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激光剥蚀–电感耦合等离子体质谱分析缺锌胁迫玉米根尖微量元素空间分布

张金尧 宋书会 郭伟 徐芳森 汪洪

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激光剥蚀–电感耦合等离子体质谱分析缺锌胁迫玉米根尖微量元素空间分布

    作者简介: 张金尧 E-mail:jinyaozhang0226@163.com;
    通讯作者: 汪洪, E-mail:wanghong01@caas.cn
  • 基金项目: 国家重点研发计划项目(2016YFD0200108);中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(Y2019PT20-04、1610132018034、Y2018PT38 和 2060302-03-720-69)。

Distribution of trace metals in maize (Zea mays L.) root tips under zinc deficiency using laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry

    Corresponding author: WANG Hong, E-mail:wanghong01@caas.cn
  • 摘要: 【目的】激光剥蚀−电感耦合等离子体质谱 (laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry,LA-ICP-MS) 法是一种利用聚焦激光扫描激发固体样品,并经电感耦合等离子体质谱离子化,以分析样品元素含量及分布的新兴技术。本文利用LA-ICP-MS技术研究缺锌 (Zn) 胁迫下玉米根尖铁 (Fe)、锰 (Mn)、铜 (Cu)、Zn元素的分布定位,以期从组织水平揭示作物中Zn的转运富集规律及缺Zn对微量金属元素吸收转运的影响。【方法】以玉米‘郑单958’为试材,用不同加锌浓度营养液进行培养,获得根系样品烘干后磨碎、混匀、压片,取适量混匀的根系样品消煮,利用液体进样系统ICP-MS检测得到样品中实际元素含量,并与样品压片LA-ICP-MS检测信号值间进行线性回归分析,标准曲线相关性良好 (R2 = 0.9995),从而获得可适用于LA-ICP-MS定量分析的自制根系标准样品。将此标准样品与待测根尖样品放入LA样品池中,13C作为内标元素,进行缺锌胁迫下玉米根尖中锌元素分布特征的定量成像研究。【结果】缺锌胁迫下玉米根系锌元素含量显著降低,仅为正常植株的27.78%;缺锌根系中Mn和Cu含量升高。LA-ICP-MS系统定量成像显示,玉米根尖顶端Zn含量较高,由表皮向内锌含量逐渐增加;缺Zn处理根系Zn含量降低,根尖顶端Zn分布明显减少。利用LA-ICP-MS检测信号强度值对Fe、Mn、Cu元素进行定性分布,成像显示在正常根系中Fe、Mn、Cu元素在根尖前端信号强度较高,由表向内逐渐增加;缺锌处理下,根系中Fe、Mn、Cu信号强度均有不同程度增加。【结论】正常施锌玉米根尖中锌、铁、锰、铜分布呈现由表皮向中柱增加的趋势;缺锌胁迫下根系锌含量显著降低,铁、锰、铜均有不同程度积累。
  • 图 1  根系自制样品压片标样及柑橘叶内标13C信号稳定性

    Figure 1.  Signal stability of 13C in self-made root standard samples and citrus leaves

    图 2  自制根系压片标准样品LA-ICP-MS测定标准曲线

    Figure 2.  Standard curve of root samples measured usingLA-ICP-MS

    图 3  正常 (A) 及缺锌胁迫下 (B) 根尖微量金属元素分布

    Figure 3.  Distribution of microelements in root tips under normal (A) and zinc deficiency (B) conditions

    表 1  LA-ICP-MS检测参数

    Table 1.  Optimized experimental parameters of LA-ICP-MS

    LA参数Parameters of laser ablation system ICP-MS参数Parameters of ICP-MS
    激光波长Wavelength of laser (nm) 213 冷却气流速Cool gas (L/min) 15
    束斑大小Spot diameter (μm) 80 载气流速Carrier gas (L/min) 0.90
    线扫速度Scan speed (μm/s) 20 射频功率RF power (W) 1550
    线扫间隔Distance between lines (μm) 100 采集时间Acquisition time (s) 60
    脉冲频率Repetition frequency (Hz) 20 元素及同位素Isotopes 13C、66Zn、56Fe、55Mn、63Cu
    输出能量Energy output 50%
    脉冲能量Pulse energy (mJ) 0.03
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    表 2  缺锌胁迫下根系微量金属元素含量 (n = 6)

