• ISSN 1008-505X
  • CN 11-3996/S

留言板

尊敬的读者、作者、审稿人, 关于本刊的投稿、审稿、编辑和出版的任何问题, 您可以本页添加留言。我们将尽快给您答复。谢谢您的支持!

姓名
邮箱
手机号码
标题
留言内容
验证码

CACTFTPPCA1 (YACT)、Dof (AAAG)、MYB可能参与甘蓝型油菜对氮胁迫的响应

梁桂红 华营鹏 宋海星 张振华

引用本文:
Citation:

CACTFTPPCA1 (YACT)、Dof (AAAG)、MYB可能参与甘蓝型油菜对氮胁迫的响应

    作者简介: 梁桂红 E-mail:ghliang1119@163.com;
    通讯作者: 张振华, E-mail:zhzh1468@163.com
  • 基金项目: 国家重点研发计划(2017YFD0200100,2017YFD0200103);国家油菜产业体系项目。

CACTFTPPCA1 (YACT), Dof (AAAG) and MYB may be involved in the molecular response of Brassica napus to nitrogen stress

    Corresponding author: ZHANG Zhen-hua, E-mail:zhzh1468@163.com
  • 摘要:   【目的】  油菜需氮量高但氮素利用率低,氮素源库分配效率被认为是调控植物氮素利用效率的关键因子。在拟南芥中,NRT1.7基因介导了植物韧皮部硝酸盐由衰老叶片向幼嫩叶片和角果中的再转运过程。通过分析鉴定油菜中的NRT1.7基因及其对供氮水平的响应,为进一步系统研究NRT1.7基因提供参考依据。  【方法】  以AtNRT1.7基因序列为基础序列,采用生物信息学方法鉴定了白菜、甘蓝和甘蓝型油菜中NRT1.7的同源基因,预测和分析了该基因拷贝数、系统进化、进化选择压力、分子特征、保守基序、跨膜结构域、染色体定位、基因结构及其启动子区域所能结合的顺式作用元件,同时采用荧光定量PCR分析了甘蓝型油菜BnaNRT1.7s的组织表达模式及其对氮胁迫的响应。氮素响应试验以甘蓝型油菜幼苗为材料,在NO3-N 9.0 mmol/L溶液中培养10天后,直接测定NRT1.7基因表达量;转入NO3-N 0.3 mmol/L 溶液中 (低氮胁迫) 或在无氮溶液中饥饿处理3天后,恢复NO3-N 9.0 mmol/L 溶液培养,再测定NRT1.7基因表达量。  【结果】  甘蓝型油菜NRT1.7s家族包含6个成员,系统进化分析表明BnaNRT1.7s与拟南芥进化相似,分布在相近的分支。BnaNRT1.7s家族所有基因成员的Ka/Ks值均小于1.0,受到强烈的纯化选择作用。BnaNRT1.7s家族所有基因成员均属于稳定的两性蛋白,含12~13个跨膜结构域。基因结构相似,均含有3个内含子,且CACTFTPPCA1 (YACT)、Dof (AAAG)、MYB是启动子上丰度较大的顺式作用原件,可能参与了植物对氮素的响应。实时荧光定量PCR结果表明,甘蓝型油菜中NRT1.7基因会受到不同氮素水平的调控。长期 (72 h) 低氮处理,根部BnaA7.NRT1.7bBnaC6.NRT1.7b基因的表达上调而抑制地上部BnaCn.NRT1.7基因的表达,共同调控植物对低氮胁迫的适应能力。氮饥饿3天后供氮6 h,地上部和根部BnaNRT1.7的基因表达均受到抑制。基因共表达网络分析显示,低氮胁迫下,BnaCn.NRT1.7BnaC6.NRT1.7b基因分别在地上部和根部氮素再分配中起主导作用。  【结论】  甘蓝型油菜NRT1.7蛋白进化过程相对保守,基因结构相似,启动子上的顺式作用原件CACTFTPPCA1 (YACT)、Dof (AAAG)、MYB可能参与了甘蓝型油菜对氮胁迫的响应。
  • 图 1  NRT1.7基因在白菜、甘蓝、甘蓝型油菜及拟南芥中的染色体定位

    Figure 1.  Chromosomal localization of NRT1.7 genes in B. rapa, B. oleracea, B. napus and A. thaliana

    图 2  白菜、甘蓝、甘蓝型油菜及拟南芥NRT1.7的基因结构特征

    Figure 2.  Gene structure characteristics of NRT1.7 in B. rapa, B. oleracea, B. napus and A. thaliana

    图 3  白菜、甘蓝、甘蓝型油菜及拟南芥NRT1.7蛋白的保守基序特征

    Figure 3.  Characterization of conserved motifs in the NRT1.7 proteins in B. rapa, B. oleracea, B. napus and A. thaliana

    图 4  甘蓝型油菜NRT1.7家族启动子区域结合的顺式作用元件

    Figure 4.  Identification of the putative cis-acting regulatory elements in promoter region of the NRT1.7 family in B. napus

    图 5  不同物种NRT1.7蛋白的系统发育关系

    Figure 5.  Phylogenetic relationships of the NRT1.7 proteins in diverse species

    图 6  白菜、甘蓝及甘蓝型油菜中NRT1.7蛋白的同义突变频率和非同义突变频率

    Figure 6.  Synonymous nucleotide substitution rates (Ks) and non-synonymous nucleotide substitution rates (Ka) of NRT1.7 proteins in B. rapa, B. oleracea and B. napus

    图 7  白菜、甘蓝、甘蓝型油菜及拟南芥NRT1.7蛋白的保守序列比对

    Figure 7.  Conservative sequence alignment of NRT1.7 proteins in B. rapa, B. oleracea, B. napus and A. thaliana

    图 8  甘蓝型油菜NRT1.7蛋白的跨膜结构域

    Figure 8.  Transmembrane domains of NRT1.7 proteins in B. napus

    图 9  BnaNRT1.7s对不同氮供应水平的表达模式和相对表达量的分子特征

    Figure 9.  Molecular characterization of the expression pattern and relative expression level of BnaNRT1.7s to different N supply levels

    表 1  油菜内参基因和NRT1.7家族基因qRT-PCR引物信息

    Table 1.  The qRT-PCR primers of NRT1.7 genes and key genes in B. napus

    基因名 Gene name正向 Forward (5′-3′)反向 Reverse (5′-3′)
    BnaA2.NRT1.7CGGGATGACTCCCATGTCGGATGCTTCTCATGTGTTCAGGG
    BnaA7.NRT1.7aAACGAACCGAGGAAGGGATCCTGACTTGGTCTTGGATATACACG
    BnaA7.NRT1.7bGTTATTTTTTTCGCTGGAATGAGAACTTGTGTAAAACGCTATCTTTAACG
    BnaCn.NRT1.7GCTGGATCATCGGCTTTAGCGAGCTTCATCTTTCGCTTCTTG
    BnaC6.NRT1.7aAGGAAGGGATTAAAGGAGTAGCCCTGACTTGGTCTTGGATATACAC
    BnaC6.NRT1.7bCAGCAACATGCATTAGCAAAGACCAAAAGGGATGCTACATGGC
    BnaEF1-αGCCTGGTATGGTTGTGACCTGAAGTTAGCAGCACCCTTGG
    下载: 导出CSV

    表 2  白菜、甘蓝和甘蓝型油菜NRT1.7基因的分子特性

    Table 2.  Molecular characterization of NRT1.7 genes in B. rapa, B. oleracea and B. napus

    基因名
    Gene name
    基因编号
    Gene ID
    分区
    Block
    亚类
    Subgenome
    物理位置
    Physical position
    编码区长度 (bp)
    CDS
    外显子/内含子
    Exon/intron
    BraA2.NRT1.7Bra007886EMF110599964~1060667617764/3
    BraA7.NRT1.7aBra016259ELF21889720~2189428018694/3
    BraA7.NRT1.7bBra003979EMF219359591~1936660310355/4
    BolC7.NRT1.7aBol015711EMF214300713~1430577517854/3
    BolC7.NRT1.7bBol032953ELF5251348~525574218604/3
    BolC7.NRT1.7cBol017370EMF235098049~3510234518244/3
    BnaA2.NRT1.7BnaA02g35730DEMF1502794~50984217764/3
    BnaA7.NRT1.7aBnaA07g28390DELF20515988~2052094318694/3
    BnaA7.NRT1.7bBnaA07g24080DELF17982790~1798736718244/3
    BnaC6.NRT1.7aBnaC06g30920DELF31599633~3160441518604/3
    BnaC6.NRT1.7bBnaC06g25140DELF26679522~2668409118244/3
    BnaCn.NRT1.7BnaCnng24110DEMF122678736~2268434317854/3
    下载: 导出CSV

    表 3  白菜、甘蓝和甘蓝型油菜NRT1.7蛋白的分子组成及性质

    Table 3.  Components and properties of NRT1.7 proteins in B. rapa, B. oleracea and B. napus

