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长期不同施肥措施下塿土细菌群落结构变化及其主要影响因素

刘平静 肖杰 孙本华 高明霞 张树兰 杨学云 冯浩

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长期不同施肥措施下塿土细菌群落结构变化及其主要影响因素

    作者简介: 刘平静E-mail:lpj19920516@126.com;
    通讯作者: 孙本华, E-mail:sunbenhua@126.com
  • 基金项目: 国家高技术研究发展计划(编号2013AA102904);陕西省科技统筹创新工程计划项目(编号2016KTZDNY03-06);陕西省自然科学基础研究计划项目(编号2018JM4007);高等学校学科创新引智计划资助(编号B12007)。

Variation of bacterial community structure and the main effecting factors in Eum-orthic anthrosols under different fertilization regimes

    Corresponding author: SUN Ben-hua, E-mail:sunbenhua@126.com ;
  • 摘要: 【目的】研究不同施肥处理下土壤细菌群落的特征,为建立同时改善土壤生物学特性和促进土壤生态系统稳定和健康的施肥和管理制度等提供依据。【方法】陕西省杨凌示范区“国家黄土肥力与肥料效益监测基地”的28年长期定位试验始于1990年秋,种植制度为冬小麦-夏休闲,无灌溉。本研究选取定位试验中不施肥 (CK)、施用氮磷钾肥 (N–P2O5–K2O = 135 – 108 – 67.5 kg/hm2,NPK) 和有机无机肥配施 (70% N来自牛粪,MNPK) 三个处理。于2018年6月小麦收获后采集0—20 cm耕层土样,测定养分含量、含水量、微生物量碳、氮含量及目标土壤微生物。以1%琼脂糖凝胶电泳法检测土壤中DNA,根据97%相似度对序列进行OTU聚类、α多样性分析 (包括Shannon、ACE和Chao1等指数),使用CANOCO 4.5.软件对土壤细菌门水平群落结构、细菌相对丰度等与土壤理化性质进行冗余分析。【结果】与CK相比,NPK和MNPK显著提高了土壤有机碳、全氮、微生物量碳、微生物量氮、硝态氮和铵态氮含量,显著降低了土壤pH。不同处理细菌基因拷贝数为每克干土6.69 × 109~16.46 × 109,与CK相比,NPK和MNPK处理细菌数量分别提高了57%和146%。MNPK处理的土壤细菌Shannon多样性指数显著高于CK和NPK,而Simpson指数显著低于CK和NPK,NPK与CK间两个指数无显著差异。3个处理的细菌丰富度指数 (Chao1指数和ACE指数) 和均匀度指数均没有显著差异。在门水平上,共获得35个细菌类群,其中,放线菌门 (Actinobacteria)、变形菌门 (Proteobacteria)、酸杆菌门 (Acidobacteria) 和绿弯菌门 (Chloroflexi) 为主要优势菌门 (相对丰度 > 10%),占到全部菌门的80.1%~81.7%。与CK相比,MNPK显著降低了放线菌门 (F = 5.845,P < 0.05) 的相对丰度,增加了拟杆菌门 (F = 4.461,P < 0.05) 的相对丰度,其他菌门均无显著差异。冗余分析结果显示,CK与NPK和MNPK的土壤细菌群落结构具有明显差异,且MNPK对土壤细菌群落组成的影响更大。土壤理化性质对细菌菌群影响表现为:土壤硝态氮 > 可溶性有机碳 > pH > 铵态氮 > 有机碳 > 土壤含水量,这些理化因子均是影响微生物生长的关键因子。【结论】关中塿土区旱作雨养条件下,化肥平衡施用和有机无机配施均显著提升了土壤中细菌数量、多样性和丰富度,有机无机配合还改变了细菌群落结构,特别是降低了放线菌门、增加了拟杆菌门的丰度,更有利于土壤生态系统的稳定和健康。
  • 图 1  不同处理土壤细菌在门 (A) 和纲 (B) 分类水平上的类群组成

    Figure 1.  Soil bacterial composition at the levels of phylum (A) and class (B) in different treatments

