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壳聚糖对NaCl胁迫下菜用大豆结瘤固氮的影响

王聪 徐志伟

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壳聚糖对NaCl胁迫下菜用大豆结瘤固氮的影响

    作者简介: 王聪 Tel:0475-8314809,E-mail:tongliaowangcong@163.com;
  • 基金项目: 国家自然科学基金项目 (31260472)。

Effects of chitosan on nodulation and nitrogen fixation of vegetable soybean under NaCl stress

  • 摘要: 【目的】研究壳聚糖对盐胁迫抑制菜用大豆结瘤固氮的缓解效应,为进一步探讨壳聚糖抗逆机理提供新的线索。【方法】以蛭石为基质,以菜用大豆‘特早王’–根瘤菌共生体系为研究对象,采用人工气候箱培养,研究NaCl胁迫下壳聚糖对菜用大豆根瘤形成、生物固氮的影响。菌种为与‘特早王’共生匹配性较好的快生根瘤菌N18。接种后的植株进行如下4个处理:1) 叶面喷施清水,根部浇灌无氮营养液 (CK);2) 叶面喷施壳聚糖水溶液,根部浇灌无氮营养液 (CTS);3) 叶面喷施清水,根部浇灌溶有NaCl的无氮营养液 (Cl);4) 叶面喷施壳聚糖水溶液,根部浇灌溶有NaCl的无氮营养液 (CTS+Cl)。上述各处理施用的水或水溶液均为无菌水配制,NaCl处理的浓度为50 mol/L,CTS处理的适宜浓度为200 mg/L。接种30天后,将大豆植株取出,用清水将根部蛭石冲洗干净后,立即测定根瘤固氮酶活性、根瘤数及根瘤鲜重,然后测定根瘤豆血红蛋白含量和根系活力,最后测植株干重和全氮量。【结果】氯化钠胁迫下,植株干重显著下降,与CK 相比降幅达49%,喷施壳聚糖后 (CTS +Cl),降低幅度显著减小,但依然显著低于CK (P < 0.05)。无盐条件下,与CK相比,壳聚糖处理 (CTS) 增加植株干重的效果不明显。喷施壳聚糖显著增加了菜用大豆的根瘤数、根瘤鲜重、植株含氮量、根系活力、豆血红蛋白含量及固氮酶活性 (P < 0.05)。NaCl胁迫显著抑制了菜用大豆的结瘤固氮作用,其中根瘤数、根瘤鲜重分别较CK下降了79%、90%,而壳聚糖处理 (CTS+Cl) 使菜用大豆在盐逆境下的结瘤数、根瘤鲜重、植株全氮含量、根系活力、豆血红蛋白含量及固氮酶活性等均显著回升,增幅分别达对照的29%、20%、17%、48%、19%、21%,但均显著低于CK。【结论】非NaCl胁迫下,喷施壳聚糖可以显著促进菜用大豆结瘤,提高豆血红蛋白含量及固氮酶活性,最终增加植株含氮量。在NaCl胁迫下,外源壳聚糖可以显著缓解氯化钠胁迫导致的对根系活力和结瘤固氮的影响。因此,叶面喷施壳聚糖是促进菜用大豆结瘤固氮和生长的有效措施。
  • 图 1  CaCl胁迫下壳聚糖处理菜用大豆植株干重

    Figure 1.  Dry weight of vegetable soybean plants with chitosan treatments under NaCl stress

    图 2  NaCl胁迫下壳聚糖处理菜用大豆根系生长及结瘤

    Figure 2.  Root growth and nodulation of vegetable soybean with chitosan treatments under NaCl stress

    图 3  不同处理菜用大豆根系活力

    Figure 3.  Root activity of vegetable soybean under different treatments

    图 4  不同处理菜用大豆根瘤豆血红蛋白含量和固氮酶活性

    Figure 4.  Leghemoglobin content and nitrogenase activity of vegetable soybean nodules under different treatments

    表 1  NaCl胁迫下壳聚糖处理菜用大豆的结瘤固氮

    Table 1.  Nodulation and nitrogen fixation of vegetable soybean with chitosan treatments under NaCl stress