    基因名
    Gene name
    氨基酸数
    Amino acids
    主要氨基酸
    Major amino
    acids
    碱性氨基酸
    Arg + Lys
    酸性氨基酸
    Asp + Glu
    分子量
    Molecucar weight
    (kD)
    等电点
    pI
    不稳定系数
    Instability
    index
    亲水性
    Hydrophilic
    脂肪指数
    Aliphatic
    index
    BraA2.NRT1.7591Leu、Ser524665.338.7137.700.270100.56
    BraA7.NRT1.7a622Leu、Ser594868.749.0939.560.18496.33
    BraA7.NRT1.7b344Leu、Val303037.856.9031.760.28898.58
    BolC7.NRT1.7a594Leu、Ser524665.748.7137.670.263100.05
    BolC7.NRT1.7b619Leu、Ser574968.418.8639.410.19796.96
    BolC7.NRT1.7c607Leu、Ser584967.268.9636.340.22398.57
    BnaA2.NRT1.7591Leu、Ser514765.338.4538.170.271100.56
    BnaA7.NRT1.7a622Leu、Ser594868.729.0939.560.19096.50
    BnaA7.NRT1.7b607Leu、Ser584967.428.9539.410.23799.21
    BnaC6.NRT1.7a619Leu、Ser594868.489.1039.400.19096.80
    BnaC6.NRT1.7b607Leu、Ser594967.279.0237.020.22498.73
    BnaCn.NRT1.7594Leu、Ser524565.678.8137.000.268100.05
    下载: 导出CSV
  • [1] 李建勇, 龚继明. 植物硝酸根信号感受与传导途径[J]. 植物生理学报, 2011, 47(2): 111–118. Li J Y, Gong J M. Nitrate signal sensing and transduction in higher plants[J]. Plant Physiology Journal, 2011, 47(2): 111–118.
    [2] Tang Y, Sun X C, Hu C, et al. Genotypic differences in nitrate uptake, translocation and assimilation of two Chinese cabbage cultivars [Brassica campestris L. ssp. Chinesnsis (L.)][J]. Plant Physiology and Biochemistry, 2013, 70: 14–20. doi:  10.1016/j.plaphy.2013.04.027
    [3] Fan S C, Lin C S, Hsu P K, et al. The Arabidopsis nitrate transporter NRT1.7, expressed in phloem, is responsible for source-to-sink remobilization of nitrate[J]. Plant Cell, 2009, 21(9): 2750–2761. doi:  10.1105/tpc.109.067603
    [4] Orsel M, Chopin F, Leleu O, et al. Characterization of a two-component high-affinity nitrate uptake system in Arabidopsis. physiology and protein-protein interaction[J]. Plant Physiology, 2006, 142(3): 1304–1317. doi:  10.1104/pp.106.085209
    [5] Møller A L, Pedas P, Andersen B, et al. Responses of barley root and shoot proteomes to long-term nitrogen deficiency, short-term nitrogen starvation and ammonium[J]. Plant Cell and Environment, 2011, 34(12): 2024–2037. doi:  10.1111/j.1365-3040.2011.02396.x
    [6] Xu G, Fan X, Miller A J. Plant nitrogen assimilation and use efficiency[J]. Annual Review of Plant Biology, 2012, 63: 153–182. doi:  10.1146/annurev-arplant-042811-105532
    [7] Wang Y Y, Hsu P K, TsayY F. Uptake, allocation and signaling of nitrate[J]. Trends in Plant Science, 2012, 17(8): 458–467. doi:  10.1016/j.tplants.2012.04.006
    [8] Avice J C, Etienne P. Leaf senescence and nitrogen remobilization efficiency in oilseed rape (Brassica napus L.)[J]. Journal of Experimental Botany, 2014, 65(14): 3813–3824. doi:  10.1093/jxb/eru177
    [9] DiazC, Lemaitre T, Christ A, et al. Nitrogen recycling and remobilization are differentially controlled by leaf senescence and development stage in Arabidopsis under low nitrogen nutrition[J]. Plant Physiology, 2008, 147(3): 1437–1449. doi:  10.1104/pp.108.119040
    [10] Masclaux-Daubresse C, Daniel-Vedele F, Dechorgnat J, et al. Nitrogen uptake, assimilation and remobilization in plants: challenges for sustainable and productive agriculture[J]. Annals of Botany, 2010, 105(7): 1141–1157. doi:  10.1093/aob/mcq028
    [11] Havé M, Marmagne A, Chardon F, et al. Nitrogen remobilization during leaf senescence: lessons from Arabidopsis to crops[J]. Journal of Experimental Botany, 2017, 68(10): 2513–2529.
    [12] Malagoli P, Laine P, Rossato L, et al. Dynamics of nitrogen uptake and mobilization in field-grown winter oilseed rape (Brassica napus) from stem extension to harvest[J]. Annals of Botany, 2005, 95(7): 1187–1198. doi:  10.1093/aob/mci131
    [13] Kichey T, Hirel B, Heumez E, et al. In winter wheat (Triticum aestivum L.) post an thesis nitrogen uptake and remobilization to the grain correlates with agronomic traits and nitrogen physiological markers[J]. Field Crops Research, 2007, 102(1): 22–32. doi:  10.1016/j.fcr.2007.01.002
    [14] Guiboileau A, Yoshimoto K, Soulay F, et al. Autophagy machinery controls nitrogen remobilization at the whole-plant level under both limiting and ample nitrate conditions in Arabidopsis[J]. New Phytologist, 2012, 194(3): 732–740. doi:  10.1111/j.1469-8137.2012.04084.x
    [15] Schulze W, Schulze E D, Stadler J, et al. Growth and reproduction of Arabidopsis thaliana in relation to storage of starch and nitrate in the wild-type and in starch-deficient and nitrate-uptake-deficient mutants[J]. Plant, Cell and Environment, 1994, 17: 795–809. doi:  10.1111/j.1365-3040.1994.tb00174.x
    [16] 余音, 廖琼, 吴智敏, 等. NRT1.7基因突变对拟南芥硝酸盐再分配及氮效率的影响[J]. 湖南农业科学, 2017, (3): 1–4. Yu Y, Liao Q, Wu Z M, et al. Effects of NRT1.7 gene mutation on nitrate redistribution and NUE of Arabidopsis[J]. Hunan Agricultural Science, 2017, (3): 1–4.
    [17] 殷艳, 陈兆波, 余健, 等. 我国油菜生产潜力分析[J]. 中国农业科技导报, 2010, 12(3): 16–21. Yin Y, Chen Z B, Yu J, et al. Analysis of potential for rapeseed production in China[J]. Journal of Agricultural Science and Technology, 2010, 12(3): 16–21. doi:  10.3969/j.issn.1008-0864.2010.03.03
    [18] Blackshaw R E, Johnson E N, Gan Y T, et al. Alternative oilseed crops for biodiesel feedstock on the Canadian prairies[J]. Plant Science, 2011, 91(5): 889–896.
    [19] Wang X, Wang H, Wang J, et al. The genome of the mesopolyploid crop species Brassica rapa[J]. Nature Genetics, 2011, 43(10): 1035–1039. doi:  10.1038/ng.919
    [20] Liu S, Liu Y, Yang X, et al. The Brassica oleracea genome reveals the asymmetrical evolution of polyploid genomes[J]. Nature Communications, 2014, 5: 1–11. doi:  10.1038/ncomms4930
    [21] Bayer P E, Hurgobin B, Golicz A A, et al. Assembly and comparison of two closely related Brassica napus genomes[J]. Plant Biotechnology Journal, 2017, 15(12): 1602–1610. doi:  10.1111/pbi.12742
    [22] Chalhoub B, Denoeud F, Liu S, et al. Early allopolyploid evolution in the post-neolithic Brassica napus oilseed genome[J]. Science, 2014, 345(6199): 950–953. doi:  10.1126/science.1253435
    [23] Hua Y P, Zhou T, Liao Q, et al. Genomics-assisted identification and characterization of the genetic variants underlying differential nitrogen use efficiencies in allotetraploid rapeseed genotypes[J]. G3-Genes Genomes Genetics, 2018, 8(8): 2757–2771.