    图 2  基于门水平的RDA结果

    Figure 2.  RDA results based on phylum level of bacteria

    表 1  三个处理土壤理化性质

    Table 1.  Soil physical and chemical properties in the three treatments

    处理
    Treatment
    pH有机碳
    SOC
    (g/kg)
    全氮
    TN
    (g/kg)
    可溶性碳
    DOC
    (mg/kg)
    微生物量碳
    MBC
    (mg/kg)
    微生物量氮
    MBN
    (mg/kg)
    硝态氮
    NO3-N
    (mg/kg)
    铵态氮
    NH4+-N
    (mg/kg)
    土壤含水量
    SWC%
    CK 8.32 a 7.84 c0.91 c109.08 b235.08 c19.15 b1.99 b0.66 b12.89 a
    NPK 8.20 b10.37 b1.08 b133.56 a358.76 b36.10 a9.11 a1.00 a14.08 a
    MNPK8.11 c13.95 a1.47 a135.36 a445.73 a36.95 a9.14 a1.07 a12.85 a
    注(Note):数据为平均值 Data was average; 同列不同小写字母表示处理间在 0.05 水平差异显著 Different lowercase letters in the same column indicate significant difference among treatments at the 0.05 level.
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    表 2  不同处理土壤细菌数量和功能多样性指数

    Table 2.  Quantities and functional diversity indices of soil bacteria in different treatments

    处理
    Treatment
    细菌拷贝数 (× 109)
    Copy number
    多样性指数
    Shannon
    优势度指数
    Simpson
    ACE指数
    ACE
    Chao1指数
    Chao1
    均匀度指数
    Evenness
    CK 6.69 c6.59 b0.0030 a2666 a2656 a0.975 a
    NPK 11.81 b6.64 b0.0031 a2734 a2764 a0.974 a
    MNPK16.46 a6.75 a0.0024 b2750 a2758 a0.975 a
    注(Note):数据为平均值 Data was average; 同列不同小写字母表示处理间在 0.05 水平差异显著 Different lowercase letters in the same column indicate significant difference among treatments at 0.05 level.
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-03-22
  • 网络出版日期:  2019-11-21

