AOB属水平群落组成显著性分析 (F值)

        Table 6.  Significant analysis of community composition of soil AOB genus under integrated rice-crayfish farming system and conventional middle rice system (F-value)

        AOB群落属水平组成
        AOB community composition at the gene levels
        常规中稻模式
        Middle rice system
        稻虾共作模式
        Crayfishing–rice system
        environmental_samples_f_Nitrosomonadaceae147.67 ± 123.83 b915.67 ± 240.52 a
        Nitrosomonas50.33 ± 20.30 a492.67 ± 399.85 a
        Nitrosospira328.00 ± 328.00 a10.33 ± 10.33 a
        norank_c_environmental_samples_p_Proteobacteria61.00 ± 61.00 a0.00 ± 0.00 a
        norank_f_environmental_samples13998.67 ± 2197.26 a9480.67 ± 1371.96 a
        norank_o_environmental_samples_c_Betaproteobacteria8497.33 ± 499.03 b12234.67 ± 982.71 a
        unclassified_c_Betaproteobacteria0.00 ± 0.00 a43.33 ± 29.63 a
        unclassified_f_Nitrosomonadaceae1.33 ± 1.33 a65.33 ± 40.92 a
        unclassified_k_norank_d_Bacteria15264.33 ± 1739.02 a11350.67 ± 77.17 a
        unclassified_o_Nitrosomonadales1380.33 ± 892.56 a109 ± 58.43a
        unclassified_p_Proteobacteria10.67 ± 2.90 a48.00 ± 28.93 a
        注(Note):数据为平均值 ± 标准误 Values are means ± SD. 数字后不同小写字母表示两种模式稻田土壤群落水平差异显著 (P < 0.05) Values followed by different lowercase letters indicate significant difference between the two system fields in different community composition (P < 0.05).
      • 稻田土壤AOA微生物菌属与土壤理化性质冗余分析结果显示 (图4a),对AOA微生物群落结构影响最大的是硝态氮 (R2 = 0.8073),其次是总碳 (R2 = 0.8038),影响顺序为硝态氮 > 总碳 > 铵态氮 > 碱解氮 > pH。RDA分析的前两个轴共解释了94.58%的群落变化,第一个轴解释了62.20%,第二个轴解释了32.38%。沿第一轴观察,常规中稻模式与稻虾共作模式在第一轴的正投影相距很远,表明稻虾共作模式对稻田土壤AOA群落结构影响较大。

        图  4  AOA和AOB群落结构与土壤理化性质的冗余分析

        Figure 4.  Redundancy analysis (RDA) between AOA and AOB community structures and soil properties

        对稻田土壤AOB微生物菌属和土壤理化性质进行RDA分析 (图4b),结果表明对AOB微生物群落结构影响最大的是硝态氮 (R2 = 0.9057),其次是总碳 (R2 = 0.8387),影响顺序为硝态氮 > 总碳 > 铵态氮 > 碱解氮 > pH。RDA分析的前两个轴共解释了95.04%的群落变化,第一个轴解释了74.62%,第二个轴解释了20.42%。沿第一轴观察,MR2、MR3与CR1、CR2在第一轴的正投影相距很远,MR1与CR3位置较近,表明稻虾共作模式对稻田土壤AOB的群落结构有一定的改变,但稻虾共作与常规稻田的AOB群落结构仍保持着一定的相似性。

      • 有研究表明[14],长期稻虾轮作有助于改善耕层土壤结构、增强土壤缓冲能力和提高pH及氮、磷、钾等速效养分含量。本研究结果表明,与常规中稻模式相比,稻虾共作模式下土壤碱解氮、硝态氮、铵态氮、全氮、全碳含量有所增加,其原因可能是稻虾共作模式下,投供小龙虾食用的水草、小龙虾排泄的粪便在微生物与分解酶的驱动下为土壤提供了丰富的碳源与氮源,另外小龙虾的打洞行为对土壤的物理结构产生影响。

      • AOA和AOB是影响土壤氮素循环的关键微生物,控制着土壤氨氧化反应的进行,直接影响着土壤肥力及土壤N2O的排放情况。前人研究表明,在中性及碱性土壤中,施肥尤其是大量氮肥的投入可明显增加AOB的数量[10, 18]。杨亚东等[7]研究结果显示,施氮肥显著增加了华北平原地区麦田土壤AOB的数量,但对AOA无明显影响。解开治等[19]研究表明,有机无机配肥可提高酸性冷浸田土壤AOB数量。大量的研究说明土壤肥力情况与AOA、AOB的数量之间有着紧密的关系。贺纪正等[1, 20]在土壤氮素转化的关键微生物机制中曾表明土壤pH是影响氨氧化古菌和细菌组成分布的主要驱动因子之一。本研究土壤属于偏碱性土壤,更适宜AOB的生长。研究发现,在长期不同施肥模式下的酸性水稻土中,AOA的基因丰度变化相比AOB更加明显,而AOA在酸性土壤中的活性表现的更加突出[21]。同时在森林土壤、茶园等酸性土壤中,AOA的存在更能说明其在酸性土壤中,其活性与数量要高于AOB[22-24]。根据我国酸性茶园土壤的调查研究发现,AOA与AOB的比值随着pH值的升高呈下降趋势,同时表明AOB相比AOA更易被pH值影响[25]。本研究中,不同种植模式中AOB的数量均显著高于AOA,稻虾共作模式中AOB与AOA的比值为2.24,常规中稻模式中AOB与AOA的比值为2.74,与前人的研究结果一致,进一步证实了偏碱性的土壤更适合AOB的生长[26-28]。NH3的氧化是氨氧化微生物生长的唯一能量来源,在偏碱性的土壤中,铵能够解离出的NH3浓度较高,更有利于对NH3具有相对较低亲和力的AOB生长[29]。因此,偏碱性的pH值条件及其他环境因子决定了两种模式的稻田土壤的氨氧化微生物的AOB的丰度优势。结果分析表明稻田AOB的数量显著高于AOA,说明该地区稻田土壤中AOB在氨氧化过程中起主导作用,且稻虾共作模式下,土壤AOA与AOB的含量均高于常规中稻模式。李虎等[30]研究表明土壤硝态氮是影响AOA和AOB丰度的主要环境因素之一;邱珊莲等[31]通过鸡粪堆肥试验研究得出硝态氮浓度与氨氧化微生物的丰度有着密切的联系,因此硝态氮含量是影响氨氧化细菌与古菌数量差异的原因。本研究中,稻虾共作模式下土壤硝态氮含量高于常规中稻模式,因此硝态氮含量可能是导致稻虾共作模式与中稻种植模式间AOA与AOB数量差异的原因。