    [24] 梁桂红, 华营鹏, 周婷, 等. 甘蓝型油菜NRT1.5NRT1.8家族基因的生物信息学分析及其对氮-镉胁迫的响应[J]. 作物学报, 2019, 45(3): 365–380. Liang G H, Hua Y P, Zhou T, et al. Bioinformatics analysis and response to nitrate-cadmium stress of NRT1.5 and NRT1.8 family genes in Brassica napus[J]. Acta Agronomica Sinica, 2019, 45(3): 365–380. doi:  10.3724/SP.J.1006.2019.84099
    [25] Girondé A, Etienne P, Trouverie J, et al. The contrasting N management of two oilseed rape genotypes reveals the mechanisms of proteolysis associated with leaf N remobilization and the respective contributions of leaves and stems to N storage and remobilization during seed filling[J]. BMC Plant Biology, 2015, 15: 1–21. doi:  10.1186/s12870-015-0437-1
    [26] Poret M, Chandrasekar B, van der Hoorn RAL, et al. Characterization of senescence-associated protease activities involved in the efficient protein remobilization during leaf senescence of winter oilseed rape[J]. Plant Science, 2016, 246: 139–153. doi:  10.1016/j.plantsci.2016.02.011
    [27] Poret M, Chandrasekar B, van der Hoorn RAL, et al. Proteomic investigations of proteases involved in cotyledon senescence: a model to explore the genotypic variability of proteolysis machinery associated with nitrogen remobilization efficiency during the leaf senescence of oilseed rape[J]. Proteomes, 2017, 5(4): 1–18. doi:  10.3390/proteomes5040029
    [28] Zhang ZH, Zhou T, Liao Q, et al. Integrated physiologic, genomic and transcriptomic strategies involving the adaptation of allotetraploid rapeseed to nitrogen limitation[J]. BMC Plant Biology, 2018, 18(1): 1–18. doi:  10.1186/s12870-018-1507-y
    [29] Wang X B, Wu J, Liang J L, et al. Brassica database (BRAD) version 2.0: integrating and mining Brassicaceae species genomic resources[J]. Database, 2015: 1–8.
    [30] Gasteiger E, Hoogland C, Gattiker A, et al. Protein identification and analysis tools on the ExPASy server//The Proteomics Protocols Handbook[M]. Humana Press, 2005, 571–607.
    [31] Hu B, Jin J, Guo A Y, et al. GSDS 2.0: an upgraded gene features visualization server[J]. Bioinformatics, 2015, 31(8): 1296–1297. doi:  10.1093/bioinformatics/btu817
    [32] Smith T F, Waterman M S. Identification of common molecular subsequences[J]. Journal of Molecular Biology, 1981, 147: 195–197. doi:  10.1016/0022-2836(81)90087-5
    [33] Tamura K, Stecher G, Peterson D, et al. MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0[J]. Molecular Biology and Evolution, 2013, 30(12): 2725–2729. doi:  10.1093/molbev/mst197
    [34] Larkin M A, Blackshields G, Brown N P, et al. Clustal W and clustal X version 2.0[J]. Bioinformatics, 2007, 23(21): 2947–2948. doi:  10.1093/bioinformatics/btm404
    [35] Saitou N, Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees[J]. Molecular Biology and Evolution, 1987, 4(4): 406–425.
    [36] Bailey T L, Boden M, Buske F A, et al. MEME Suite: tools formotif discovery and searching[J]. Nucleic Acids Research, 2009, 37(Web server issue): 202–208.
    [37] Hofmann K, Stoffel W. TMBase-A database of membrane spanning protein segments[J]. Biology Chemistry Hoppe Seyler, 1993, 374: 166.
    [38] 廖琼, 周婷, 肖燕, 等. 甘蓝型油菜钙离子转运蛋白CAX家族基因生物信息学及其对镉胁迫响应表达分析[J]. 植物生理学报, 2019, 55(5): 596–608. Liao Q, Zhou T, Xiao Y, et al. Identification and bioinformatics analysis of CAX family genes andtheir expression response to Cd2+ stress in Brassica napus[J]. Plant Physiology Journal, 2019, 55(5): 596–608.
    [39] Hoagland D R, Arnon D I. The water culture method for growing plants without soil[J]. California Agricultural Experiment Stn Cireular, 1950, 347: 1–32.
    [40] Jian S, Liao Q, Song H, et al. NRT1.1-related NH4+ toxicity is associated with a disturbed balance between NH4+ uptake and assimilation[J]. Plant Physiology, 2018, 178(4): 1473–1488. doi:  10.1104/pp.18.00410
    [41] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method[J]. Methods, 2001, 25: 402–408. doi:  10.1006/meth.2001.1262
    [42] Guruprasad K, Reddy B V, Pandit M W. Correlation between stability of a protein and its dipeptide composition: a novel approach for predicting in vivo stability of a protein from its primary sequence[J]. Protein Engineering, 1990, 4(2): 155–161. doi:  10.1093/protein/4.2.155
    [43] 王占军, 金伦, 徐忠东, 等. 麻风树LEC1基因的生物信息学分析[J]. 生物学杂志, 2014, 31(4): 68–72. Wang Z J, Jin L, Xu Z D, et al. Bioinformatics analysis of gene LEC1 from Jatropha curcas[J]. Journal of Biology, 2014, 31(4): 68–72. doi:  10.3969/j.issn.2095-1736.2014.04.068
    [44] Hua Y P, Zhou T, Song H X, et al. Integrated genomic and transcriptomic insights into the two-component high-affinity nitrate transporters in allotetraploid rapeseed[J]. Plant and Soil, 2018, 427: 245–268. doi:  10.1007/s11104-018-3652-3
    [45] Chakrabarti S, Bryant S H, Panchenko A R. Functional specificity lies within the properties and evolutionary changes of amino acids[J]. Journal of Molecular Biology, 2007, 373(3): 801–810. doi:  10.1016/j.jmb.2007.08.036
    [46] Hudson D, Guevara D, Yaish M W, et al. CGA1 modulate chlorophyll biosynthesis and glutamate synthase (GLU1/Fd-GOGAT) expression in Arabidopsis[J]. PLoS ONE, 2011, 6(11): e26765. doi:  10.1371/journal.pone.0026765
    [47] Imamura S, Kanesaki Y, Ohnuma M, et al. R2R3-type MYB transcription factor, CmMYB1, is a central nitrogen assimilation regulator in Cyanidioschyzon merolae[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2009, 106(30): 12548–12553. doi:  10.1073/pnas.0902790106
    [48] Wu Y, Yang W, Wei J, et al. Transcription factor OsDOF18 controls ammonium uptake by inducing ammonium transporters in rice roots[J]. Molecules and Cells, 2017, 40(3): 178–185.
    [49] Cheng F, Wu J, Fang L, et al. Syntenic gene analysis between Brassica rapa and other Brassicaceae species[J]. Frontiers in Plant Science, 2012, 3: 1–6.
    [50] Nekrutenko A, Makova K D, Li W H. The K A/K S ratio test for assessing the protein-coding potential of genomic regions: an empirical and simulation study[J]. Genome Research, 2002, 12(1): 198–202. doi:  10.1101/gr.200901