    处理
    Treatment
    根瘤数 Nodule number
    (No./plant)
    根瘤鲜重 Nodule weight
    (mg/plant, FW)
    植株含氮量 Plant N content
    (g/kg)
    CK32.63 ± 1.65 b232.67 ± 11.17 b20.63 ± 1.18 b
    CTS42.11 ± 1.74 a305.67 ± 15.18 a23.58 ± 1.00 a
    Cl 6.90 ± 0.57 d24.33 ± 1.09 d14.18 ± 0.49 d
    CTS +Cl16.36 ± 0.79 c71.33 ± 2.21 c17.61 ± 2.03 c
    注(Note):同列数值后不同字母表示处理间差异显著 (P < 0.05) Values followed by different letters in the same column indicate significant difference among treatments (P < 0.05).
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-04-10
  • 网络出版日期:  2020-02-06
  • 刊出日期:  2020-01-01

壳聚糖对NaCl胁迫下菜用大豆结瘤固氮的影响

    作者简介:王聪 Tel:0475-8314809,E-mail:tongliaowangcong@163.com
  • 1. 内蒙古民族大学农学院,内蒙古通辽 028042
  • 2. 呼和浩特市赛罕区蔬菜局,内蒙古呼和浩特 010000
  • 基金项目: 国家自然科学基金项目 (31260472)。
  • 摘要: 【目的】研究壳聚糖对盐胁迫抑制菜用大豆结瘤固氮的缓解效应,为进一步探讨壳聚糖抗逆机理提供新的线索。【方法】以蛭石为基质,以菜用大豆‘特早王’–根瘤菌共生体系为研究对象,采用人工气候箱培养,研究NaCl胁迫下壳聚糖对菜用大豆根瘤形成、生物固氮的影响。菌种为与‘特早王’共生匹配性较好的快生根瘤菌N18。接种后的植株进行如下4个处理:1) 叶面喷施清水,根部浇灌无氮营养液 (CK);2) 叶面喷施壳聚糖水溶液,根部浇灌无氮营养液 (CTS);3) 叶面喷施清水,根部浇灌溶有NaCl的无氮营养液 (Cl);4) 叶面喷施壳聚糖水溶液,根部浇灌溶有NaCl的无氮营养液 (CTS+Cl)。上述各处理施用的水或水溶液均为无菌水配制,NaCl处理的浓度为50 mol/L,CTS处理的适宜浓度为200 mg/L。接种30天后,将大豆植株取出,用清水将根部蛭石冲洗干净后,立即测定根瘤固氮酶活性、根瘤数及根瘤鲜重,然后测定根瘤豆血红蛋白含量和根系活力,最后测植株干重和全氮量。【结果】氯化钠胁迫下,植株干重显著下降,与CK 相比降幅达49%,喷施壳聚糖后 (CTS +Cl),降低幅度显著减小,但依然显著低于CK (P < 0.05)。无盐条件下,与CK相比,壳聚糖处理 (CTS) 增加植株干重的效果不明显。喷施壳聚糖显著增加了菜用大豆的根瘤数、根瘤鲜重、植株含氮量、根系活力、豆血红蛋白含量及固氮酶活性 (P < 0.05)。NaCl胁迫显著抑制了菜用大豆的结瘤固氮作用,其中根瘤数、根瘤鲜重分别较CK下降了79%、90%,而壳聚糖处理 (CTS+Cl) 使菜用大豆在盐逆境下的结瘤数、根瘤鲜重、植株全氮含量、根系活力、豆血红蛋白含量及固氮酶活性等均显著回升,增幅分别达对照的29%、20%、17%、48%、19%、21%,但均显著低于CK。【结论】非NaCl胁迫下,喷施壳聚糖可以显著促进菜用大豆结瘤,提高豆血红蛋白含量及固氮酶活性,最终增加植株含氮量。在NaCl胁迫下,外源壳聚糖可以显著缓解氯化钠胁迫导致的对根系活力和结瘤固氮的影响。因此,叶面喷施壳聚糖是促进菜用大豆结瘤固氮和生长的有效措施。

    English Abstract

    • 豆科植物发育过程中根与根瘤菌形成根瘤固氮体,根瘤的共生固氮作用为豆科植物生长提供了重要的氮素来源,对豆科植物产量和品质的提高具有重要作用。根瘤菌与豆科植物共生关系的建立是根瘤菌、植物及环境三方相互作用的结果。豆科植物结瘤要受到环境因子的限制,环境因子发生改变,必将影响根瘤菌与豆科植物共生体系的建立。研究发现,豆科植物与根瘤菌共生关系的建立对土壤盐分非常敏感。在50~100 mmol/L NaCl 条件下,大豆根系根瘤菌侵染率显著下降[1],在210 mmol/L NaCl条件下,蚕豆根系结瘤完全被抑制[2]