长期不同施肥措施下塿土细菌群落结构变化及其主要影响因素

    作者简介:刘平静E-mail:lpj19920516@126.com
    通讯作者: 孙本华, sunbenhua@126.com
  • 1. 西北农林科技大学资源环境学院/农业部西北植物营养与农业环境重点实验室,陕西杨凌 712100
  • 2. 西北农林科技大学水利与建筑工程学院,陕西杨凌 712100
  • 3. 西北农林科技大学水土保持研究所,陕西杨凌 712100
  • 4. 西北农林科技大学中国旱区节水农业研究院,陕西杨凌 712100
  • 基金项目: 国家高技术研究发展计划(编号2013AA102904);陕西省科技统筹创新工程计划项目(编号2016KTZDNY03-06);陕西省自然科学基础研究计划项目(编号2018JM4007);高等学校学科创新引智计划资助(编号B12007)。
  • 摘要: 【目的】研究不同施肥处理下土壤细菌群落的特征,为建立同时改善土壤生物学特性和促进土壤生态系统稳定和健康的施肥和管理制度等提供依据。【方法】陕西省杨凌示范区“国家黄土肥力与肥料效益监测基地”的28年长期定位试验始于1990年秋,种植制度为冬小麦-夏休闲,无灌溉。本研究选取定位试验中不施肥 (CK)、施用氮磷钾肥 (N–P2O5–K2O = 135 – 108 – 67.5 kg/hm2,NPK) 和有机无机肥配施 (70% N来自牛粪,MNPK) 三个处理。于2018年6月小麦收获后采集0—20 cm耕层土样,测定养分含量、含水量、微生物量碳、氮含量及目标土壤微生物。以1%琼脂糖凝胶电泳法检测土壤中DNA,根据97%相似度对序列进行OTU聚类、α多样性分析 (包括Shannon、ACE和Chao1等指数),使用CANOCO 4.5.软件对土壤细菌门水平群落结构、细菌相对丰度等与土壤理化性质进行冗余分析。【结果】与CK相比,NPK和MNPK显著提高了土壤有机碳、全氮、微生物量碳、微生物量氮、硝态氮和铵态氮含量,显著降低了土壤pH。不同处理细菌基因拷贝数为每克干土6.69 × 109~16.46 × 109,与CK相比,NPK和MNPK处理细菌数量分别提高了57%和146%。MNPK处理的土壤细菌Shannon多样性指数显著高于CK和NPK,而Simpson指数显著低于CK和NPK,NPK与CK间两个指数无显著差异。3个处理的细菌丰富度指数 (Chao1指数和ACE指数) 和均匀度指数均没有显著差异。在门水平上,共获得35个细菌类群,其中,放线菌门 (Actinobacteria)、变形菌门 (Proteobacteria)、酸杆菌门 (Acidobacteria) 和绿弯菌门 (Chloroflexi) 为主要优势菌门 (相对丰度 > 10%),占到全部菌门的80.1%~81.7%。与CK相比,MNPK显著降低了放线菌门 (F = 5.845,P < 0.05) 的相对丰度,增加了拟杆菌门 (F = 4.461,P < 0.05) 的相对丰度,其他菌门均无显著差异。冗余分析结果显示,CK与NPK和MNPK的土壤细菌群落结构具有明显差异,且MNPK对土壤细菌群落组成的影响更大。土壤理化性质对细菌菌群影响表现为:土壤硝态氮 > 可溶性有机碳 > pH > 铵态氮 > 有机碳 > 土壤含水量,这些理化因子均是影响微生物生长的关键因子。【结论】关中塿土区旱作雨养条件下,化肥平衡施用和有机无机配施均显著提升了土壤中细菌数量、多样性和丰富度,有机无机配合还改变了细菌群落结构,特别是降低了放线菌门、增加了拟杆菌门的丰度,更有利于土壤生态系统的稳定和健康。

    English Abstract

    • 土壤微生物作为土壤生态系统中最重要、最活跃敏感的组成部分,参与其中的养分转化、物质循环等过程,在改善土壤环境、培肥土壤,促进植物吸收利用营养物质、生长发育等方面发挥着非常重要的作用[1]。所有土壤微生物中,细菌的丰富度最高,是衡量土壤质量和健康程度、反映土壤环境条件的重要标志之一[2-3],其数量、多样性以及群落结构组成特征的变化等均会影响土壤肥力和农田的可持续生产力,因此,维持高水平的细菌群落多样性对农业可持续发展至关重要[4-5]。外界条件的改变如降雨、施肥和耕作等,均会影响土壤中细菌的数量、多样性和群落结构特征[6]。农业生态系统中,长期不同的施肥措施会改变土壤性质,影响土壤环境,进而改变土壤细菌的群落结构,对土壤质量和生态系统的稳定性产生一定影响[7]。许多研究表明,长期施用有机肥以及有机无机配合施用会明显改变土壤细菌群落结构组成,提高其数量和多样性等,潮土、黄泥田土、灰漠土、水稻土和潮棕壤等土壤上所得的研究结果相对一致[8-12]。对于长期施用化肥来说,在不同类型土壤上的研究结果不尽相同;水稻土和潮棕壤上的结果表明,长期单施化肥显著降低了细菌数量和多样性[11-13];而砂姜黑土和灌溉塿土上的结果表明,长期平衡施用化肥会显著增加土壤细菌数量以及提高细菌群落的多样性和丰富度[13-14]

      塿土是陕西省关中平原的主要土壤类型,属于西北半干旱地区特有的土壤资源,对于关中平原小麦和玉米的生产至关重要。除旱作灌溉外,旱作雨养亦是本区域重要的栽培管理方式。本研究运用16S rDNA高通量测序技术,对旱作雨养条件下长期不同施肥处理塿土土壤细菌的丰富度、多样性和群落结构组成等进行了分析,较为客观地反映不同施肥下细菌群落的实际状况,对于评价施肥对关中地区塿土土壤质量的影响具有重要意义,同时为塿土区合理的肥料管理措施制定及土壤可持续利用提供决策依据。