    Table 2.  Trace element content in the root under Zn deficiency

    锌处理浓度 (μmol/L)
    Zn concentration
    根系元素含量Element content in root (mg/kg)
    Zn Fe Mn Cu
    0 19.90 ± 4.97 a 5040.78 ± 272.27 a 141.46 ± 5.51 b 9.37 ± 0.48 b
    1 71.63 ± 12.63 b 4536.05 ± 296.16 a 33.78 ± 7.95 a 4.84 ± 0.99 a
    注(Note):同列数据后不同字母表示不同锌处理间差异显著 (P < 0.05) Different letters after values in the same column indicate significant difference between two Zn concentrations (P < 0.05).
    下载: 导出CSV
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出版历程
  • 收稿日期:  2018-10-24
  • 网络出版日期:  2019-10-30
  • 刊出日期:  2019-10-01

激光剥蚀–电感耦合等离子体质谱分析缺锌胁迫玉米根尖微量元素空间分布

    作者简介:张金尧 E-mail:jinyaozhang0226@163.com
    通讯作者: 汪洪, wanghong01@caas.cn
  • 1. 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所/农业农村部植物营养与肥料重点实验室/农业农村部农产品质量安全肥料源性因子风险评估实验室 (北京),北京 100081
  • 2. 华中农业大学资源与环境学院,湖北武汉 430070
  • 基金项目: 国家重点研发计划项目(2016YFD0200108);中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(Y2019PT20-04、1610132018034、Y2018PT38 和 2060302-03-720-69)。
  • 摘要: 【目的】激光剥蚀−电感耦合等离子体质谱 (laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry,LA-ICP-MS) 法是一种利用聚焦激光扫描激发固体样品,并经电感耦合等离子体质谱离子化,以分析样品元素含量及分布的新兴技术。本文利用LA-ICP-MS技术研究缺锌 (Zn) 胁迫下玉米根尖铁 (Fe)、锰 (Mn)、铜 (Cu)、Zn元素的分布定位,以期从组织水平揭示作物中Zn的转运富集规律及缺Zn对微量金属元素吸收转运的影响。【方法】以玉米‘郑单958’为试材,用不同加锌浓度营养液进行培养,获得根系样品烘干后磨碎、混匀、压片,取适量混匀的根系样品消煮,利用液体进样系统ICP-MS检测得到样品中实际元素含量,并与样品压片LA-ICP-MS检测信号值间进行线性回归分析,标准曲线相关性良好 (R2 = 0.9995),从而获得可适用于LA-ICP-MS定量分析的自制根系标准样品。将此标准样品与待测根尖样品放入LA样品池中,13C作为内标元素,进行缺锌胁迫下玉米根尖中锌元素分布特征的定量成像研究。【结果】缺锌胁迫下玉米根系锌元素含量显著降低,仅为正常植株的27.78%;缺锌根系中Mn和Cu含量升高。LA-ICP-MS系统定量成像显示,玉米根尖顶端Zn含量较高,由表皮向内锌含量逐渐增加;缺Zn处理根系Zn含量降低,根尖顶端Zn分布明显减少。利用LA-ICP-MS检测信号强度值对Fe、Mn、Cu元素进行定性分布,成像显示在正常根系中Fe、Mn、Cu元素在根尖前端信号强度较高,由表向内逐渐增加;缺锌处理下,根系中Fe、Mn、Cu信号强度均有不同程度增加。【结论】正常施锌玉米根尖中锌、铁、锰、铜分布呈现由表皮向中柱增加的趋势;缺锌胁迫下根系锌含量显著降低,铁、锰、铜均有不同程度积累。

    English Abstract

    • 锌 (Zn) 是植物生长发育的必需营养元素[1],缺锌会导致植株节间缩短、叶绿素合成受阻、叶片脉间失绿或白化、发育推迟、籽粒瘦小等,进而造成减产[2-3]。营养元素在植物根系不同组织、细胞及亚细胞水平上分布不同[4],这种空间信息对于揭示植物体内矿质元素稳态平衡与吸收转运规律等具有重要意义。