    [51] Forde B G. Nitrate transporters in plants: structure, function and regulation[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2000, 1465(1–2): 219–235. doi:  10.1016/S0005-2736(00)00140-1
    [52] Tsay Y F, Chiu C C, Tsai C B, et al. Nitrate transporters and peptide transporters[J]. FEBS Letters, 2007, 581(12): 2290–2300. doi:  10.1016/j.febslet.2007.04.047
    [53] 尹辉, 牟书勇, 李冠. 植物硝酸盐转运体的功能及其调控[J]. 南方农业学报, 2012, 43(4): 425–430. Yin H, Mu S Y, Li G. Function and regulation of nitrate transporters in plants[J]. Journal of Southern Agriculture, 2012, 43(4): 425–430. doi:  10.3969/j:issn.2095-1191.2012.04.425
    [54] Schjoerring J K, Bock J G H, Gammelvind L, et al. Nitrogen incorporation and remobilization indifferent shoot components of field-grown winter oilseed rape (Brassica napus L.) as affected by rate of nitrogen application and irrigation[J]. Plant and Soil, 1995, 177: 255–264. doi:  10.1007/BF00010132
    [55] 汪进, 添先凤, 江昌俊, 等. 茶树硝酸盐转运蛋白基因的克隆和表达分析[J]. 植物生理学报, 2014, 50(7): 983–988. Wang J, Tian X F, Jiang C J, et al. Cloning and expression analysis of nitrate transporter gene in Camellia sinensis[J]. Plant Physiology Journal, 2014, 50(7): 983–988.
    [56] Almagro A, Lin S H, Tsay Y F. Characterization of the Arabidopsis nitrate transporter NRT1.6 reveals a role of nitrate in early embryo development[J]. Plant Cell, 2008, 20(12): 3289–3299. doi:  10.1105/tpc.107.056788
    [57] 童依平, 蔡超, 刘全友, 等. 植物吸收硝态氮的分子生物学进展[J]. 植物营养与肥料学报, 2004, 10(4): 433–440. Tong Y P, Cai C, Liu Q Y, et al. Recent advances in molecular biology of nitrate transporters in higher plants[J]. Journal of Plant Nutrition and Fertilizers, 2004, 10(4): 433–440. doi:  10.3321/j.issn:1008-505X.2004.04.018
    [58] Theissen G, Becker A, Di Rosa A, et al. A short history of MADS-box genes in plants[J]. Plant Molecular Biology, 2000, 42(1): 115–149. doi:  10.1023/A:1006332105728
    [59] Kaufmann K, Melzer R, Theissen G. MIKC-type MADS-domain proteins: structural modularity, protein interactions and network evolution in land plants[J]. Gene, 2005, 347(2): 183–198. doi:  10.1016/j.gene.2004.12.014
    [60] Amiour N, Imbaud S, Clément G, et al. The use of metabolomics integrated with transcriptomic and proteomic studies for identifying key steps involved in the control of nitrogen metabolism in crops such as maize[J]. Journal of Experimental Botany, 2012, 63(14): 5017–5033. doi:  10.1093/jxb/ers186
    [61] 张美俊, 乔治军, 杨武德, 等. 不同糜子品种对低氮胁迫的生物学响应[J]. 植物营养与肥料学报, 2014, 20(3): 661–669. Zhang M J, Qiao Z J, Yang W D, et al. Biological response of different cultivars of millet to low nitrogen stress[J]. Journal of Plant Nutrition and Fertilizers, 2014, 20(3): 661–669. doi:  10.11674/zwyf.2014.0318
    [62] 熊淑萍, 吴克远, 王小纯, 等. 不同氮效率基因型小麦根系吸收特性与氮素利用差异的分析[J]. 中国农业科学, 2016, 49(12): 2267–2279. Xiong S P, Wu K Y, Wang X C, et al. Analysis of root absorption characteristics and nitrogen utilization of wheat genotypes with different N efficiency[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2016, 49(12): 2267–2279. doi:  10.3864/j.issn.0578-1752.2016.12.003
    [63] Chopin F, Orsel M, Dorbe M F, et al. The Arabidopsis ATNRT2.7 nitrate transporter controls nitrate content in seeds[J]. Plant Cell, 2007, 19(5): 1590–1602. doi:  10.1105/tpc.107.050542
    [64] Pant B D, Musialak-Lange M, Nuc P, et al. Identification of nutrient-responsive Arabidopsis and rapeseed micro RNAs by comprehensive real-time polymerase chain reaction profiling and small RNA sequencing[J]. Plant Physiology, 2009, 150(3): 1541–1555. doi:  10.1104/pp.109.139139
    [65] Peng M, Hannam C, Gu H, et al. A mutation in NLA, which encodes a RING-type ubiquitin ligase, disrupts the adaptability of Arabidopsis to nitrogen limitation[J]. Plant Journal, 2007, 50(2): 320–337. doi:  10.1111/j.1365-313X.2007.03050.x
  • [1] 张登晓周惠民潘根兴李恋卿郑金伟 . 城市园林废弃物生物质炭对小白菜生长、 硝酸盐含量及氮素利用率的影响. 植物营养与肥料学报, 2014, 20(6): 1569-1576. doi: 10.11674/zwyf.2014.0628
    [2] 闫贵欣陈碧云许鲲高桂珍吕培军伍晓明李锋李俊 . 甘蓝型油菜ACCase、 DGAT2和PEPC基因对氮素用量的应答. 植物营养与肥料学报, 2012, 18(6): 1370-1378. doi: 10.11674/zwyf.2012.12094
    [3] . 同磷水平下甘蓝型油菜光合特性的基因型差异研究. 植物营养与肥料学报, 2010, 16(5): 1196-1202. doi: 10.11674/zwyf.2010.0521
    [4] 石桃雄王少思石磊孟金陵徐芳森 . 不同氮、磷水平对“双高”油菜品种宁油7号和“双低”油菜品种Tapidor生长和品质的影响. 植物营养与肥料学报, 2010, 16(4): 959-964. doi: 10.11674/zwyf.2010.0427
    [5] 赵首萍张永志叶雪珠郑纪慈 . 小白菜硝酸盐积累量基因型差异机理研究. 植物营养与肥料学报, 2010, 16(3): 681-687. doi: 10.11674/zwyf.2010.0324
    [6] 张贵龙任天志李志宏刘宏斌邹国元 . 施氮量对白萝卜硝酸盐含量和土壤硝态氮淋溶的影响 . 植物营养与肥料学报, 2009, 15(4): 877-883. doi: 10.11674/zwyf.2009.0421
    [7] 刘金鑫田秋英陈范骏米国华 . 玉米硝酸盐累积及其在适应持续低氮胁迫中的作用 . 植物营养与肥料学报, 2009, 15(3): 501-508. doi: 10.11674/zwyf.2009.0302
    [8] 左青松唐瑶石剑飞杨光惠飞虎冷锁虎* . 甘蓝型油菜不同氮素子粒生产效率品种的氮素分配特性研究. 植物营养与肥料学报, 2009, 15(6): 1395-1400. doi: 10.11674/zwyf.2009.0621
    [9] 王强姜丽娜*符建荣汪建妹马军伟 , . 氮素形态、用量及施用时期对小青菜产量和硝酸盐含量的影响 . 植物营养与肥料学报, 2008, 14(1): 126-131. doi: 10.11674/zwyf.2008.0120
    [10] 都韶婷李玲玲章永松林咸永 . 不同基因型小白菜硝酸盐积累差异及筛选研究. 植物营养与肥料学报, 2008, 14(5): 969-975. doi: 10.11674/zwyf.2008.0524
    [11] 徐坤范李明玉艾希珍 . 氮对日光温室黄瓜呈味物质、硝酸盐含量及产量的影响. 植物营养与肥料学报, 2006, 12(5): 717-721. doi: 10.11674/zwyf.2006.0519
    [12] 汪吉东刘兆普郑青松刘玲潘凤 . 供氮水平对芦荟幼苗生长、硝酸盐和次生代谢产物含量的影响. 植物营养与肥料学报, 2006, 12(6): 864-868. doi: 10.11674/zwyf.2006.0618
    [13] 张英鹏徐旭军林咸永章永松都韶婷李刚 . 氮素形态对菠菜可食部分硝酸盐和草酸累积的影响. 植物营养与肥料学报, 2006, 12(2): 227-232. doi: 10.11674/zwyf.2006.0214
    [14] 郭亚芬米国华陈范骏张福锁 . 局部供应硝酸盐诱导玉米侧根生长的基因型差异. 植物营养与肥料学报, 2005, 11(2): 155-159. doi: 10.11674/zwyf.2005.0203
    [15] 李燕婷白灯莎买买提艾力张福锁江荣风毛达如 . 根际施肥调控对油菜硝酸盐含量的影响研究. 植物营养与肥料学报, 2005, 11(4): 524-529. doi: 10.11674/zwyf.2005.0416
    [16] 于红梅龚元石李子忠张小兰 . 不同水氮管理对苋菜和菠菜的产量及硝酸盐含量的影响. 植物营养与肥料学报, 2004, 10(3): 302-305. doi: 10.11674/zwyf.2004.0316
    [17] 张英鹏徐旭军林咸永章永松张丽苏陈甜甜 . 供氮水平对菠菜产量、硝酸盐和草酸累积的影响. 植物营养与肥料学报, 2004, 10(5): 494-498. doi: 10.11674/zwyf.2004.0509
    [18] 汪李平向长萍王运华 . 小白菜硝酸盐含量基因型差异的遗传行为研究. 植物营养与肥料学报, 2003, 9(4): 442-446. doi: 10.11674/zwyf.2003.0412
    [19] 徐芳森王运华尹文华 . 甘蓝型油菜硼营养高效的遗传分析. 植物营养与肥料学报, 2001, 7(4): 429-434. doi: 10.11674/zwyf.2001.0412
    [20] 李志宏张福锁王兴仁 . 我国北方地区几种主要作物氮营养诊断及追肥推荐研究 Ⅱ.植株硝酸盐快速诊断方法的研究. 植物营养与肥料学报, 1997, 3(3): 268-274. doi: 10.11674/zwyf.1997.0312
  • 加载中
图(9)表(3)
计量
  • 文章访问数:  81
  • HTML全文浏览量:  91
  • PDF下载量:  3
  • 被引次数: 0
出版历程
  • 收稿日期:  2019-03-29
  • 网络出版日期:  2020-03-27
  • 刊出日期:  2020-02-01