      • 供试土样采自位于陕西省杨凌示范区五泉镇的“国家黄土肥力与肥料效益监测基地”长期肥料定位试验田 (34°17′N、108°00′E),海拔高度为516 m,该基地年平均气温13℃,年平均降雨量在550~600 mm,且主要集中在7月至10月[15],属于温带大陆性季风气候。

        长期定位试验始于1990年秋,主要实行冬小麦-夏休闲的种植制度,在小麦生长期内不进行人工灌溉,作物生长所依靠水分主要来自自然降雨。试验地共设7个不同的施肥处理,本研究选取其中三个处理:1) 长期不施肥 (CK);2) 氮磷钾肥平衡施用 (NPK);3) 有机肥与氮磷钾肥配施 (MNPK)。每个试验小区长21 m,宽19 m,总面积为399 m2。不同处理施用的所有肥料均在小麦播种前一次性施入,其中,氮、磷、钾养分用量分别为N 135 kg/hm2、P2O5108 kg/hm2、K2O 67.5 kg/hm2,相应肥料种类为尿素、磷酸钙、硫酸钾。MNPK处理中的N 30%由化肥提供,剩下的由有机肥提供,按比例折合施用本试验所用有机肥 (牛粪)。土壤类型为黄土母质上形成的土垫旱耕人为土 (塿土)。试验开始时耕层土壤基本理化性状为土壤有机质10.92 g/kg,全氮0.83 g/kg,全磷1.39 g/kg,全钾2.28 g/kg,碱解N 61.3 mg/kg,有效磷9.57 mg/kg,速效钾191 mg/kg,pH 8.62,孔隙度49.63%,田间持水量21.12%。

      • 2018年6月作物 (小麦) 收获后采集0—20 cm的耕层土样。处理平均划分为3个区域,作为3次重复,每个区域采六钻,将混合四分后的土样装入塑封袋后带回到实验室。将部分新鲜土样中的动植物残体和石子等杂物直接剔除,过2 mm筛,及时测定土壤的含水量、微生物量碳氮及硝态氮、铵态氮的含量。一部分鲜样保存在–80℃的超低温冰箱中,用来分析目标土壤微生物;其它样品经过自然风干后,用于测定土壤中的其余养分物质含量。

        土壤基本理化性质的测定方法参照土壤农化分析[16],pH用水浸提 (水土比为1﹕1) 法测定;用重铬酸钾容量法测定土壤有机碳,全氮用硫酸消煮-凯氏定氮法测定;土壤微生物量碳、氮采用氯仿熏蒸-K2SO4浸提法测定;土壤可溶性有机碳采用总有机碳分析仪测定;土壤硝、铵态氮用KCl浸提后,用流动注射分析仪测定。

      • 每个样品称取约0.5 g鲜土,根据E.Z.N.A.® soil试剂盒 (Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.) 说明书提取总DNA,完成基因组DNA的抽提后,用百分之一的琼脂糖凝胶电泳检测。然后样品送至美吉公司进行测序。用ABI GeneAmp®9700型PCR仪,采用338F (5′–ACTCCTACGGGAGGCAGCAG–3′) 和806R (5′–GGACTACHVGGGTWTCTAAT–3′) 引物对土壤细菌的V3–V4可变区进行PCR扩增。扩增体系为20 µL,5 × FastPfu缓冲液4 µL,2 µL 2.5 mmol/L dNTPs,0.8 µL引物 (5 µmol/L),0.4 µL FastPfu聚合酶;10 ngDNA模板。扩增程序为:95℃预变性3 min,27个循环 (95℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s),最后72℃延伸10 min。PCR产物使用百分之二的琼脂糖凝胶进行回收,利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences,Union City,CA,USA) 进行纯化,Tris-HCl缓冲液洗脱,百分之二的琼脂糖电泳检测。利用QuantiFluor™-ST (Promega,USA) 进行检测定量[17],将其按照要求混合。