      • 景晓明[32]研究发现长期施肥对黄泥田水稻土壤AOA和AOB群落多样性影响不显著,而方宇等[33]研究表明,长期单施化肥提高了土壤AOA的多样性,而有机无机肥配施降低了AOA的多样性;本研究结果显示,稻虾共作模式下稻田土壤AOA群落多样性发生显著变化,然而AOB群落多样性无明显变化。解开治等[34]研究表明,硝态氮、总氮、温度、亚硝态氮这4个环境因子对氨氧化古菌群落结构演替及群落多样性的影响最为显著;Auguet等[35]研究表明,氨氧化过程中硝态氮含量的变化会导致AOA丰度及多样性的变化。因此,稻虾共作模式稻田土壤中硝态氮含量和全氮的含量的增加可能是土壤AOA群落多样性及群落结构发生显著性改变的主要原因。AOB由于较适应这种偏碱性的环境[36],对NH3具有较低的亲和力,受铵态氮的含量影响较大,铵态氮没有显著变化,其多样性指数及群落结构无显著变化。由于本研究只是针对短期稻虾共作土壤的研究,土壤微生物群落多样性在长期进行稻虾共作的环境条件下的演变趋势仍有待进一步的研究论证。

      • 目前,对于稻虾共作中的土壤物理化学性质的研究较多,然有关稻虾共作模式对水稻土壤AOA与AOB群落结构影响的研究报道尚为不多。本研究结果表明稻虾共作模式显著改变了norank_c_environmental_samples_p_Crenarchaeotaenvironmental_samples_f_Nitrosomonadaceaenorank_o_environmental_samples_c_Betaproteobacteria菌属分别在AOA与AOB属水平群落结构中的相对丰度,导致AOA与AOB的群落结构在属水平上存在差异,且对AOB群落组成的影响强于AOA群落结构,这些差异可能是土壤类型或特定的稻田环境本身所决定的。前人研究表明,土壤pH[37]、土壤类型[38]以及NH3浓度[39]均可影响氨氧化微生物的群落结构。已有大量研究证实,碱性土壤背景有助于AOB群落的生长,酸性土壤条件下则AOA表现得更为活跃,在本研究中,土壤pH值处于7.4~7.5之间,属于中碱性土壤,这从一方面证实稻虾共作引起AOB群落差异且强度高于AOA的原因。研究显示[40],pH不是决定土壤中AOA和AOB生态位分离的唯一主要因素,同时氨浓度被认为是决定酸性与碱性土壤中AOA和AOB不同生态位的定义的关键因素。有研究报道在低pH的土壤背景下,铵能够解离的NH3越少却更加适应AOA的生长,相反AOB的生长活性会随着NH3浓度的升高而增长[39, 41]。小龙虾在养殖过程会有打洞爬行等扰动行为,可加速土壤的转化并增加土壤中的氧气,而稻虾田中小龙虾产生的粪便、虾壳等可为土壤提供有效的养分,提高NH3的含量,从而有助于AOB的生长,然而对AOA群落结构的影响小于AOB。另外,大量研究表明,氨氧化微生物的群落结构与土壤基本理化性质之间有紧密的联系[42-43],经过RDA分析结果发现,土壤理化性质对AOA与AOB的微生物群落结构的影响趋势相同,其中硝态氮对AOA、AOB微生物群落结构影响最大,其次是总碳、铵态氮、碱解氮与pH。这说明稻虾共作对土壤氨氧化微生物的群落结构具有一定的影响。虽然土壤理化性质对氨氧化微生物的群落结构影响存在一定的差异,但对于总体的变化还是一致的,证明土壤理化性质与氨氧化微生物的群落的变化有直接的联系。

      • 1) 稻虾共作模式对水稻土壤基本理化性质有一定的影响。在常规中稻种植模式与稻虾共作模式中,稻虾共作模式显著提高了土壤硝态氮、总碳及总氮的含量,对土壤碳氮比、碱解氮、pH无显著影响。

        2) 相比常规中稻种植模式,稻虾共作模式显著增加了稻田土壤氨氧化细菌与古菌的数量,AOA与AOB的数量分别增加了2.2倍与1.8倍,此外,在常规中稻模式与稻虾共作模式下,氨氧化细菌的数量均显著高于氨氧化古菌。

        3) 较常规中稻种植模式,稻虾共作模式对稻田土壤氨氧化细菌α群落多样性无显著影响,但显著降低了土壤氨氧化古菌的α群落多样性指数。

        4) 稻虾共作模式显著改变了稻田土壤氨氧化细菌与古菌的群落组成与结构。经RDA分析,硝态氮与土壤氨氧化微生物的数量、群落多样性及结构间存在极显著正相关关系,是影响群落变化的环境主效因子。

    参考文献 (43)

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