CACTFTPPCA1 (YACT)、Dof (AAAG)、MYB可能参与甘蓝型油菜对氮胁迫的响应

  • 基金项目: 国家重点研发计划(2017YFD0200100,2017YFD0200103);国家油菜产业体系项目。
  • 摘要:   【目的】  油菜需氮量高但氮素利用率低,氮素源库分配效率被认为是调控植物氮素利用效率的关键因子。在拟南芥中,NRT1.7基因介导了植物韧皮部硝酸盐由衰老叶片向幼嫩叶片和角果中的再转运过程。通过分析鉴定油菜中的NRT1.7基因及其对供氮水平的响应,为进一步系统研究NRT1.7基因提供参考依据。  【方法】  以AtNRT1.7基因序列为基础序列,采用生物信息学方法鉴定了白菜、甘蓝和甘蓝型油菜中NRT1.7的同源基因,预测和分析了该基因拷贝数、系统进化、进化选择压力、分子特征、保守基序、跨膜结构域、染色体定位、基因结构及其启动子区域所能结合的顺式作用元件,同时采用荧光定量PCR分析了甘蓝型油菜BnaNRT1.7s的组织表达模式及其对氮胁迫的响应。氮素响应试验以甘蓝型油菜幼苗为材料,在NO3-N 9.0 mmol/L溶液中培养10天后,直接测定NRT1.7基因表达量;转入NO3-N 0.3 mmol/L 溶液中 (低氮胁迫) 或在无氮溶液中饥饿处理3天后,恢复NO3-N 9.0 mmol/L 溶液培养,再测定NRT1.7基因表达量。  【结果】  甘蓝型油菜NRT1.7s家族包含6个成员,系统进化分析表明BnaNRT1.7s与拟南芥进化相似,分布在相近的分支。BnaNRT1.7s家族所有基因成员的Ka/Ks值均小于1.0,受到强烈的纯化选择作用。BnaNRT1.7s家族所有基因成员均属于稳定的两性蛋白,含12~13个跨膜结构域。基因结构相似,均含有3个内含子,且CACTFTPPCA1 (YACT)、Dof (AAAG)、MYB是启动子上丰度较大的顺式作用原件,可能参与了植物对氮素的响应。实时荧光定量PCR结果表明,甘蓝型油菜中NRT1.7基因会受到不同氮素水平的调控。长期 (72 h) 低氮处理,根部BnaA7.NRT1.7bBnaC6.NRT1.7b基因的表达上调而抑制地上部BnaCn.NRT1.7基因的表达,共同调控植物对低氮胁迫的适应能力。氮饥饿3天后供氮6 h,地上部和根部BnaNRT1.7的基因表达均受到抑制。基因共表达网络分析显示,低氮胁迫下,BnaCn.NRT1.7BnaC6.NRT1.7b基因分别在地上部和根部氮素再分配中起主导作用。  【结论】  甘蓝型油菜NRT1.7蛋白进化过程相对保守,基因结构相似,启动子上的顺式作用原件CACTFTPPCA1 (YACT)、Dof (AAAG)、MYB可能参与了甘蓝型油菜对氮胁迫的响应。

    English Abstract

    • 氮 (N) 被称为“生命元素”,广泛参与生物体蛋白质和核酸等大分子化合物的合成,在生物体的物质和能量代谢过程中发挥极其重要的作用[1]。铵态氮 (NH4+-N) 和硝态氮 (NO3-N) 是作物氮素吸收利用的主要形态,其中硝态氮是旱地作物吸收利用的主要氮源[2],负责硝酸盐转运的载体称为硝酸盐转运体 (nitrate transporters, NRTs)[3],包括低亲和硝酸盐转运体NRT1 (nitrate transporter 1) 和高亲和硝酸盐转运体NRT2 (nitrate transporter 2) 两个家族[4-5]。硝酸盐被植物根系细胞吸收后,在植物体内经过氮的代谢、转运和再分配等一系列过程,满足作物对氮素的需求,从而实现作物对氮素的高效利用。氮素源库分配效率被认为是调控植物氮素利用效率的关键因子[6-8]

      大多数植物进入生殖生长阶段,根系对氮素的吸收会被部分或全部抑制,前期吸收储存在体内的氮素会由老叶向新叶或由叶片向种子进行再分配,这也成为植物完成生殖生长的主要氮素来源[3, 9-11]。研究表明,籽粒中50%~90%的氮来自营养器官氮素再分配,体内储存氮的再转运比植株重新吸收的氮对籽粒的贡献更大[12-13]。当植物感受到外界氮缺乏时,会加速氮库叶片的衰老,分解叶片中蛋白质等大分子物质,通过韧皮部将小分子有机氮和无机氮运输到新叶和种子,实现氮素从源到库的转运[10, 14-15]NRT1.7基因在氮的再分配过程中扮演着重要角色。AtNRT1.7/AtNPF2.13基因属于硝酸盐转运蛋白NRT1家族成员之一,主要在叶片韧皮部的薄壁细胞表达,负责植物韧皮部硝酸盐由衰老叶向幼嫩叶的再转运过程[3]。研究表明,该基因突变后,老叶向新叶硝酸盐的转运能力显著下降。无论开花期还是角果期,AtNRT1.7突变体老叶中的硝酸盐含量均高于新叶,抑制了硝酸盐由老叶向新叶的再转运,不能满足植物新生叶片对氮素的需求,显著降低作物的氮素利用效率[3, 16]

      油菜是我国播种面积最大、地区分布最广的油料作物,种植面积和总产量约占世界的1/3[17],在我国国民经济中占重要地位。甘蓝型油菜 (Brassica napus L., AnAnCnCn, 约1345 Mb, 2n = 4x = 38) 属于十字花科芸薹属[18],由白菜 (B. rapa, ArAr, 约485 Mb, 2n = 2x = 20)[19]和甘蓝 (B. oleracea, CoCo, ~630 Mb, 2n = 2x = 18)[20]这2个二倍体基本种在7500年前通过天然远缘杂交形成,其全基因组包含约10万多个蛋白编码基因[21-22]。甘蓝型油菜进化、遗传的复杂性形成了其复杂的基因组,在一定程度上影响了各种功能基因在甘蓝型油菜生长和发育中的作用。

      植株对氮素的吸收、转运和再分配共同决定着氮素的利用效率,着力提高作物的氮素利用效率已成为我国实现农业绿色高效和可持续发展的迫切任务,也是植物营养学领域研究的热点之一。AtNRT1家族有53个家族成员,目前,对参与氮素吸收和转运的主要家族成员NRT1.1NRT1.5NRT1.8等基因功能的研究已有报道[23-24],但对介导氮素再分配过程的NRT1.7基因研究较少。甘蓝型油菜对氮素养分具有较高的生长需求,但由于其具有较强的落叶性,从而导致后期老叶中的氮素尚未充分再转运至新生叶或生殖器官即发生脱落,较低的氮素分配效率是导致油菜氮素利用效率低的主要原因[8, 25-28]。因此,对经济作物甘蓝型油菜中NRT1.7基因的结构功能及发育进化分析研究具有重要的经济价值和环境效应。

      本研究利用AtNRT1.7的基因序列和蛋白序列,对甘蓝型油菜中NRT1.7基因进行鉴定和分析,通过对基因生物信息数据的挖掘和整理,分析该基因在白菜、甘蓝和甘蓝型油菜中的系统进化关系和保守基序特征,预测其蛋白质的理化性质等,为进一步系统研究NRT1.7基因在其他物种中的功能提供参考依据。

      • 水培试验所用的甘蓝型油菜 (Brassica napus L.) 品种为“湘油15号”,油菜种子来自国家油料作物改良中心湖南分中心官春云院士团队。

      • 以拟南芥NRT1.7 (AT1G69870) 的基因序列为基础序列,利用BLAST搜索白菜、甘蓝和甘蓝型油菜中NRT1.7的目的基因序列,同时下载筛选到的基因序列对应编码的氨基酸序列,将其保存为FASTA格式。本研究所用的数据库包括拟南芥信息资源 (TAIR)(https://www.arabidopsis.org/)。白菜 (Brassica rapa)、甘蓝 (Brassica oleracea) 及甘蓝型油菜 (Brassica napus) 基因组全长DNA序列、CDS序列、氨基酸序列及其注释信息均从BRAD (http://brassicadb.org/brad/) 数据库下载[29]。双子叶植物 (大豆、花生、葡萄、烟草、芥菜、萝卜、番木瓜、橙子、柑橘和酸枣) 和单子叶植物 (水稻、小米、高粱、玉米、二穗短柄草、狗尾巴草、柳枝稷和胡桃木) 的氨基酸序列分别从NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 和JGI (https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!search?show=BLAST) 在线数据库下载。

      • 3种芸薹属作物基因的命名以物种名称 + 染色体 (后缀.) + 拟南芥中的同源基因。例如,BnaA2.NRT1.7代表甘蓝型油菜中定位在A2染色体上的NRT1.7基因。

      • 采用ExPASy ProtoParam (https://web.expasy.org/protparam/)[30]在线软件预测白菜、甘蓝和甘蓝型油菜NRT1.7蛋白的氨基酸数目和组成、相对分子量 (MW)、理论等电点 (pI)、蛋白质的亲水性 (GRAVY) 及稳定性等理化性质。3种芸薹属作物NRT1.7基因的分区从BRAD在线数据库 (http://brassicadb.org/brad/searchSyntenytPCK.php) 下载。

      • 从拟南芥信息资源 (TAIR) 和BRAD数据库中下载拟南芥、白菜、甘蓝和甘蓝型油菜的全长基因组DNA序列和编码序列 (CDS),利用在线软件GSDS 2.0 (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/) 描绘内含子和外显子结构[31]

      • 利用BLAST确定NRT1.7在白菜、甘蓝和甘蓝型油菜中每条染色体上的起始位置,并在GBrowse (http://brassicadb.org/cgi-bin/gbrowse/Brassica/) 中查找4个物种的各条染色体全长。利用软件MapInspect v. 2010 (http://www.softsea.com/review/MapInspect.html) 绘制NRT1.7在白菜、甘蓝及甘蓝型油菜中染色体的分布情况。一般认为,在100 kb基因组范围内排列有两个或以上基因,将其定义为串联重复基因[32]