      • 构建好的质粒经测序鉴定无误后用紫外分光光度计 (NanoDrop2000,Thermo Fisher Scientific,美国) 测定质粒OD260的值,通过公式换算成拷贝数 (copies/µL)。利用Illumina公司的MiseqPE300平台进行测序后,将原始数据上传至相应数据库中。采用Trimmomatic和FLASH[18]进行原始测序列质控和拼接,主要步骤:1) 过滤reads尾部质量值20以下的碱基,设置50 bp的窗口,截去窗口内平均质量值低于20的碱基后端所有序列,之后再去除质控后长度低于50 bp的序列;2) 根据重叠碱基,将两端序列进行拼接,拼接时重叠区之间的最大错配率为0.2,长度需大于10 bp;3) 根据序列首尾两端的barcode和引物将序列拆分至每个样本,barcode需精确匹配,引物允许2个碱基的错配,去除存在模糊碱基的序列。使用UPARSE软件 (version7.1http://drive5.com/uparse/),根据97%的相似度对序列进行OTU聚类,并在聚类的过程中去除单序列和嵌合体。利用RDP classifier (http://rdp.cme.msu.edu/) 对每条序列进行物种分类注释,比对Silva (Release115 http://www.arb-silva.de) 数据库[19],设置比对阈值为70%。利用美吉的I-Sanger生信云平台 (https://www.i-sanger.com/) 进行α多样分析 (包括Shannon、ACE和Chao1等指数),使用SPSS 21软件,进行单因素ANOVA分析和Pearson相关性分析;用Excel制作相关图表。使用CANOCO 4.5.软件对土壤细菌门水平群落结构、细菌相对丰度等与土壤理化性质进行冗余分析 (RDA分析,redundancy analysis)。

      • 长期不同施肥明显改变了土壤理化性质 (表1)。各处理土壤pH、有机碳、全氮和微生物量碳,均差异显著 (P < 0.05)。施肥 (NPK和MNPK) 显著降低了土壤pH值而提高了土壤有机碳、全氮、可溶性有机碳和微生物量碳含量,且MNPK的作用强于NPK。土壤微生物量氮、硝态氮和铵态氮,施肥处理间差异不显著 (P > 0.05),但均显著高于CK (P < 0.05)。不同处理土壤含水量无显著差异。

        表 1  三个处理土壤理化性质

        Table 1.  Soil physical and chemical properties in the three treatments

        处理
        Treatment
        pH有机碳
        SOC
        (g/kg)
        全氮
        TN
        (g/kg)
        可溶性碳
        DOC
        (mg/kg)
        微生物量碳
        MBC
        (mg/kg)
        微生物量氮
        MBN
        (mg/kg)
        硝态氮
        NO3-N
        (mg/kg)
        铵态氮
        NH4+-N
        (mg/kg)
        土壤含水量
        SWC%
        CK 8.32 a 7.84 c0.91 c109.08 b235.08 c19.15 b1.99 b0.66 b12.89 a
        NPK 8.20 b10.37 b1.08 b133.56 a358.76 b36.10 a9.11 a1.00 a14.08 a
        MNPK8.11 c13.95 a1.47 a135.36 a445.73 a36.95 a9.14 a1.07 a12.85 a
        注(Note):数据为平均值 Data was average; 同列不同小写字母表示处理间在 0.05 水平差异显著 Different lowercase letters in the same column indicate significant difference among treatments at the 0.05 level.
      • Shannon多样性指数用来表示样品的多样性程度,其值越大,说明细菌群落物种的多样性就越高;Simpson指数反映的是物种的优势度,值越小,代表群落物种的多样性越高;Chao1指数和ACE指数均可用来表示土壤细菌群落的丰富度。MNPK和NPK处理均显著增加了土壤细菌拷贝数,与CK相比,NPK和MNPK处理分别提高了57%和146% (表2)。土壤细菌Shannon多样性指数,MNPK处理显著高于CK和NPK处理,而CK和NPK间差异不显著。Simpson优势度指数,MNPK显著低于CK和NPK,同样CK和NPK间差异不显著比。各处理的Chao1指数、ACE指数和均匀度指数均无显著差异。

