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氮素亏缺对苹果愈伤组织硝态氮吸收及同化的影响

文滨滨 张新昊 沈红艳 武红玉 陈修德 肖伟 高东升

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氮素亏缺对苹果愈伤组织硝态氮吸收及同化的影响

    作者简介: 文滨滨 Tel:0538-8246196,E-mail:wbbsdau@163.com;
    通讯作者: 肖伟, E-mail:gulight986918@163.com ; 高东升, E-mail:dshgao@sdau.edu.cn
  • 基金项目: 山东省现代农业产业技术体系果品创新团队项目(SDAIT-06-01)。

Effects of nitrogen deficiency on nitrate uptake and assimilation of apple callus

    Corresponding author: GAO Dong-sheng, E-mail:gulight986918@163.com ;GAO Dong-sheng, E-mail:dshgao@sdau.edu.cn
  • 摘要: 【目的】研究硝态氮亏缺对苹果叶片愈伤组织生长及硝态氮吸收同化的影响,了解苹果愈伤组织对硝态氮亏缺的响应机制,为进一步研究缺氮处理影响愈伤组织生长发育的分子机理提供理论依据。【方法】以‘嘎拉3’组培苗叶片愈伤组织为试材进行组培试验,设置培养基中NO3-N亏缺和适宜两个水平 (NO3-浓度分别为0 mol/L和0.039 mol/L)。选取叶龄一致的功能性叶片,用灭菌手术刀片沿垂直叶脉方向划伤叶片并切除叶柄和叶尖,叶背向上平铺于MS分化培养基,暗培养3天然后转至光下7天,将长出愈伤组织的叶片分别转移至MS正常分化培养基 (CK) 和用NH4Cl、KCl代替NH4NO3、KNO3的MS NO3-N亏缺分化培养基 (T),培养三周。在转板第0、1、3、7、14、21天分别取叶片伤口处的愈伤组织,观察其细胞形态、测定硝态氮含量、NO3流速、氮素同化酶活性和氮素同化酶基因相对表达量。【结果】苹果愈伤组织经NO3-N亏缺处理1天后,细胞体积变小,间隙变大,排列疏松,7天后,细胞变形,排列无规则。愈伤组织中硝态氮含量在处理7天时达到峰值,为1.54 mg/g,显著高于对照,最大降幅出现在7天后,为13.64%。NO3-N亏缺处理前,NO3吸收速率最大,为22.38 pmol/(cm2·s),处理1天后降幅为84.1%,处理至7天时,NO3已经由吸收变为外排,逆差为24.45 pmol/(cm2·s)。NR活性在处理至7天时无显著变化,7天后快速增加,增幅为19.26%。NiR活性在处理至14天时,无显著性差异,14天后上升幅度为21.83%,缺氮处理1天后,GS活性最低,为0.22 U/g,7天后稍有增加,增幅为22.9%。处理组GOGAT活性在第3天时最低,为0.088 U/g,随后酶活性增加并保持稳定,但是仍低于对照组。处理组氮代谢关键酶基因MdNR2MdNIRMdGS2MdGOGAT的表达量在处理至21天时达到峰值,分别为对照组表达量的3.36、2.52、11.37和2.29倍。【结论】苹果愈伤组织对缺氮非常敏感,从第一天起就可以观测到细胞间隙变大且体积变小,对NO3的吸收速率逐渐降低。氮素同化酶活性基本呈逐渐降低的趋势,氮素同化酶基因表达量逐渐升高。缺氮7天后,苹果愈伤组织硝态氮含量趋于稳定,并开始外排NO3;氮素同化酶活性基本呈逐渐升高的趋势,氮素同化酶基因表达量进一步升高。综上所述,氮素亏缺处理前期提高了苹果愈伤组织对NO3的吸收。随着处理时间的延长,氮素代谢失衡,严重影响了细胞的形态结构,导致愈伤组织生长发育异常。
  • 图 1  硝态氮正常和亏缺处理不同时长叶片愈伤组织外观形态

    Figure 1.  Morphology of leaf callus treated at different days under nitrate nitrogen deficient and normal level