      近年来,应用能量色散X射线光谱和质子激发X荧光光谱等技术开展超积累植物体内重金属元素积累成像研究[5-6]。激光剥蚀−电感耦合等离子体质谱法 (laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry,LA-ICP-MS) 是将激光剥蚀进样系统与电感耦合等离子体质谱仪联用,通过激光剥蚀固体样品生成气溶胶后直接进入ICP-MS中进行元素含量测试,通过成像软件实现固体样品元素定位分布[7-8]。LA-ICP-MS因其易组装、测定元素范围广 (涵盖周期表中大部分元素)、所需样品少 (只需几微克)、空间分辨率高 (最小分辨率达2~5 μm)、灵敏度好等优点[7, 9],成为植物样品中痕量元素分析的重要手段。利用LA-ICP-MS对玉米根系横截面元素分布研究表明,汞离子不能横跨根系内胚层障碍[10]。对两个甘蓝型油菜栽培品种根系与根际土壤磷 (P) 分布成像分析表明,土壤中P沿根轴向分布并于根尖扩散,且两个油菜品种对P的吸收效率不同[11]。对小麦籽粒中锰(Mn)、铜(Cu)、Zn和P的空间分布分析结果显示小麦籽粒中Mn、Cu、Zn和P在籽粒不同部位的含量分布差异很大。Cu、Zn和P含量以糊粉层最高,胚乳最低,胚居中;Mn在胚中较多,胚乳中分布较低,糊粉层居中。籽粒不同部位元素的含量变化存在明显的同步性,说明不同元素在向籽粒不同部位运输和积累过程中存在密切相关性[12]。Saatz等[13]利用LA-ICP-MS和飞行时间二次离子质谱 (ToF-SIMS) 分析了稀土元素钆 (Gd) 和钇 (Y) 胁迫下玉米根系横向薄层切片Gd和Y的细胞水平分布信息,发现在玉米根系表皮中具有高浓度Gd和Y斑点,而在皮层以内Gd和Y含量较低,相关稀土元素可能束缚于根表铁膜。

      本研究通过营养液培养玉米植株,利用LA-ICP-MS技术,研究缺Zn胁迫下玉米根尖Fe、Mn、Cu、Zn元素的分布定位,以期从组织水平揭示作物中Zn的转运富集规律及缺Zn对微量金属元素吸收转运的影响,为缺Zn影响玉米植株生长与生理代谢的机制提供理论依据。

      • 以‘郑单958’玉米作为试验品种,取饱满一致的玉米种子经10% H2O2浸泡消毒15 min,超纯水洗3遍,浸泡24 h后,转移到铺有湿纱布的培养皿中,上盖一层湿纱布,25℃黑暗中催芽1天。选择发芽一致的种子放入洗净的石英砂中,培养箱25℃育苗。一周后 (两叶一心),选择长势一致的幼苗,去掉胚乳,移栽到500 mL玻璃培养管中,每管1株,玻璃培养管直径为5 cm,高20 cm,外用黑色布包裹避光,超纯水 (超纯水机,北京优普时代科技有限公司) 培养一天,然后进行营养液直接培养。幼苗培养在光照培养箱 (PRX-350D,宁波海曙赛福实验仪器厂) 中进行,控制条件为光照时间12 h,光照强度18000 lx,白天温度25℃、夜间20℃,相对湿度70%。

        基础营养液配方 (mol/L) 为:Ca(NO3)2 2.0 × 10−3;K2SO4 7.5 × 10−4;MgSO4 6.5 × 10−4;KH2PO4 2.5 × 10−4;EDTA-Fe (Ⅱ) 1.0 × 10−4;H3BO3 1.0 × 10−6;CuSO4 1.0 × 10−7;MnSO4 1.0 × 10−6;(NH4)6 Mo7O24·4H2O 5.0 × 10−9。设置缺锌和正常供锌 (1 μmol/L) 两个处理。锌元素以ZnSO4形式供给,每个处理3次重复。营养液pH用NaOH或HCl调到6.0,每隔2天更换1次营养液。

        培养15 d后采集根系,超纯水浸泡清洗3遍,切取距离根顶端0.3 cm长的根段,贴于载玻片上,105℃杀青后烘干,固定于激光剥蚀系统 (LA) UP213 (213nm Nd:YAG固体激光器,美国New Wave公司) 样品台上,进行LA-ICP-MS测定。

      • 在6个不同锌浓度 (0、0.1、1、10、50、100 μmol/L) 营养液直接培养玉米植株15天,采集植株根系,超纯水浸泡清洗3遍,电热鼓风干燥箱 (BGZ140,上海博迅实业有限公司) 烘干,研磨仪 (MM400,德国Retsch公司) 研磨成粉,混合均匀。取研磨后自制的根系粉末样品及柑橘叶成分分析标准物质粉末各0.1 g (精确至0.0001 g),加入6 mL优级纯浓HNO3和2 mL H2O2,利用微波消解仪消煮,程序升温为120℃ 5 min,160℃ 5 min,180℃ 15 min,消煮结束后利用超纯水定容至50 mL,利用电感耦合等离子体质谱 (ICP-MS) (Agilent7700x,Agilent,USA) 测定待测液中Zn、Fe、Mn、Cu含量,得到自制根系标样中元素含量。柑橘叶成分分析标准物质 (GSB-1,钢研纳克检测技术有限公司) 测定结果控制检测过程准确度。利用LA-ICP-MS测定自制根系标样信号强度与标样中元素实际含量进行相关分析,得到标准曲线。