        表 2  不同处理土壤细菌数量和功能多样性指数

        Table 2.  Quantities and functional diversity indices of soil bacteria in different treatments

        处理
        Treatment
        细菌拷贝数 (× 109)
        Copy number
        多样性指数
        Shannon
        优势度指数
        Simpson
        ACE指数
        ACE
        Chao1指数
        Chao1
        均匀度指数
        Evenness
        CK 6.69 c6.59 b0.0030 a2666 a2656 a0.975 a
        NPK 11.81 b6.64 b0.0031 a2734 a2764 a0.974 a
        MNPK16.46 a6.75 a0.0024 b2750 a2758 a0.975 a
        注(Note):数据为平均值 Data was average; 同列不同小写字母表示处理间在 0.05 水平差异显著 Different lowercase letters in the same column indicate significant difference among treatments at 0.05 level.
      • 门水平上,共获得35个细菌类群,得到10个相对丰度 > 1%的类群 (图1A)。其中,放线菌门 (Actinobacteria),变形菌门 (Proteobacteria)、酸杆菌门 (Acidobacteria)、绿弯菌门 (Chloroflexi) 为主要优势菌门 (相对丰度 > 10%),相对丰度分别为20.82%~26.83%,21.08%~24.71%,17.41%~23.72%和13.37%~15.50%,占到全部菌门的80.14%~81.67%。其他6类群平均相对丰度均 < 1%,只占整个菌门的18.33%~19.86%。与CK相比,MNPK显著降低了放线菌门 (F = 5.845,P < 0.05) 的相对丰度,增加了拟杆菌门 (F = 4.461,P < 0.05) 的相对丰度,其他菌门均无显著差异。

        图  1  不同处理土壤细菌在门 (A) 和纲 (B) 分类水平上的类群组成

        Figure 1.  Soil bacterial composition at the levels of phylum (A) and class (B) in different treatments

        纲水平上,共获得68个类群,其中13个类群相对丰富度较高,其余类群平均相对丰度均 < 1% (图1B)。放线菌纲 (Actinobacteria),酸杆菌纲 (Acidobacteria) 和α-变形菌纲 (Alphaproteobacteria) 为主要优势菌纲 (相对丰度 > 10%),相对丰度分别为20.82%~26.83%,17.41%~23.72%和10.62%~11.80%,占到全部菌纲的53.06%~56.82%。与CK相比,MNPK显著降低了放线菌纲 (F = 5.845,P < 0.05) 和绿弯菌纲 (F = 33.960,P < 0.05) 的相对丰度,其他菌纲均无显著差异。

      • 为进一步分析不同土壤环境因子对细菌门水平群落结构的影响,对细菌群落结构与土壤环境因子进行RDA分析 (图2)。结果表明,轴1能解释总变异的56.9%,而轴2能解释总变异的22.8%。细菌门水平上,各个处理在RDA图上分布存在显著差异,CK处理明显与其他处理分布位置不同,表明单施化肥和有机无机配施均会改变土壤细菌群落结构,MNPK处理与CK的距离更大,说明有机无机配施对土壤细菌群落结构影响更大。环境因子对土壤细菌群落结构影响由高到低依次为土壤硝态氮 (NO3-N)、可溶性有机碳 (DOC)、pH、铵态氮 (NH4+-N)、有机碳 (SOC) 和土壤含水量 (SWC)。CK点在pH上的投影在正方向,而NPK和MNPK在pH负方向上,表明施肥通过降低土壤pH与CK形成差异。NPK和MNPK到SOC、DOC、NO3-N和NH4+-N上的投影分布在正方向,而CK分布在负方向上,表明施肥提高了这些土壤性质从而和与CK处理产生分异。pH与放线菌门 (Actinobacteria)、芽单胞菌门 (Gemmatimonadetes)、硝化螺菌门 (Nitrospirae) 和厚壁菌门 (Firmicutes) 呈明显锐角为正相关关系,与拟杆菌门 (Bacteroidetes) 和酸杆菌门 (Acidobacteria) 呈明显钝角为负相关关系。土壤SOC、DOC、NO3-N和NH4+-N等与放线菌门 (Actinobacteria)、芽单胞菌门 (Gemmatimonadetes)、硝化螺菌门 (Nitrospirae)、厚壁菌门 (Firmicutes) 以及拟杆菌门 (Bacteroidetes) 和酸杆菌门 (Acidobacteria) 的相关关系与pH相反。