    图 2  硝态氮正常和亏缺处理不同时长愈伤组织解剖结构

    Figure 2.  Anatomical structure of leaf callus treated at different days under nitrate nitrogen deficient and normal level

    图 3  硝态氮亏缺对叶片和愈伤组织硝态氮含量的影响

    Figure 3.  The effects of nitrate-deficiency on nitrate contents in leaf and callus

    图 4  硝态氮亏缺对愈伤组织NO3流速的影响

    Figure 4.  The effects of nitrate-deficiency on NO3 uptake flux in leaf callus

    图 5  硝态氮亏缺对愈伤组织氮素同化酶活性的影响

    Figure 5.  The effects of nitrate-deficiency on nitrogen assimilation enzyme activity in leaf callus

    图 6  硝态氮亏缺对愈伤组织氮素同化酶基因表达量的影响

    Figure 6.  The effects of nitrate-deficiency on the expression of nitrogen assimilase genes in callus

    表 1  RT–PCR所用引物

    Table 1.  Primers used for quantitative RT–PCR analysis

    引物 Primes序列 Sequences(5’–3’)
    MdACTIN–FTGACCGAATGAGCAAGGAAATTACT
    MdACTIN–RTACTCAGCTTTGGCAATCCACATC
    MdNR2–FGTCCGCTCCTTCAACTTCT
    MdNR2–RACTGTATTCCCACCCTTCC
    MdNIR–FTGTCACCATCCCTCTCTGT
    MdNIR–RCAAAGTGGCTTATCAAGAGGTC
    MdGS2–FGACCCGTCGTTTGATAAGG
    MdGS2–RTGCGGTCTTCTTCCTCGTT
    MdGOGAT–FTCAGAAGCAAAGCAAGGAC
    MdGOGAT–RACCAACACGGATAGAAGCA
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出版历程
  • 收稿日期:  2018-11-22
  • 网络出版日期:  2019-11-08

氮素亏缺对苹果愈伤组织硝态氮吸收及同化的影响

    作者简介:文滨滨 Tel:0538-8246196,E-mail:wbbsdau@163.com
    通讯作者: 肖伟, gulight986918@163.com
    通讯作者: 高东升, dshgao@sdau.edu.cn
  • 山东农业大学园艺科学与工程学院/山东果蔬优质高效生产协同创新中心/作物学国家重点实验室,山东泰安 271018
  • 基金项目: 山东省现代农业产业技术体系果品创新团队项目(SDAIT-06-01)。
  • 摘要: 【目的】研究硝态氮亏缺对苹果叶片愈伤组织生长及硝态氮吸收同化的影响,了解苹果愈伤组织对硝态氮亏缺的响应机制,为进一步研究缺氮处理影响愈伤组织生长发育的分子机理提供理论依据。【方法】以‘嘎拉3’组培苗叶片愈伤组织为试材进行组培试验,设置培养基中NO3-N亏缺和适宜两个水平 (NO3-浓度分别为0 mol/L和0.039 mol/L)。选取叶龄一致的功能性叶片,用灭菌手术刀片沿垂直叶脉方向划伤叶片并切除叶柄和叶尖,叶背向上平铺于MS分化培养基,暗培养3天然后转至光下7天,将长出愈伤组织的叶片分别转移至MS正常分化培养基 (CK) 和用NH4Cl、KCl代替NH4NO3、KNO3的MS NO3-N亏缺分化培养基 (T),培养三周。在转板第0、1、3、7、14、21天分别取叶片伤口处的愈伤组织,观察其细胞形态、测定硝态氮含量、NO3流速、氮素同化酶活性和氮素同化酶基因相对表达量。【结果】苹果愈伤组织经NO3-N亏缺处理1天后,细胞体积变小,间隙变大,排列疏松,7天后,细胞变形,排列无规则。愈伤组织中硝态氮含量在处理7天时达到峰值,为1.54 mg/g,显著高于对照,最大降幅出现在7天后,为13.64%。NO3-N亏缺处理前,NO3吸收速率最大,为22.38 pmol/(cm2·s),处理1天后降幅为84.1%,处理至7天时,NO3已经由吸收变为外排,逆差为24.45 pmol/(cm2·s)。NR活性在处理至7天时无显著变化,7天后快速增加,增幅为19.26%。NiR活性在处理至14天时,无显著性差异,14天后上升幅度为21.83%,缺氮处理1天后,GS活性最低,为0.22 U/g,7天后稍有增加,增幅为22.9%。处理组GOGAT活性在第3天时最低,为0.088 U/g,随后酶活性增加并保持稳定,但是仍低于对照组。处理组氮代谢关键酶基因MdNR2MdNIRMdGS2MdGOGAT的表达量在处理至21天时达到峰值,分别为对照组表达量的3.36、2.52、11.37和2.29倍。【结论】苹果愈伤组织对缺氮非常敏感,从第一天起就可以观测到细胞间隙变大且体积变小,对NO3的吸收速率逐渐降低。氮素同化酶活性基本呈逐渐降低的趋势,氮素同化酶基因表达量逐渐升高。缺氮7天后,苹果愈伤组织硝态氮含量趋于稳定,并开始外排NO3;氮素同化酶活性基本呈逐渐升高的趋势,氮素同化酶基因表达量进一步升高。综上所述,氮素亏缺处理前期提高了苹果愈伤组织对NO3的吸收。随着处理时间的延长,氮素代谢失衡,严重影响了细胞的形态结构,导致愈伤组织生长发育异常。