      • 以3种芸薹属作物NRT1.7蛋白的氨基酸序列,利用软件MEGA 7.0 (http://www.megasoftware.net/)[33]分别进行多重比对分析,去除冗余序列[34]。采用邻接法 (Neighbor−Joining, NJ)[35]对白菜、甘蓝和甘蓝型油菜NRT1.7的比对蛋白序列构建系统发育树,并进行自检,设定Bootstrap重复为1000,去除bootstrap支持率低于50%的节点。

      • 为了研究NRT1.7蛋白在物种进化过程中是否涉及到达尔文的选择,对拟南芥与白菜、甘蓝及甘蓝型油菜中NRT1.7的CDS序列和蛋白氨基酸序列进行比对,利用在线软件PAL2NAL (http://www.bork.embl.de/pal2nal/) 计算核苷酸的同义突变频率 (synonymous, Ks) 和非同义突变频率 (non-synonymous, Ka),及其比值Ka/Ks。

      • 为了研究拟南芥、白菜、甘蓝和甘蓝型油菜NRT1.7蛋白的结构差异,利用软件MEME v. 4.12.0 (http://meme-suite.org/tools/meme)[36]对蛋白质的保守基序进行预测和分析。所用默认参数,最佳基序宽度为6~50 bp,基序最大数为10。利用在线软件NovoPro (http://www.novopro.cn/tools/color_align_prop.html) 进行蛋白保守序列分析。同时利用在线软件TMpred Server (https://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html) 对甘蓝型油菜的NRT1.7蛋白序列进行跨膜结构域的预测和分析[37]

      • 在油菜数据库 (http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/) 中下载NRT1.7同源基因起始密码子上游2.0 kb的序列,并将该序列提交至PLACE 30.0 (http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/) 和Word Art (https://wordart.com/create) 以分析可以结合到启动子区域的顺式作用元件[38]

      • 油菜苗期培养试验在光照培养室中进行,其温度22℃,光照周期16 h (光照)/8 h (黑暗),光照强度300~320 μmol/(m2·s),湿度60%~75%。选取大小一致的油菜种子,使用75%的酒精杀菌处理10 min,用超纯水将种子表面冲洗干净后,4℃下用无菌水浸泡24 h,期间换水5~6次。将浸泡后的种子均匀播种在塑料育苗盘表面固定的纱布上,育苗盘中加适量超纯水。育苗7天后,将长势一致的幼苗移栽到盛有4 L营养液的黑色塑料盒中。营养液浓度为Hoagland完全营养液[39]的1/4。

        营养液中以硝态氮为唯一氮源,设定3个供氮方式,油菜幼苗在NO3-N 9.0 mmol/L 溶液中培养10天后立即取样 (对照);油菜幼苗在NO3-N 9.0 mmol/L溶液中培养10天后,转移至0.3 mmol/L 条件下处理0、3和72 h (低氮胁迫处理) 后取样;油菜幼苗在9.0 mmol/L NO3-N 中培养10天后,在无氮营养液中培养3天后转至9.0 mmol/L NO3-N 中培养6 h (N饥饿处理)。油菜幼苗分为地上部 (S) 和根部 (R),单独分装到干净的离心管中,在液氮中速冻,–80℃冰箱中保存待测,每个处理作3个独立的生物学重复。参考Jian等[40]的试验方法测定BnaNRT1.7s基因表达量,确定BnaNRT1.7s在甘蓝型油菜地上部和根部的表达模式。试验选用的内参基因为BnaEF1-α。用于qRT-PCR检测的基因特异性引物序列见表1。qRT-PCR相对定量数据分析方法为2^-ΔΔCt法[41]

        表 1  油菜内参基因和NRT1.7家族基因qRT-PCR引物信息

        Table 1.  The qRT-PCR primers of NRT1.7 genes and key genes in B. napus

        基因名 Gene name正向 Forward (5′-3′)反向 Reverse (5′-3′)
        BnaA2.NRT1.7CGGGATGACTCCCATGTCGGATGCTTCTCATGTGTTCAGGG
        BnaA7.NRT1.7aAACGAACCGAGGAAGGGATCCTGACTTGGTCTTGGATATACACG
        BnaA7.NRT1.7bGTTATTTTTTTCGCTGGAATGAGAACTTGTGTAAAACGCTATCTTTAACG
        BnaCn.NRT1.7GCTGGATCATCGGCTTTAGCGAGCTTCATCTTTCGCTTCTTG
        BnaC6.NRT1.7aAGGAAGGGATTAAAGGAGTAGCCCTGACTTGGTCTTGGATATACAC
        BnaC6.NRT1.7bCAGCAACATGCATTAGCAAAGACCAAAAGGGATGCTACATGGC
        BnaEF1-αGCCTGGTATGGTTGTGACCTGAAGTTAGCAGCACCCTTGG
      • 采用Excel 2010和DPS v14.10软件进行数据统计和分析,采用单因素方差分析 (One-way ANOVA) 和Tukey法比较不同数据组间的差异,利用OriginPro 2017软件绘制图片。

      • 利用AtNRT1.7数据在甘蓝型油菜全基因组数据库中检索到白菜、甘蓝和甘蓝型油菜中NRT1.7的同源基因序列分别为3、3和6条 (表2表3)。白菜、甘蓝和甘蓝型油菜NRT1.7蛋白均由22种氨基酸组成,除BraA7.NRT1.7b蛋白中Leu和Val的含量较高外,其余NRT1.7蛋白中Leu和Ser的含量最高。基因编码区的长度在1035 (BraA7.NRT1.7b)~1869 (BraA7.NRT1.7a、BnaA7.NRT1.7a) bp,编码344~622个氨基酸,预测蛋白质的理论分子量为37.85~68.74 kD。除BraA7.NRT1.7b蛋白中酸性氨基酸 (Asp+Glu) 和碱性氨基酸 (Arg+Lys) 数目相同,均为30个,等电点 (pI) 为6.9,为中性蛋白;其余11个NRT1.7蛋白中的碱性氨基酸个数均多于酸性氨基酸,等电点范围在8.45~9.09,为碱性蛋白。Guruprasad等[42]认为,蛋白质的不稳定系数小于40时为稳定蛋白。NRT1.7蛋白的不稳定性系数在31.76~39.56,均小于40,属于稳定性蛋白。氨基酸的亲水性指数 (GRAVY) 是氨基酸的化学特性,是描述其支链亲水性或疏水性程度的值,根据亲水性指数介于–0.5~0.5为两性蛋白 (GRAVY为负值表示亲水性,正值表示疏水性) 的原则[43],NRT1.7蛋白氨基酸的亲水性指数均为正值,在0.184 (BraA7.NRT1.7a)~0.288 (BraA7.NRT1.7b) ,表明NRT1.7主要为两性蛋白。脂肪指数在96.33 (BraA7.NRT1.7a)~100.56 (BraA2.NRT1.7、BnaA2.NRT1.7) 。

        表 2  白菜、甘蓝和甘蓝型油菜NRT1.7基因的分子特性

        Table 2.  Molecular characterization of NRT1.7 genes in B. rapa, B. oleracea and B. napus

        基因名
        Gene name
        基因编号
        Gene ID
        分区
        Block
        亚类
        Subgenome
        物理位置
        Physical position
        编码区长度 (bp)
        CDS
        外显子/内含子
        Exon/intron
        BraA2.NRT1.7Bra007886EMF110599964~1060667617764/3
        BraA7.NRT1.7aBra016259ELF21889720~2189428018694/3
        BraA7.NRT1.7bBra003979EMF219359591~1936660310355/4
        BolC7.NRT1.7aBol015711EMF214300713~1430577517854/3
        BolC7.NRT1.7bBol032953ELF5251348~525574218604/3
        BolC7.NRT1.7cBol017370EMF235098049~3510234518244/3
        BnaA2.NRT1.7BnaA02g35730DEMF1502794~50984217764/3
        BnaA7.NRT1.7aBnaA07g28390DELF20515988~2052094318694/3
        BnaA7.NRT1.7bBnaA07g24080DELF17982790~1798736718244/3
        BnaC6.NRT1.7aBnaC06g30920DELF31599633~3160441518604/3
        BnaC6.NRT1.7bBnaC06g25140DELF26679522~2668409118244/3
        BnaCn.NRT1.7BnaCnng24110DEMF122678736~2268434317854/3

        表 3  白菜、甘蓝和甘蓝型油菜NRT1.7蛋白的分子组成及性质

        Table 3.  Components and properties of NRT1.7 proteins in B. rapa, B. oleracea and B. napus