      壳聚糖 (CTS) 是甲壳素脱乙酰化后得到的一种聚氨基葡萄糖,在自然界的合成量仅次于纤维素,是一种非常廉价、清洁的化学物质,且其能够增强植株对逆境胁迫的抗性。潘丽芹等[3]的研究发现,壳聚糖可显著提高NaCl胁迫下白三叶草幼苗的株高、鲜重、干重和根冠比,有效减轻了盐渍伤害。外源壳聚糖对NaCl胁迫下菜用大豆叶绿体内抗坏血酸–谷胱甘肽 (AsA-GSH) 循环产生了显著的诱导作用,维持了较强的活性氧清除能力,进而显著提高了其净光合速率[4-5]。但壳聚糖对盐逆境下豆科植物结瘤固氮的影响的研究尚鲜有报道。盐逆境下,外源壳聚糖对豆科植物的结瘤固氮是否产生影响?能否缓解其对豆科植物结瘤固氮的抑制效应?是当前亟待探讨的问题。

      中国盐碱耕地达670万hm2,居世界第四位[6],且由于不合理的水肥管理,土壤盐渍化和次生盐渍化呈现继续扩大的趋势,已严重威胁到包括豆科植物在内的农业生产和生态环境的建设。在生产中,迫切需要一种简单可行且廉价、清洁的方法使豆科植物和根瘤菌在盐胁迫下仍能维持良好的共生关系,提高其结瘤固氮能力,同时,豆科植物–根瘤菌良好的共生关系也有助于提高植物的耐盐性。菜用大豆是一种高营养的保健食品,近年来,随着人们生活水平的提高和膳食结构的改变,其生产和市场得到迅速发展,露地及保护地栽培面积逐年增加。为此,本研究拟以菜用大豆–根瘤菌共生体系为试材,研究壳聚糖对NaCl胁迫下其结瘤固氮的调节作用,探讨壳聚糖对盐胁迫抑制根瘤菌结瘤固氮的缓解效应,为进一步揭示壳聚糖抗逆机理提供新的线索。

      • 菜用大豆选用当地主栽品种‘特早王’,根瘤菌种为与其共生匹配性较好的快生根瘤菌N18[7](菌种购自黑龙江省科学院微生物研究所)。

      • 挑选种皮无破损、饱满度相近的种子,先用95%乙醇冲洗30 s,再用1∶5(次氯酸钠与无菌水的体积比) 次氯酸钠溶液消毒3 min,捞出后播入口径10 cm、高10 cm、底部具小孔的硬质塑料钵中,蛭石作基质,每钵2粒,每钵定苗1株。

        幼苗2片真叶完全展开后接种。将根瘤菌悬浮液稀释至OD600值约为0.1,用移液枪取摇匀的菌悬液喷注到幼苗根部周围,每株接种1 mL[8],然后再覆盖一薄层 (1 cm左右) 蛭石保湿。放入人工气候箱中培养,白天光强为 150 μmol/(m2·s),光周期为14 h光照/10 h黑暗,昼夜温度保持在25℃/18℃。

        所有实验用具、蛭石高温高压灭菌20 min。

      • 试验采用基质培养法,设4个处理:1) 叶面喷施清水,根部浇灌无氮营养液 (CK);2) 叶面喷施CTS水溶液,根部浇灌无氮营养液 (CTS);3) 叶面喷施清水,根部浇灌溶有NaCl的无氮营养液 (Cl);4) 叶面喷施CTS水溶液,根部浇灌溶有NaCl的无氮营养液 (CTS +Cl)。上述各处理施用的水或水溶液均为无菌水配制。每处理7株,3次重复,完全随机排列。CTS处理的适宜浓度为200 mg/L[7],NaCl处理的适宜浓度 (在此浓度下,菜用大豆能够生长,同时能够形成根瘤) 为50 mol/L(预备试验筛选)。

        接种当天进行CTS处理,用手持小型喷雾器将CTS溶液均匀喷洒在幼苗叶片上,以量足但不下滴为宜,对照和Cl处理喷洒无菌水。CTS诱导处理5天后进行NaCl处理,NaCl溶于1/4浓度无氮营养液,均匀浇入基质中。CK和CTS处理仅浇无氮营养液。

      • 接种30天 (NaCl处理25天) 后,将菜用大豆植株从塑料钵中取出,用清水将根部蛭石冲洗干净后,立即测定根瘤固氮酶活性,之后测定根瘤数及根瘤鲜重,然后进行根瘤豆血红蛋白含量、根系活力测定,最后将植株烘干后测其干重、全氮含量。