        取50 mg研磨后的根系粉末样品,利用压片机 (769YP-15A&24B,天津市科器高新技术公司) 压成直径为5 mm的薄圆片,置于激光剥蚀样品池内,作为自制的根系标准样品,将试验玉米根尖样品和标准样品同时置于激光剥蚀池内,在同一试验条件下利用LA-ICP-MS测定。利用上述标准曲线对玉米根尖样品中元素含量进行定量分析。

      • LA系统采用Nd∶YAG激光器 (波长213 nm),测定时聚焦激光束按行扫描根系样品及标样压片,灼烧后的样品物质由载气Ar送入ICP,检测66Zn、56Fe、63Cu、55Mn及13C的离子强度。LA-ICP-MS检测参数见表1

        表 1  LA-ICP-MS检测参数

        Table 1.  Optimized experimental parameters of LA-ICP-MS

        LA参数Parameters of laser ablation system ICP-MS参数Parameters of ICP-MS
        激光波长Wavelength of laser (nm) 213 冷却气流速Cool gas (L/min) 15
        束斑大小Spot diameter (μm) 80 载气流速Carrier gas (L/min) 0.90
        线扫速度Scan speed (μm/s) 20 射频功率RF power (W) 1550
        线扫间隔Distance between lines (μm) 100 采集时间Acquisition time (s) 60
        脉冲频率Repetition frequency (Hz) 20 元素及同位素Isotopes 13C、66Zn、56Fe、55Mn、63Cu
        输出能量Energy output 50%
        脉冲能量Pulse energy (mJ) 0.03
      • 采用Excel 2010进行数据处理及相关统计分析,采用Sufer10.0进行元素分布图像制作。

      • 缺锌胁迫下玉米根系锌元素含量显著降低,仅为正常植株的27.78%;缺锌根系中Mn和Cu含量升高,分别为加锌处理的4.19倍和1.94倍,Fe含量差异不显著 (表2)。

        表 2  缺锌胁迫下根系微量金属元素含量 (n = 6)

        Table 2.  Trace element content in the root under Zn deficiency

        锌处理浓度 (μmol/L)
        Zn concentration
        根系元素含量Element content in root (mg/kg)
        Zn Fe Mn Cu
        0 19.90 ± 4.97 a 5040.78 ± 272.27 a 141.46 ± 5.51 b 9.37 ± 0.48 b
        1 71.63 ± 12.63 b 4536.05 ± 296.16 a 33.78 ± 7.95 a 4.84 ± 0.99 a
        注(Note):同列数据后不同字母表示不同锌处理间差异显著 (P < 0.05) Different letters after values in the same column indicate significant difference between two Zn concentrations (P < 0.05).
      • 为了补偿激光剥蚀进样量不均匀对信号强度的影响,选择13C作为内标元素,对各元素强度进行标准化处理。本试验对6个自制标准压片玉米根系样品和柑橘叶成分分析标准物质样品13C进行检测,结果显示,其信号波动相对标准偏差RSD值均低于10%,信号较为稳定 (图1)。

        图  1  根系自制样品压片标样及柑橘叶内标13C信号稳定性

        Figure 1.  Signal stability of 13C in self-made root standard samples and citrus leaves

      • 将自制玉米根系压片样品进行LA-ICP-MS测定,检测信号值CPS (66Zn/13C)与样品中实际Zn含量间呈良好的线性关系 (y = 0.018x + 0.0335,R2 = 0.9995),从而得到LA-ICP-MS测定标准曲线 (图2)。按此标准曲线,LA-ICP-MS测定柑橘叶GSB-11中Zn含量为17.80 mg/kg,与该标准物质的标准参考值(18 ± 2) mg/kg相吻合。