    English Abstract

    • 氮素是植物中重要的营养元素,其缺乏会导致叶片快速衰老[1-2],而硝态氮是植物吸收的主要氮素形式,对植物的生长发育和物质代谢有不可替代的作用。NO3在根系中被吸收以后,大部分通过蒸腾作用被转运到叶片叶肉细胞中,在硝酸还原酶 (NR) 的作用下被还原为NO2,并进一步在亚硝酸还原酶的作用下被还原为NH4+,之后进入叶绿体,在GS和GOGAT的作用下NH4+被进一步同化为谷氨酰胺和谷氨酸[3-7]。当外界持续供氮不足时,易导致叶绿体的衰老降解,叶绿体衰老降解的同时,NO3-通过韧皮部转运至生长旺盛的部位,但是氮的吸收和同化能力显著减弱[8]。因此与氮同化和再活化相关的关键酶,像硝酸还原酶NR、亚硝酸还原酶NiR、谷氨酰胺合成酶GS和谷氨酸合酶GOGAT等活性受到衰老、胁迫等影响时将直接影响叶绿体的稳定性[9]。在这些酶中NR是氮同化的主要限速酶[10],GS是氮同化和再活化的关键酶[11]。外界供氮水平将直接影响这些酶的活性[12]。在氮素亏缺条件下,过表达NR和NiR基因可以提高植物对氮的吸收和同化,减少叶片中硝酸盐含量,尽管这种转录调控作用不能促进植物的生长,但是氮素的利用效率却显著提高[13-14]。在烟草中沉默NR基因的表达,植株NR活性降低,NO3在叶片中积累,影响了植株的生长发育[15],所以植物体内自身氮素含量也可以调控植物的生长,NR在调控过程中起主要作用[16]

      氮是果树生长发育必需的矿质元素之一。但是过量施氮加剧了环境的压力,造成土壤污染和水污染等[17-18],当前的一些研究主要集中氮素亏缺对苹果实生幼苗及结果大苗生长发育的影响[19-20],而氮素亏缺对植物干细胞愈伤组织生长发育及氮素同化吸收方面的研究较少,因此本试验采用苹果叶片的愈伤组织为试材,利用非损伤微测以及实时荧光定量PCR技术在硝态氮亏缺和正常供氮的条件下,研究苹果叶片愈伤组织中硝态氮的含量变化、硝态氮同化酶活性及相关基因表达的差异,旨在明确苹果叶片愈伤组织中硝态氮吸收、同化的生理机制和分子基础,丰富苹果叶片吸收氮素的理论。