        用乙炔还原法[9]测定根瘤固氮酶活性,根瘤豆血红蛋白含量参照文献[10]中的方法测定,根系活力采用TTC法[11]测定,植株全氮含量采用凯氏定氮法[11]测定。

      • 应用SPSS软件对试验数据进行统计分析。

      • 图1可知,NaCl胁迫下,菜用大豆植株干重显著下降,较对照 (CK) 的降幅达49%,而壳聚糖处理 (CTS+Cl) 显著提高了菜用大豆的生物量,增幅可达CK的19%,但显著低于CK。无盐条件下,壳聚糖处理 (CTS) 与CK的差异不显著,但显著高于盐胁迫下壳聚糖处理 (CTS+Cl)。说明NaCl胁迫严重抑制了菜用大豆植株的生长,而壳聚糖处理可显著缓解其抑制作用,但无盐条件下壳聚糖对菜用大豆植株生长的诱导作用不显著。

        图  1  CaCl胁迫下壳聚糖处理菜用大豆植株干重

        Figure 1.  Dry weight of vegetable soybean plants with chitosan treatments under NaCl stress

      • 表1图2显示,NaCl胁迫大幅减少了菜用大豆的根瘤数和根瘤鲜重,降幅分别达CK的79%、90%,而壳聚糖处理使菜用大豆的结瘤数及根瘤鲜重均显著回升,增幅分别为CK的29%、20%。无盐条件下,壳聚糖处理显著提高了菜用大豆的根瘤数和根瘤鲜重,增幅分别为CK的29%、31%。表明在盐胁迫和无盐条件下壳聚糖对菜用大豆根瘤的形成均有显著的促进作用。

        表 1  NaCl胁迫下壳聚糖处理菜用大豆的结瘤固氮

        Table 1.  Nodulation and nitrogen fixation of vegetable soybean with chitosan treatments under NaCl stress

        处理
        Treatment
        根瘤数 Nodule number
        (No./plant)
        根瘤鲜重 Nodule weight
        (mg/plant, FW)
        植株含氮量 Plant N content
        (g/kg)
        CK32.63 ± 1.65 b232.67 ± 11.17 b20.63 ± 1.18 b
        CTS42.11 ± 1.74 a305.67 ± 15.18 a23.58 ± 1.00 a
        Cl 6.90 ± 0.57 d24.33 ± 1.09 d14.18 ± 0.49 d
        CTS +Cl16.36 ± 0.79 c71.33 ± 2.21 c17.61 ± 2.03 c
        注(Note):同列数值后不同字母表示处理间差异显著 (P < 0.05) Values followed by different letters in the same column indicate significant difference among treatments (P < 0.05).

        图  2  NaCl胁迫下壳聚糖处理菜用大豆根系生长及结瘤

        Figure 2.  Root growth and nodulation of vegetable soybean with chitosan treatments under NaCl stress

        菜用大豆植株的含氮量受NaCl胁迫伤害而显著下降,降幅达CK的31%,壳聚糖处理后植株含氮量显著回升,增幅达CK的17%。无盐条件下,壳聚糖处理显著提高了菜用大豆植株的含氮量。可见在盐胁迫和无盐条件下壳聚糖对菜用大豆与根瘤菌共生固氮均有显著的促进作用 (表1)。

        上述结果表明,壳聚糖通过促进菜用大豆根瘤的形成及发育,进而促进固氮作用,提高植株含氮量。

      • NaCl胁迫下,菜用大豆根系的发育受到了严重抑制,致使其根系活力较CK显著下降了62%,而壳聚糖处理有效促进了盐逆境下根系的生长,使根系活力回升了CK的48%。无盐条件下,壳聚糖显著提高了菜用大豆的根系活力,增幅达CK的17% (P < 0.05)。表明无论在盐胁迫还是无盐条件下,外源壳聚糖均可诱导提高菜用大豆根系的活力水平 (图3),增强其吸收能力,促进植株生长,为结瘤固氮奠定良好的物质基础。

        图  3  不同处理菜用大豆根系活力

        Figure 3.  Root activity of vegetable soybean under different treatments

      • 图4可见,菜用大豆根瘤豆血红蛋白的合成和固氮酶活性在NaCl胁迫下均受到了严重抑制,致使二者较CK大幅下降,降幅分别达34%和35%,而壳聚糖处理有效缓解了盐胁迫对其的抑制作用,使豆血红蛋白含量和固氮酶活性分别回升了CK的19%和21%。无盐条件下,壳聚糖处理显著提高了菜用大豆根瘤豆血红蛋白含量和固氮酶活性。可见,壳聚糖对菜用大豆根瘤豆血红蛋白的合成和固氮酶活性的提高有显著的促进作用,而二者协调变化是提高根瘤固氮效率的重要保障。