        基因名
        Gene name
        氨基酸数
        Amino acids
        主要氨基酸
        Major amino
        acids
        碱性氨基酸
        Arg + Lys
        酸性氨基酸
        Asp + Glu
        分子量
        Molecucar weight
        (kD)
        等电点
        pI
        不稳定系数
        Instability
        index
        亲水性
        Hydrophilic
        脂肪指数
        Aliphatic
        index
        BraA2.NRT1.7591Leu、Ser524665.338.7137.700.270100.56
        BraA7.NRT1.7a622Leu、Ser594868.749.0939.560.18496.33
        BraA7.NRT1.7b344Leu、Val303037.856.9031.760.28898.58
        BolC7.NRT1.7a594Leu、Ser524665.748.7137.670.263100.05
        BolC7.NRT1.7b619Leu、Ser574968.418.8639.410.19796.96
        BolC7.NRT1.7c607Leu、Ser584967.268.9636.340.22398.57
        BnaA2.NRT1.7591Leu、Ser514765.338.4538.170.271100.56
        BnaA7.NRT1.7a622Leu、Ser594868.729.0939.560.19096.50
        BnaA7.NRT1.7b607Leu、Ser584967.428.9539.410.23799.21
        BnaC6.NRT1.7a619Leu、Ser594868.489.1039.400.19096.80
        BnaC6.NRT1.7b607Leu、Ser594967.279.0237.020.22498.73
        BnaCn.NRT1.7594Leu、Ser524565.678.8137.000.268100.05
      • 以拟南芥NRT1.7的基因序列为目的序列,对在油菜全基因组数据库中检索到的12个NRT1.7同源基因的拷贝数变异、染色体定位及基因结构特征进行如下分析。

        拷贝数变异 (copy number variations, CNVs) 是由基因组发生重排所致。为了比较白菜、甘蓝及甘蓝型油菜NRT1.7基因的进化多样性,以AtNRT1.7为查询对象,在NCBI数据库中进行BLAST搜索。在异源四倍体甘蓝型油菜中鉴定了6个NRT1.7同源基因,明显多于拟南芥 (1个)、甘蓝 (3个) 和白菜 (3个) 所具有的NRT1.7基因数量。甘蓝型油菜中NRT1.7基因的数量等同于白菜和甘蓝中NRT1.7的总数,这意味着甘蓝型油菜NRT1.7基因在异源多倍体自然加倍过程中没有损失。

        利用MapInspect软件绘制出NRT1.7基因在拟南芥、白菜、甘蓝及甘蓝型油菜染色体上的定位图 (图1)。图1表明,NRT1.7基因在芸薹属作物染色体上的分布是不均匀的,每条染色体上有1~3个NRT1.7基因。Bra A2、Bna A2和Bna Cn各分布1个;Bra A7、Bna A7和Bna C6各分布2个NRT1.7串联重复基因,Bol C7染色体上分布3个串联重复基因。异源四倍体甘蓝型油菜中的A染色体全部来源于亲本二倍体白菜,C染色体全部来源于亲本二倍体甘蓝,说明NRT1.7蛋白在自然加倍的进化过程中相对保守。

        图  1  NRT1.7基因在白菜、甘蓝、甘蓝型油菜及拟南芥中的染色体定位

        Figure 1.  Chromosomal localization of NRT1.7 genes in B. rapa, B. oleracea, B. napus and A. thaliana

      • 外显子–内含子结构的数目是某些基因家族中典型的进化印记[44]。因此,利用GSDS 2.0软件对芸薹属作物和拟南芥中NRT1.7的基因结构进行分析 (图2)。3种芸薹属作物12个NRT1.7同源基因中,除BraA7.NRT1.7b基因含4个内含子,其余NRT1.7基因均有3个内含子,与拟南芥的基因结构类似。同源基因中内含子个数的不同在一定程度上表明了即使是直系同源基因也有可能经历基因结构的多样化。

        图  2  白菜、甘蓝、甘蓝型油菜及拟南芥NRT1.7的基因结构特征

        Figure 2.  Gene structure characteristics of NRT1.7 in B. rapa, B. oleracea, B. napus and A. thaliana

        利用在线软件MEME对芸薹属作物及拟南芥NRT1.7蛋白的保守基序进行分析,不同颜色的盒子表示不同的保守基序,灰色的线条表示没有检测到基序的蛋白质区域。图3显示,NRT1.7蛋白在4个物种中相对保守,保守基序为8~15个。其中,BraA7.NRT1.7a、BolC7.NRT1.7b、BolC7.NRT1.7c、BnaA7.NRT1.7a、BnaA7.NRT1.7b、BnaC6.NRT1.7a和BnaC6.NRT1.7b蛋白非常保守,保守基序均为15个;AtNRT1.7、BraA2.NRT1.7、BolC7.NRT1.7a、BnaA2.NRT1.7和BnaCn.NRT1.7缺失Motif 1,含有14个保守基序;BraA7.NRT1.7b有8个保守基序,缺失Motif 9、Motif 10、Motif 11、Motif 12、Motif 13、Motif 14及Motif 15。除了BraA7.NRT1.7b基因有4个内含子,编码的蛋白含8个保守基序外,其余基因均含3个内含子,编码的蛋白含14~15个保守基序,这说明相似的基因结构编码的蛋白保守序列具有相似性。从分子进化的角度看,氨基酸残基在进化过程中的保守性,可以认为其在功能或结构上具有重要性[45]

        图  3  白菜、甘蓝、甘蓝型油菜及拟南芥NRT1.7蛋白的保守基序特征

        Figure 3.  Characterization of conserved motifs in the NRT1.7 proteins in B. rapa, B. oleracea, B. napus and A. thaliana

      • 转录因子 (transcription factor) 能结合到基因启动子区域的顺式作用原件上,在调控基因表达方面起到重要作用[38]。考虑到BnaNRT1.7s基因对低氮胁迫的转录响应,利用PLACE软件对甘蓝型油菜NRT1.7家族基因启动子区域所能结合的顺式作用元件进行了分析。结果如图4所示,有28个顺式作用元件均能结合到BnaNRT1.7家族基因的启动子上,其中丰度较大的主要有CACTFTPPCA1 (YACT)、Dof (AAAG)、MYB、ROOTMOTIFTAPOX1 (ATATT) 等,其中大多数启动子参与了植物对氮的响应[46-48]

        图  4  甘蓝型油菜NRT1.7家族启动子区域结合的顺式作用元件

        Figure 4.  Identification of the putative cis-acting regulatory elements in promoter region of the NRT1.7 family in B. napus

      • 为了比较NRT1.7蛋白在不同物种发育进化过程中的分子进化规律和系统发生关联,分别对拟南芥、甘蓝型油菜、大豆等13个双子叶物种中27个NRT1.7蛋白和水稻、玉米、高粱等8个单子叶物种中12个NRT1.7的蛋白序列进行同源性比对,利用邻接法构建系统进化树。如图5所示,NRT1.7家族成员分成双子叶植物和单子叶植物两个分支,表明NRT1.7蛋白在生物形态发生后开始出现差异[43]。白菜、甘蓝和甘蓝型油菜中NRT1.7同源蛋白均位于双子叶的分支,且比较紧密地聚集在一起,同源性较高。

        图  5  不同物种NRT1.7蛋白的系统发育关系

        Figure 5.  Phylogenetic relationships of the NRT1.7 proteins in diverse species

      • 十字花科芸薹属作物全基因组可分为LF、MF1和MF2[49]3个亚基因组。表2显示,NRT1.7蛋白定位在E分区,分为LF、MF1和MF2亚基因组,其中50%为LF亚基因组,25%为MF1亚基因组,25%为MF2亚基因组。

        为了研究NRT1.7蛋白在物种进化过程中是否受到选择压力,分别对拟南芥和3种芸薹属作物NRT1.7的CDS序列及蛋白氨基酸序列进行比对,分别计算Ka、Ks和Ka/Ks。在遗传学中,Ka/Ks的大小可以判断这个基因在进化中是否受到选择压力。当Ka/Ks > 1.0时,认为有正选择效应;当Ka/Ks=1.0时,认为该蛋白存在中性选择;当Ka/Ks < 1.0时,则认为存在纯化选择作用[50]图6所示,NRT1.7在3种芸薹属作物中的Ka/Ks值均小于1.0,表明NRT1.7蛋白在物种进化过程中保留其重要功能而存在纯化选择作用。

        图  6  白菜、甘蓝及甘蓝型油菜中NRT1.7蛋白的同义突变频率和非同义突变频率

        Figure 6.  Synonymous nucleotide substitution rates (Ks) and non-synonymous nucleotide substitution rates (Ka) of NRT1.7 proteins in B. rapa, B. oleracea and B. napus

      • 不同物种硝酸盐转运体的蛋白序列具有相似的保守序列。在拟南芥中,NRT1家族属于MFS (major facilitator superfamily) 的小肽转运体PTR (peptide transporter) 家族。PTR转运蛋白一般含450~600个氨基酸,分12个跨膜区。在第5跨膜区有一个PTR家族的保守序列 (F-Y-x-x-x-N-x-G-S-L)[51]。对3种芸薹属作物及拟南芥NRT1.7的氨基酸序列比对发现,4个物种NRT1.7蛋白的氨基酸序列相似性较高,但不含有PTR家族的保守基序,这可能是因为进化过程中发挥其独特的分子功能 (图7)。

        图  7  白菜、甘蓝、甘蓝型油菜及拟南芥NRT1.7蛋白的保守序列比对

        Figure 7.  Conservative sequence alignment of NRT1.7 proteins in B. rapa, B. oleracea, B. napus and A. thaliana