      • 试验材料为‘嘎拉3’(Malus x domestica ‘Gala 3’) 组培苗叶片伤口分化的愈伤组织。于2018年5月3日在作物学国家重点实验室、山东农业大学园艺科学与工程学院取继代后一个月且长势均匀一致的‘嘎拉3’组培苗,取完全展开的功能叶片,用灭菌的手术刀片沿垂直叶脉方向划伤叶片并去掉叶尖和叶柄,叶背向上平铺于MS分化培养基中,每个平板10片叶片,黑暗条件下预培养3天,然后转至光下培养7天,叶片伤口处长出愈伤组织。将长出愈伤组织的叶片分别转移至MS苹果分化培养基 (CK,NO3浓度 0.039 mol/L,总N浓度 0.060 mol/L),以及用NH4Cl、KCl 代替NH4NO3、KNO3的MS硝态氮亏缺分化培养基 (T,NO3浓度 0 mol/L,总N浓度 0.021 mol/L),培养三周。人工气候室的培养条件为14 h光照 (24℃),10h黑暗 (22℃),相对湿度约为70%,光照强度为20000 lx。在转板第0、1、3、7、14、21天后分别取叶片伤口处的愈伤组织,测定硝态氮含量、NO3流速、氮素同化酶活性和氮素同化酶基因相对表达量,每处理3次重复。

      • 叶片愈伤组织的外观形态使用canon eos 60d相机拍摄。取转板后的苹果叶片愈伤组织,沿生长点方向纵切成0.5 cm3左右的小块,FAA 固定液固定后用真空机抽真空,制作石蜡切片[21]。将愈伤组织切至8 μm厚度的薄片,在Leica光学显微镜下观察愈伤组织的显微结构并拍照。

      • 硝态氮含量的测定采用任同辉[22]的方法。硝态氮同化酶活性的测定使用试剂盒法,取苹果叶片愈伤组织,称取1 g,进行三次生物学重复,用液氮将标本研磨充分,加入9 g pH 7.2~7.4的1 × PBS缓冲液充分冲洗研钵。离心20 min(3000 r/min),仔细收集上清。硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合酶试剂盒均采自上海通蔚 (货号分别为ml48521j、ml69312j、ml15789j、ml25784j),以空白孔调零,在450 nm波长下用酶标仪 (iMARKTM Microplate Reader) 依序测量各孔的吸光度 (OD 值)。测定在加终止液15分钟以内进行。

      • 采用山东农业大学农学院非损伤微测系统 (NMT100 Series, YoungerUSA LLC, Amherst, MA 01002, USA) 测定叶片和愈伤组织连接处的NO3动态流速,选取叶片伤口处着生的愈伤组织,切除多余的叶片,保持切面平整光滑。将愈伤组织置于培养皿底部,用树脂固定好,浸泡于含0.1 mM KNO3、0.1 mM CaCl2、pH 5.8测试液中,平衡30 min。更换测试液,将传感器尖端置于距离愈伤组织与叶片接触点的切面约50 μm处,开始检测。每一个愈伤组织测试5 min,获取NO3流速数据[23-24]。每组 (不同时期) 进行6个生物学重复。得到的NO3流速值,正值代表外排,负值为内吸。

      • 分别取处理后第0、1、3、7、14、21天的愈伤组织,置于液氮中速冻,放–80℃冰箱备用。总RNA的提取用TIANGEN(天根) 试剂盒,然后进行琼脂糖凝胶电泳,证实RNA 有18S 和28S 两条明显的完整条带。使用反转录试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit withg DNA Eraser (Perfect Real Time,TaKaRa) 获得cDNA,使用SYBR® Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus) 试剂盒 (宝生物) 进行荧光定量PCR 反应。在NCBI 中找到基因的序列,使用DNAMAN软件设计荧光定量特异性引物 (表1)。最终采用Comparative CT(2–ΔΔCt) 法进行数据分析[25]