        图  2  基于门水平的RDA结果

        Figure 2.  RDA results based on phylum level of bacteria

      • 施肥能够提高作物产量,增加作物秸秆和根茬量,提高土壤有机碳和全氮含量,培肥土壤[20],同时也可以改善土壤通气状况和含水量[21],促进微生物的生长活动,提高土壤微生物量碳、氮含量[22]。本研究表明,与对照处理相比,施用化肥 (NPK) 和有机无机肥配施 (MNPK) 显著增加了土壤SOC、TN、DOC、NO3-N和NH4+-N含量 (表1),这与前人研究结果一致。杨旸等[15]、林治安等[20]和杨晓等[23]等在不同类型土壤上的研究结果同样表明,长期施肥有利于提高作物产量和土壤养分水平,改善土壤肥力。本研究结果表明,单施化肥和化肥配施有机肥均显著降低陕西关中雨养农田塿土的pH;聂三安[9]等研究发现,在黄土高原单施无机肥和有机无机肥配施均会降低土壤pH值;郭芸[24]和马琳[14]等对陕西关中灌溉农田塿土的研究结果显示,有机无机配施会显著降低土壤pH。其原因一方面可能是,施肥后氮素在转化和吸收时产生H+,从而降低土壤pH[25];另一方面可能是,施肥显著增加了土壤中有机碳的含量,而有机碳为酸碱缓冲物质,可使土壤趋于中性[26],本研究区域土壤为石灰性土壤,所以单施化肥或有机无机配施可使土壤pH下降。

        土壤微生物数量、多样性指数、均匀度指数和优势度指数等是表征土壤生态系统健康稳定的重要指标。不管是施化肥 (NPK) 还是有机无机配施 (MNPK) 均可以促进旱作雨养农田塿土微生物生长与繁殖,长期施用化肥和有机无机配施处理土壤MBC和MBN的明显增加 (表1) 以及细菌拷贝数的显著提高均证实了这点 (表2),这与聂三安[9]等的研究结果一致,马琳[14]等对陕西关中灌溉农田塿土的研究也得到同样的结果。本研究利用Illumina平台Miseq高通量测序技术分析陕西关中雨养农田塿土细菌多样性和群落结构特征发现,长期单施化肥 (NPK) 的细菌多样性与不施肥处理 (CK) 相比无显著差异,而长期有机无机配施 (MNPK) 能明显提高土壤细菌的Shannon指数和降低Simpon优势度指数 (表2)。同样在塿土上,马琳[14]等利用TRFLP方法对塿土细菌多样性的研究显示,长期单施化肥 (NPK) 和有机无机配施 (MNPK) 对土壤细菌多样性均无显著影响,孙瑞[27]等利用Biolog方法的研究结果显示,长期施用无机肥能够显著提高土壤细菌多样性,而郭芸[24]等利用PLFA法的研究结果显示,长期单施氮磷肥会显著增加土壤微生物群落的多样性,这种差异很可能是由于方法不同造成的。魏巍[28]等在黑土上的研究结果显示,长期施用化肥和有机无机配施均会显著降低土壤细菌群落的多样性。这可能是由于土壤特性不同引起的,黑土土壤肥力相对较高,而陕西关中塿土肥力相对较低。对于丰富度和均匀度来说,各处理均无显著差异,这与于冰[29]和王伏伟[30]等的研究结果相似,马琳[14]等用TRFLP方法对塿土土壤细菌多样性的研究也显示出同样的结果。这可能是由于施肥的2个处理中各类细菌数量均有所提高,导致各类细菌所占比例没有明显变化,从而使土壤细菌群落丰富度和均匀度没有发生显著变化。