      • 拟南芥NRT1家族的蛋白含12个跨膜区,且在第6、7跨膜区之间有一个约100个氨基酸组成的大亲水环,将12个跨膜区分成两部分[52]。油菜中6个BnaNRT1.7家族蛋白的跨膜结构域如图8所示,除了BnaC6.NRT1.7b含有13个跨膜结构域外 (图8f),其余NRT1.7蛋白均含有12个跨膜结构域,在第6、7跨膜区间由一个大的亲水环相连,与拟南芥中NRT1家族的结构特点相似。NRT1.7蛋白跨膜区主要分布在第43~588氨基酸残基间,12个跨膜结构域长度为17~30个氨基酸。

        图  8  甘蓝型油菜NRT1.7蛋白的跨膜结构域

        Figure 8.  Transmembrane domains of NRT1.7 proteins in B. napus

      • 硝酸盐不仅是重要的营养物质,同时也是一种重要的信号分子,对硝酸盐转运体发挥功能起重要的调控作用[53]。为了确定BnaNRT1.7家族基因在油菜适应不同氮浓度调控中的作用,研究了短期 (3 h) 和长期 (72 h) 低氮处理以及氮饥饿后供氮NRT1.7基因在地上部和根部的表达模式以及相对表达量 (图9)。与AtNRT1.7基因主要在叶脉韧皮部表达不同,BnaNRT1.7家族成员中有4个成员 (BnaA2.NRT1.7BnaCn.NRT1.7BnaA7.NRT1.7aBnaC6.NRT1.7a) 主要在地上部表达,其余2个同源基因 (BnaA7.NRT1.7bBnaC6.NRT1.7b) 主要在根部表达。qRT-PCR数据表明,无论是低氮处理0~72 h还是氮饥饿3天后供氮6 h,甘蓝型油菜中NRT1.7基因在地上部和根部的表达均受到调控。低氮处理0~3 h后,BnaCn.NRT1.7基因在地上部的表达被抑制,3~72 h内趋于平缓。根部BnaA7.NRT1.7bBnaC6.NRT1.7b基因在0~72 h 内表达被诱导持续上调。氮饥饿3天后供氮6 h,BnaNRT1.7家族成员地上部和根部的表达均诱导下调。其中,地上部BnaCn.NRT1.7基因的表达显著下调,根部BnaA7.NRT1.7bBnaC6.NRT1.7b基因的表达下调明显,且在6 h时达到最小值。从甘蓝型油菜NRT1.7基因的共表达分析网络中可以看出,BnaNRT1.7家族成员中有5个成员 (BnaCn.NRT1.7、BnaA7.NRT1.7a、BnaA7.NRT1.7b、BnaC6.NRT1.7a、BnaC6.NRT1.7b) 在响应低氮胁迫中起到调控作用,其中BnaCn.NRT1.7BnaC6.NRT1.7b占主导地位,分别在地上部和根部氮素再转运过程中发挥核心作用。

        图  9  BnaNRT1.7s对不同氮供应水平的表达模式和相对表达量的分子特征

        Figure 9.  Molecular characterization of the expression pattern and relative expression level of BnaNRT1.7s to different N supply levels

      • 硝酸盐作为植物吸收利用氮素的一种重要存在形式,其在植物体内的转运和再分配需要硝酸盐转运体 (NRTs) 的协助完成。在拟南芥中,NRT1家族有53个成员,目前已鉴定有8个成员 (NRT1.1, NRT1.2, NRT1.4~1.9) 在硝酸盐吸收和转运中发挥着重要作用[3, 52, 54-55],其中NRT1.7介导了植物韧皮部硝酸盐由衰老叶向幼嫩叶的再转运过程,提供植物生殖发育阶段所需的氮素。白菜、甘蓝和甘蓝型油菜作为十字花科芸薹属中3种重要的经济作物,开花后根系对土壤氮素的吸收能力降低,为满足新生叶片和角果发育对氮素的需求,衰老叶中的氮素会向幼嫩叶片和角果中转移,为籽粒干物质的形成和养分的累积提供保障[56]。因此对其NRT1.7基因的结构功能及进化分析研究具有重要的实际意义。

        不同物种硝酸盐转运体的蛋白序列高度同源,具有相似的保守结构,这说明该基因在进化过程中为保留其重要功能而相对保守。拟南芥NRT1家族属于MFS (major facilitator superfamily) 超家族的小肽转运体PTR (peptide transporter) 家族。PTR转运蛋白是一类可以转运氨基酸、寡肽以及硝酸盐等含氮化合物的膜转运蛋白,广泛存在于动物、植物和微生物中[57],一般含450~600个氨基酸,12个跨膜区,在第6、7跨膜区之间由一个约100个氨基酸组成的亲水环相连。3种芸薹属作物的分子理化性质表明,大部分NRT1.7蛋白属于碱性蛋白,含591~622个氨基酸,根据其不稳定系数 (31.76~39.56,< 40) 判断其属于稳定性蛋白。从分子进化的角度看,氨基酸残基在进化过程中的保守性,可以认为其在功能或结构上具有重要作用[50]。保守基序和跨膜结构域分析表明,BnaNRT1.7家族成员之间具有高度的相似性,保守基序为14~15个,含12个跨膜区,且在第6、7跨膜区间有一个亲水环。一般认为,内含子个数多的基因比较保守,而不含有内含子的基因保守性较差[58-59]。白菜、甘蓝和甘蓝型油菜中NRT1.7基因属于E分区的不同亚类,基因结构含3~4个内含子,与拟南芥的基因结构相似,且相似的基因结构编码的蛋白保守序列具有相似性。此外,通过PLACE软件预测有28个顺式作用元件均能结合到BnaNRT1.7家族基因的启动子上,丰度较大的包括CACTFTPPCA1 (YACT)、Dof (AAAG)、MYB、ROOTMOTIFTAPOX1 (ATATT) 等,这些启动子在参与植物对氮响应的过程中发挥了重要作用[46-48]。甘蓝型油菜中鉴定到6个NRT1.7同源基因分布在4条染色体上,且BnaNRT1.7基因的数量等于BraNRT1.7BolNRT1.7的总数,表明BnaNRT1.7基因在异源多倍体自然加倍过程中没有损失。系统发育分析和Ka/Ks表明蛋白在不同物种发育进化过程中的同源性以及进化过程中是否受到选择压力[43]。NRT1.7家族成员在进化树中分成双子叶植物和单子叶植物两个独立分支,表明NRT1.7蛋白在生物形态发生后开始出现差异[43]。白菜、甘蓝和油菜中NRT1.7同源蛋白均位于双子叶的分支,且比较紧密地聚集在一起,同源性较高。Ka/Ks值均小于1.0,表明NRT1.7蛋白在3个物种进化过程中保留其重要功能而存在纯化选择作用。

        长期以来,植物形成了一系列生理生化和分子机制适应外界环境的胁迫。硝酸盐不仅是一种重要的氮源,同时作为一种信号物质对硝酸盐转运体起到重要的调控作用。在低氮胁迫条件下,植物通过感受外界胁迫而产生一系列的适应性反应,包括生理、生化、转录和蛋白质组的改变,将氮素从衰老和成熟的组织中转运到新生和活跃的组织和器官中[3, 60-62],在这个过程中,许多基因的表达都受缺氮胁迫的影响,或被诱导或被抑制,共同调节植物对氮的重新分配来增强植物抵御低氮胁迫的能力[63-65]。本研究中,油菜湘油15号在低氮处理0~72 h时,根部BnaA7.NRT1.7bBnaC6.NRT1.7b基因的相对表达量上调而抑制地上部BnaCn.NRT1.7基因的表达,它们在不同组织水平发挥作用,且低氮胁迫下基因的表达模式相反,共同调控植物对低氮的适应能力。氮饥饿3天后供氮6 h,地上部和根部BnaNRT1.7家族成员的基因表达均受到抑制。其中,地上部主要是BnaCn.NRT1.7基因发挥作用,根部主要是BnaA7.NRT1.7bBnaC6.NRT1.7b基因起主导作用,这与甘蓝型油菜NRT1.7基因的共表达网络分析一致。

        甘蓝型油菜作为一种落叶性强的油料作物,后期老叶中的氮素尚未充分再转运至新叶和籽粒中即发生脱落,从而导致油菜较低的氮素利用效率,同时对环境造成污染。BnaNRT1.7介导的氮素分配效率是决定油菜氮素利用率高低的一个关键因素[6-8, 25-28]。因此,深入了解NRT1.7的基因结构和进化关系对更好地发挥其功能具有重要的意义,同时也为NRT1.7家族基因在其他物种中的功能研究提供依据。

      • 甘蓝型油菜NRT1.7蛋白进化过程相对保守,基因结构相似,启动子上的顺式作用原件CACTFTPPCAI (YACT)、Dof (AAg)、MYB可能参与了甘蓝型油菜对氮胁迫的响应。

    参考文献 (65)

    目录

      /

      返回文章
      返回