        表 1  RT–PCR所用引物

        Table 1.  Primers used for quantitative RT–PCR analysis

        引物 Primes序列 Sequences(5’–3’)
        MdACTIN–FTGACCGAATGAGCAAGGAAATTACT
        MdACTIN–RTACTCAGCTTTGGCAATCCACATC
        MdNR2–FGTCCGCTCCTTCAACTTCT
        MdNR2–RACTGTATTCCCACCCTTCC
        MdNIR–FTGTCACCATCCCTCTCTGT
        MdNIR–RCAAAGTGGCTTATCAAGAGGTC
        MdGS2–FGACCCGTCGTTTGATAAGG
        MdGS2–RTGCGGTCTTCTTCCTCGTT
        MdGOGAT–FTCAGAAGCAAAGCAAGGAC
        MdGOGAT–RACCAACACGGATAGAAGCA
      • 数据的整理与统计使用Excel 2003,用Spss20.0进行数据差异性分析,用Photoshop和Graphpad Prism 6作图

      • 硝态氮亏缺和正常供氮条件下的苹果叶片愈伤组织如图1所示。结果表明,相对于对照组,转到硝态氮亏缺的培养基中第7天 (培养10天后转到新板7天) 时,叶片切口处的愈伤组织和叶缘变黄,愈伤组织相对于对照组发育迟缓;转板至14天时,靠近培养基一侧的叶片由叶缘向主叶脉变黄,愈伤组织发育停滞,靠近切口的愈伤组织出现黄化;转板至21天时,叶片严重失绿,愈伤组织黄化并失去分化能力,无法分化出幼苗。

        图  1  硝态氮正常和亏缺处理不同时长叶片愈伤组织外观形态

        Figure 1.  Morphology of leaf callus treated at different days under nitrate nitrogen deficient and normal level

      • 细胞形态的规则性和完整性是硝态氮吸收同化的基础,硝态氮亏缺处理后对愈伤组织细胞形态的影响较大 (图2)。转板至3天时,硝态氮亏缺处理后的细胞体积变小、细胞间隙变大、排列疏松。转板至7天时,处理组细胞排列杂乱,细胞变长、间隙变小,无明显细胞轮廓,此时与培养基接触的愈伤组织由浅绿变为黄绿 (图1)。转板至14天时,细胞变形,无细胞特征,细胞排列紧密,此时叶片萎蔫,愈伤组织黄化且体积无明显变化。转板至21天时,硝态氮亏缺的愈伤组织细胞已经变化持续加重。

        图  2  硝态氮正常和亏缺处理不同时长愈伤组织解剖结构

        Figure 2.  Anatomical structure of leaf callus treated at different days under nitrate nitrogen deficient and normal level

      • 图3结果表明,硝态氮亏缺处理后,苹果叶片硝态氮含量在第14天达到小高峰1.66 mg/g,在处理周期内无显著差异。而正常供氮条件下,叶片中硝态氮含量呈逐渐降低的变化趋势,且处理3天后,处理组的苹果叶片硝态氮含量显著高于对照组。

        图  3  硝态氮亏缺对叶片和愈伤组织硝态氮含量的影响

        Figure 3.  The effects of nitrate-deficiency on nitrate contents in leaf and callus

        硝态氮亏缺处理后,苹果愈伤组织硝态氮含量呈先增加后降低的变化趋势,第7天达到峰值1.54 mg/g,相比于处理前,硝态氮含量增加了0.16 mg/g,与对照呈显著性差异。最大降幅出现在7天后,为13.64%,随后呈相对稳定的变化趋势,与叶片中硝态氮含量的变化相对应。

        以上结果表明:在正常供氮条件下,叶片中的氮素含量逐渐降低,供应给生长旺盛的愈伤组织;而在硝态氮亏缺条件下处理7天后,氮素由愈伤组织流向叶片。

      • 图4可以看出,硝态氮亏缺组中NO3呈先内吸后外排再内吸的变化趋势,转板三天内,愈伤组织对NO3一直处于吸收状态,最大吸收速率出现在处理前,为22.38 pmol/(cm2·s)。处理1天后下降幅度最大为84.1%,第3天到第7天是NO3由吸收到外排的重要分界点,逆差为24.45 pmol/(cm2·s)。在处理第14天时外排速率最大,为29.18 pmol/(cm2·s),随后NO3由外排到内吸。对照中NO3-呈现先内吸后外排再内吸再外排的变化趋势,转板一天后就出现外排现象,外排速率呈先升高后降低的变化趋势,在第三天时外排速率最大,为94.52 pmol/(cm2·s)。以上结果表明,NO3在叶片和愈伤组织之间呈动态平衡,持续供氮会造成NO3的外排,短期适时缺氮可以提高愈伤组织对NO3的吸收速率。