        图  4  不同处理菜用大豆根瘤豆血红蛋白含量和固氮酶活性

        Figure 4.  Leghemoglobin content and nitrogenase activity of vegetable soybean nodules under different treatments

      • 盐渍环境对豆科植物的结瘤固氮会产生严重的阻碍作用。李梅等[12]的研究发现,NaCl浓度大于100 mmol/L时,随着浓度的升高,蒺藜苜蓿根瘤数量不断减少,根瘤不断变小,同时固氮区细胞数量也相应减少。而王登科等[13]研究发现,NaCl抑制种子萌发,减缓根瘤菌的生长,降低根瘤菌的抗氧化能力,最终限制豆科绿肥作物的早期生长。本研究中,NaCl胁迫使菜用大豆根瘤数、根瘤鲜重大幅下降,最终导致植株含氮量下降,生长受阻 (表1图1)。这可能与NaCl抑制根瘤菌生长,降低根瘤菌的抗氧化能力有关。然而,NaCl胁迫使菜用大豆根系生长受阻[14-15],侧根短,侧根少 (图2),根毛发育不良而不宜结瘤[16],可能是导致菜用大豆根瘤少而小的另一主要原因。壳聚糖处理使盐胁迫下菜用大豆的结瘤数、根瘤鲜重显著升高,这表明壳聚糖可缓解NaCl对根瘤菌生长的抑制作用,提高其抗逆性。同时,壳聚糖可促进NaCl胁迫下菜用大豆根系的生长,使侧根长及侧根数显著增加 (图2),这可能是盐胁迫下壳聚糖诱导菜用大豆根瘤数、根瘤鲜重增加的重要原因之一。本研究中壳聚糖诱导NaCl胁迫下根系活力的提高也有力证明了壳聚糖在盐逆境下可改善菜用大豆根系生长状况,促进营养物质的吸收,进而改善地上部的生长和营养状况。此外,笔者前期的研究发现,外源壳聚糖使NaCl胁迫下菜用大豆的净光合速率显著升高[5]。这些结果均显示壳聚糖处理可为菜用大豆结瘤奠定良好的物质基础。这可能是外源壳聚糖提高盐胁迫下菜用大豆结瘤能力的另一重要因素。

        固氮酶能够将N2还原成NH3,因此其活性高低可直接反映根瘤类菌体的固氮效率。但根瘤固氮酶活性的发挥还需要高流量的低氧环境,豆血红蛋白则在这一过程中发挥着重要作用[17]。豆血红蛋白能够维持豆科植物根瘤内较低O2,并能有效地把 O2传递给类菌体的含铁血红蛋白,其浓度越高,根瘤的固氮酶活性也越高[18-19]。本研究中,壳聚糖显著提高了盐胁迫下菜用大豆根瘤的豆血红蛋白含量及固氮酶活性 (图4),说明壳聚糖可通过提高根瘤豆血红蛋白含量来保证固氮酶活性发挥对高流量低氧环境的需求,进而提高固氮酶活性,促进固氮作用有效进行。这可能是壳聚糖在盐逆境下提高菜用大豆植株含氮量的一个重要原因。此外,豆科植物的固氮过程同时也是一个耗能过程,因此,NaCl胁迫下菜用大豆植株含氮量的升高也与壳聚糖能够提高根系活力、增进吸收、提高光合效率[4]密切相关。

        豆科植物结瘤是非常复杂的过程,既需要大量能量,同时还需要特殊的根瘤菌信号分子诱导根瘤形成。在此过程中,蔗糖[20]、大豆异黄酮[21]、生长素[22]等对大豆结瘤发挥着重要作用。盐逆境下,壳聚糖如何调节上述结瘤相关物质代谢及其在根部的积累进而促进根瘤形成,如何调节氮代谢进而促进氮的固定,还有待进一步研究。

      • NaCl胁迫下,外源壳聚糖促进了菜用大豆根瘤的形成及发育,提高了根瘤的固氮效率,进而促进了植株的生长,表明壳聚糖对盐逆境抑制菜用大豆结瘤固氮具有显著的缓解效应,但壳聚糖促进结瘤固氮的机理还有待进一步研究。

    参考文献 (22)

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