        不同施肥方式均会影响细菌群落结构。本研究的3个不同施肥处理共得到35个门水平类群、68个纲水平类群和超过500个属水平类群。不同处理细菌优势门和纲类群 (相对丰度 > 10%) 相似,但优势类群的相对丰度存在一定差异。不同施肥塿土细菌的优势菌门为放线菌门 (Actinobacteria)、酸杆菌门 (Acidobacteria)、变形杆菌门 (Proteobacteria) 和绿弯菌门 (Chloroflexi),这与孙瑞波等[13]得到的细菌优势类群相似;其次是芽单胞菌门 (Gemmatimonadetes) 和硝化螺菌门 (Nitrospirae) (图1-a)。变形杆菌门 (Proteobacteria) 和酸杆菌门 (Acidobacteria) 在长期有机无机配施后的土壤丰度较高,说明有机无机配施能够为Proteobacteria和Acidobacteria提供良好的生存环境。主要原因可能是由于肥料可以为作物提供其生长所必需的营养元素,促进作物根部器官的生长和物质分泌,相应地提高了根系的生理活性,进而影响与根际效应关系密切的变形杆菌门 (Proteobacteria) 和酸杆菌门 (Acidobacteria),提高了其相对丰度[31];而MNPK处理放线菌门的相对丰度明显低于CK处理,这可能与施肥提高了土壤有机碳和全氮含量有一定的关系[13]。放线菌门 (Actinobacteria) 和绿弯菌门 (Chloroflexi) 在CK处理中的丰度显著高于MNPK处理,Tian等[32]就发现其相对丰度与有机肥施用量呈负相关关系。可能是因为绿弯菌和放线菌对有机肥施用非常敏感[33],施用有机肥反而会抑制绿弯菌和放线菌的生长和繁殖,使绿弯菌门和放线菌门相对丰度降低。聂三安[9]等在黄泥土上的研究结果也显示,Chloroflexi在施肥处理中 (NPK和NPKS) 的相对丰度较不施肥处理显著下降。

        将RDA分析加入到微生物信息分析的过程中,能够更加直接清楚地显示出土壤环境因子对研究区土壤细菌群落特征的影响。RDA分析结果表明,MNPK和NPK处理与CK分布位置上存在明显差异,SOC、SWC、DOC、NO3-N、NH4+-N和pH均会影响土壤细菌群落结构 (图2),这与丁建莉[34]等利用高通量测序研究东北黑土微生物群落对长期施肥响应的结果相似。土壤理化性质均会对土壤细菌群落产生一定的影响,pH与放线菌门、芽单胞菌门、硝化螺菌门和厚壁菌门呈正相关关系,与拟杆菌门和酸杆菌门和呈负相关关系;土壤SOC、DOC、NO3-N和NH4+-N等与放线菌门、芽单胞菌门、硝化螺菌门和厚壁菌门呈负相关关系,而与拟杆菌门和酸杆菌门呈正相关关系;这与王伏伟[30]等利用高通量测序法技术在砂姜黑土上的研究结果一致。NPK和MNPK处理土壤细菌群落结构均较不施肥处理 (CK) 发生了显著变化,说明长期施肥能够改变土壤细菌生境条件,从而引起土壤微生物群落结构的变化,这也进一步证明了长期土壤培肥 (如氮磷钾化肥平衡施用、有机无机配施等) 在提高土壤肥力的同时,可促进土壤生态系统稳定和健康。

      • 关中旱作雨养条件下,长期氮磷钾化肥配施和有机无机配施均可以显著提高农田塿土肥力和改变土壤细菌群落结构,有机无机配施还可以显著提高土壤细菌多样性。化肥平衡施用和有机无机配施对于提升旱作雨养农田土壤肥力以及促进土壤生态系统稳定和健康均具有重要作用,其中有机无机配施是值得推荐的施肥方式。

    参考文献 (34)
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