        图  4  硝态氮亏缺对愈伤组织NO3流速的影响

        Figure 4.  The effects of nitrate-deficiency on NO3 uptake flux in leaf callus

      • NR作为一种氧化还原酶,可催化硝酸根离子还原成亚硝酸根离子。NiR是一类可以催化亚硝酸盐还原的酶,可以将亚硝酸根离子还原为铵根离子。由图5可以看出,硝态氮亏缺处理后,NR活性降低,处理至14天时快速增加,增幅为19.26%。此时,与对照相比差异最大,为0.075 U/g,处理至21天达到与处理前无显著差异的水平。NiR活性在处理后降低,处理至第7天时出现小高峰,处理结束后上升幅度最大,为21.83%,此时差异最大为0.08 U/g。

        图  5  硝态氮亏缺对愈伤组织氮素同化酶活性的影响

        Figure 5.  The effects of nitrate-deficiency on nitrogen assimilation enzyme activity in leaf callus

        GS和GOGAT主要在叶绿体中发挥同化作用,GS/GOGAT循环将叶肉细胞中的NH4+最终还原为氨基酸,所以GS的变化势必会引起GOGAT的变化。硝态氮亏缺后,GS和GOGAT活性均呈先下降然后缓慢回升并保持稳定的变化趋势,且在处理周期内GS/GOGAT活性均显著低于对照。缺氮处理1天后,GS活性最低,为0.22 U/g,与处理第3、7天无显著性差异,处理7天后稍有增加,增幅为22.9%。GOGAT活性在第3天时最低,为0.088 U/g,随着处理时间的延长,酶活性增加并保持稳定。综上,硝态氮亏缺后,硝态氮同化酶活性均降低,但在处理7天后回升,说明此时是愈伤组织中氮素吸收同化的关键时期。

      • 硝态氮亏缺处理后,氮素同化酶基因MdNR2MdNiRMdGS2MdGOGAT的相对表达基本呈升高的变化趋势。处理1天后,MdNR基因的表达量升高;处理至3天时,增幅为373%,此时MdNR基因的表达量高于对照;处理7天后,MdNR2基因表达量稳定并与处理14天时无显著差异。缺氮处理1天后,MdNIR基因的表达量开始缓慢增加;处理至7天时,高于对照,并与处理14天时无显著性差异;处理结束后,处理组MdNIR基因的表达量为对照组的2.52倍。缺氮处理1天后,MdGS2基因的表达量高于对照,处理7天后达到高峰,之后有所下降,处理结束后,处理组MdGS2基因的表达量为对照组的11.37倍。MdGOGAT基因的表达量在处理3天内与对照无显著性差异,随后显著上调,处理7天时增幅为112%并与处理14天时无显著性差异;处理结束后,处理组MdGOGAT基因的表达量为对照组的2.29倍。以上结果表明硝态氮亏缺后,通过上调氮素同化酶基因的表达量来增强同化愈伤组织中的硝态氮,从而维持愈伤组织的正常生长。

        图  6  硝态氮亏缺对愈伤组织氮素同化酶基因表达量的影响

        Figure 6.  The effects of nitrate-deficiency on the expression of nitrogen assimilase genes in callus

      • 前人研究表明,植物的细胞形态与生理功能密切相关,正常的细胞形态和器官构造是植物进行正常生命活动的基础[26]。本研究在硝态氮亏缺处理7天后,愈伤组织生长受到抑制,细胞形态发生改变,这与前人研究结果一致[27]。不过处理3天内,愈伤组织细胞体积变小,细胞间隙变大,排列疏松,这种变化有利于细胞充分利用光能,增强蒸腾作用,并促进NO3向愈伤组织中迁移[28]。所以短期缺氮处理,增强了NO3的流动性,加速衰老器官中的NO3向生长旺盛的组织中转移,促进对NO3的吸收,但是其分子机理还需要进一步探讨。