        图  2  自制根系压片标准样品LA-ICP-MS测定标准曲线

        Figure 2.  Standard curve of root samples measured usingLA-ICP-MS

      • 用LA-ICP-MS系统定量成像玉米根尖Zn的空间分布。玉米根尖顶端Zn含量分布较多,由表皮向内锌含量逐渐增加,最高处在50 mg/kg以上 (图3A-a)。相对于正常锌培养条件,缺Zn处理根尖Zn含量降低,根尖顶端Zn分布明显减少,普遍低于40 mg/kg (图3B-a)。利用LA-ICP-MS检测CPS信号强度值对Fe、Mn、Cu元素在根尖中的分布进行分析,发现在根尖前端信号强度较高,由表向内逐渐增加,与Zn分布类似;缺锌处理下,根尖中Fe、Mn、Cu信号强度均有不同程度增加 (图3-AB)。

        图  3  正常 (A) 及缺锌胁迫下 (B) 根尖微量金属元素分布

        Figure 3.  Distribution of microelements in root tips under normal (A) and zinc deficiency (B) conditions

      • LA-ICP-MS定量测定植物组织中的元素分布关键在于标准品的制备,在动物组织切片相关研究中,常将动物组织匀浆后加入标准液混匀作为标准物质,研究动物组织切片元素空间分布[7, 9]。向植物干样粉末中外源添加不同梯度浓度标准液,振荡、烘干后压片,制作标准样品,进行LA-ICP-MS测定[7-8],但此类标样目标元素浓度均匀性较差,内标元素稳定性低,影响扫描结果。Huelga-Suarez等[14]利用标准溶液浸泡滤纸,以此作为标准样品,但此方法中标样和实际待测样品基体性质不同,可能对测定产生影响。本实验利用不同浓度含锌营养液培养玉米植株,获得根系样品后,进行烘干、粉碎、混匀、压片,将其分为两份,一份利用硝酸消煮,ICP-MS测定,获得样品中实际Zn元素含量,制作适于LA-CP-MS测定的玉米根系标准样品。将此标准样品与待测根尖样品放入LA样品池中,13C作为内标元素,开展缺锌胁迫下玉米根尖中锌元素分布特征的定量成像研究,发现正常施锌玉米根尖中锌、铁、锰、铜分布呈现出由表皮向中柱增加的趋势。

        研究生物样品中元素分布技术还有质子激发X射线分析 (PIXE)[15]、同步辐射X射线荧光 (SRXRF)[16]、二次电离质谱 (SIMS)[17]、基质辅助激光解吸附质谱 (MALDI-MS)[18]等,相比而言,LA-ICP-MS通过激光剥蚀对固体样品表面原位采样,提供直观的固体表面空间分辨信息,具有多元素测定、高灵敏度、宽数量级、样品制备需样量少、易操作、定量分析简洁以及可进行同位素分析等优点[19]。但是LA-ICP-MS技术目前在植物学研究上还存在一些不足:缺少与植物样品基质相近的标准物质;分析过程中存在着激光与样品相互作用、样品气溶胶传输及气溶胶颗粒在ICP中离解时产生的分馏效应影响元素定量分析;双电荷和多原子离子产生的基质效应会干扰某些元素的测定,影响定量测定结果[19]。更加精细的样品室的设计、进样方式的改进、飞秒级激光的应用,可以提升在微米级更小尺度上植物元素定量分布成像精度与检出限。

        本文利用LA-ICP-MS成像结果表明,缺锌胁迫下玉米根尖锌含量显著降低,铁、锰、铜不同程度积累。缺Zn胁迫下,植物Fe转运蛋白编码基因IRT1ZIP4表达上调,拟南芥等植物对Fe的吸收运输增多[20-21]。植物体内金属忍耐家族蛋白 (MTP蛋白) 和自然抗性相关巨噬家族蛋白 (NRAMP蛋白) 可同时转运Zn和Mn,缺Zn时上述两类蛋白上调表达,可能是缺锌导致根系Mn含量增加的原因[22]。烟酰胺转运蛋白 (NA蛋白) 是Zn、Cu及Fe的胞间和长距离运输蛋白,多数研究者认为缺Zn时NA蛋白的表达上调,可能会促进Cu在缺锌植物体内积累[23-24]

      • 本研究利用不同浓度加锌营养液培养玉米植株获得了可适用于LA-ICP-MS定量分析的自制根系标准样品,以13C作为内标元素进行缺锌胁迫下玉米根尖锌元素分布特征的定量成像及铁、锰、铜微量金属元素的定性成像研究。成像结果显示,正常施锌玉米根尖中锌、铁、锰、铜分布呈现出由表皮向中柱增加的趋势;缺锌胁迫下根尖锌含量显著降低,铁、锰、铜不同程度积累。本研究表明,LA-ICP-MS可在植物营养机理研究中发挥重要作用。

    参考文献 (24)

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