      • 硝态氮是植物最容易吸收的氮素营养,其吸收和同化过程是植物正常生长发育的基础[29]。NO3的吸收不仅受植株体内氮丰缺状况的调节还受到外界氮供应情况的影响[30]。在本研究中,NO3亏缺处理三天内,愈伤组织中NO3吸收速率减小,但硝态氮含量增加。处理至第7天时,NO3由吸收变为外排,硝态氮含量达到峰值,随后硝态氮量呈下降的变化趋势。初步认为愈伤组织中NO3的营养状况对NO3的吸收/外排起到负反馈的调节作用,这与前人在大麦幼苗上的研究结果一致[31],但是处理21天后NO3由外排转变为吸收,硝态氮含量却呈降低的变化趋势,这可能与外界硝态氮亏缺有关,虽然愈伤组织吸收NO3,但是NO3的供应不足,导致愈伤组织中的硝态氮含量减少。NR是NO3同化的关键酶,其活性直接影响氮素代谢的效率,而介质中NO3浓度直接影响NR活性[32]。NO3 亏缺处理前期,愈伤组织中NR活性降低,而在处理后期,NR活性增加,NO3可能转化为其它形式的氮。NiR和NR活性的变化趋势一致,但是NiR活性的快速增加出现在处理后14天,相比于NR滞后一个时期,这与NO3 的同化过程相一致,NO3在NR的作用下被还原为NO3,然后NO3继续被NiR还原为NH4+。NO3在叶肉细胞中被还原为NH4+后,进入叶绿体中完成同化过程被吸收利用,GS在GS/GOGAT氨同化过程中起关键性作用,是催化氨同化过程的第一步[33]。硝态氮亏缺处理后,GS活性下降,在处理周期内无显著性差异,而GOGAT活性呈下降—升高—再下降的变化趋势,且在第7天出现峰值但是仍低于处理前活性,说明缺氮处理后GS/GOGAT循环受到抑制作用,这与前人的研究结果不一致,即施氮处理GOGAT活性显著低于缺氮处理[34],其主要原因可能与处理植物器官的不同有关,根系与叶片吸收同化氮素差异的机理还需进一步研究探讨。

      • NR是一种适应酶,对外界NO3浓度的变化异常敏感,有研究表明在短时间缺氮条件下,NR基因的表达量上升而较长时间时表达量大幅度下降[35]。本研究中氮素亏缺处理后,氮素同化酶基因MdNR2MdNiR呈先降低后上升的变化趋势,并在处理21天时达到峰值,而对照中MdNR2MdNiR基因的表达相对稳定,说明氮素含量调节基因的表达。MdNR2基因的表达量在处理3天后出现大幅度上升,而MdNiR基因大幅度上调表达出现在处理后14天,存在表达量滞后现象,说明NRNiR基因在愈伤组织中的表达存在一定的联系。前人研究表明增施氮素可以上调GS/GOGAT基因的表达[36-37],而在本研究中氮素亏缺处理后,GS/GOGAT基因呈上调表达,在处理后21天达到峰值。主要原因可能是随处理时间的延长,愈伤组织中硝态氮和氨基酸含量不能维持愈伤组织的正常生长,通过刺激GS/GOGAT基因的上调表达来提高谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合酶的活性从而增加对NH4+的同化作用。在烟草的缺氮处理中发现,NO3供应不足会导致NH4+合成量减少,而植物体内的蛋白质通过降解产生较多的NH4+,诱导GS/GOGAT基因上调表达,从而加强对NH4+的同化作用[38]。在本研究中氮素亏缺处理三天内,氮素同化酶活性并没有因酶基因的上调表达而增加,这可能是植物在氮素亏缺条件下基因的表达受到mRNA加工、翻译等的调控,但是具体的分子机制还需进一步研究。

      • 硝态氮亏缺处理3天内细胞体积变小、细胞间隙变大,促进了愈伤组织对NO3的吸收,增加硝态氮含量。处理7天后愈伤组织细胞变形,NO3由吸收变为外排,硝态氮含量降低,导致氮素代谢失衡,影响了愈伤组织的正常生长发育。

    参考文献 (38)
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