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外源ABA提高甘蓝型油菜抗镉胁迫能力和氮素生理利用效率

王涛 唐天娇 廖佳元 姚珺玥 官春云 张振华

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外源ABA提高甘蓝型油菜抗镉胁迫能力和氮素生理利用效率

    作者简介: 王涛E-mail:849953259@qq.com;
    通讯作者: 张振华, E-mail:zhzh1468@163.com
  • 基金项目: 国家重点研发计划(2017YFD0200100,2017YFD0200103);国家油菜产业体系项目;湖南农业大学双一流建设项目(kxk201801005)。

Exogenous abscisic acid improves resistance to cadmium stress and physiological nitrogen use efficiency in Brassica napus

    Corresponding author: ZHANG Zhen-hua, E-mail:zhzh1468@163.com
  • 摘要:   【目的】  植物脱落酸 (ABA) 可调节植物生长、种子休眠和叶片衰老,还可对非生物胁迫作出反应。比较添加外源ABA前后镉 (Cd) 胁迫下甘蓝型油菜的生理反应,可深化对脱落酸提高作物抗性和氮素生理利用效率作用机理的认识。  【方法】  供试甘蓝型油菜品种为814号,试验设3个处理:正常培养 (CK)、10 μmol/L CdCl2 (Cd) 和5 μmol/L ABA + 10 μmol/L CdCl2 (A + Cd)。在处理4天后,观察甘蓝型油菜表型,测定脯氨酸及丙二醛 (MDA) 含量、Cd含量、硝酸盐和铵盐含量以及硝酸还原酶 (NR)、谷氨酰胺合成酶 (GS) 活性等相关指标。  【结果】  与Cd处理相比,A + Cd处理甘蓝型油菜新叶SPAD值提高了1.1倍,根部脯氨酸含量增加了29.0%,MDA 含量降低了48.3%。外源ABA的添加会抑制甘蓝型油菜对Cd的吸收,降低甘蓝型油菜地上部和地下部Cd含量,减小Cd对甘蓝型油菜的毒害作用,影响甘蓝型油菜对NO3的吸收,降低油菜体内的总氮含量。与Cd处理相比,A + Cd处理甘蓝型油菜根部NR活性显著提高82.8%,更多的NH4+分配到了地上部,地上部GS活性升高了32.1%,增强了甘蓝型油菜体内的氮同化和代谢过程,氮素生理利用效率显著提高了17.2%。  【结论】  外源ABA的添加可降低Cd的吸收量,提高氮代谢相关酶活性,促进脯氨酸的合成和降低丙二醛的生成,进而增强甘蓝型油菜对Cd的抗性,增强甘蓝型油菜体内氮同化和代谢的过程,并提高甘蓝型油菜的氮素生理利用效率。
  • 图 1  不同处理甘蓝型油菜表型、SPAD值及干生物量和鲜生物量

    Figure 1.  Resistant phenotype, SPAD values and biomass of B. napus under different treatments

    图 2  不同处理甘蓝型油菜植株地上部和根部镉含量

    Figure 2.  Cadmium content in shoots and roots of B. napus under different treatments

    图 3  不同处理下甘蓝型油菜根部脯氨酸和丙二醛含量

    Figure 3.  Proline and MDA contents in roots of B. napus under different treatments

    图 4  不同处理下甘蓝型油菜植株氮素含量与BnNRT1.1基因表达

    Figure 4.  The nitrogen content and expression of BnNRT1.1 of B. napus under different treatments

    图 5  不同处理下甘蓝型油菜NR和GS活性

    Figure 5.  NR and GS activities of B. napus under different treatments

    图 6  不同处理甘蓝型油菜根部与地上部的铵盐比值和植株氮素生理利用效率

    Figure 6.  The NH4+ root/shoot ratio and physiological nitrogen use efficiency of B. napus under different treatments

  • [1] 刘红梅, 杨凯, 肖正午. 土壤镉污染治理及外源调控研究进展[J]. 作物研究, 2018, 32(5): 449–453. Liu H M, Yang K, Xiao Z W. Research progress of soil cadmium pollution control and exogenous regulation[J]. Crop Research, 2018, 32(5): 449–453.
    [2] 张兴梅, 杨清伟, 李扬. 土壤镉污染现状及修复研究进展[J]. 河北农业科学, 2010, 14(3): 79–81. Zhang X M, Yang Q W, Li Y. Progress of status and remediation of soil cadmium pollution[J]. Journal of Hebei Agricultural Sciences, 2010, 14(3): 79–81. doi:  10.3969/j.issn.1088-1631.2010.03.030
    [3] 李婧, 周艳文, 陈森, 等. 我国土壤镉污染现状、危害及其治理方法综述[J]. 安徽农学通报, 2015, 21(24): 104–107. Li J, Zhou Y W, Chen S, et al. Actualities, damage and management of soil cadmium pollution in China[J]. Anhiu Agricultural Science Bulletin, 2015, 21(24): 104–107. doi:  10.3969/j.issn.1007-7731.2015.24.044
    [4] Fujii H, Zhu J K. Arabidopsis mutant deficient in 3 abscisic acid-activated protein kinases reveals critical roles in growth, reproduction, and stress[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2009, 106: 8380–8385. doi:  10.1073/pnas.0903144106
    [5] Gonzalez-Guzman M, Pizzio G A, Antoni R, et al. Arabidopsis PYR/PYL/RCAR receptors play a major role in quantitative regulation of stomatal aperture and transcriptional response to abscisic acid[J]. Plant Cell, 2012, 24: 2483–2496. doi:  10.1105/tpc.112.098574
    [6] Zhao Y, Chan Z, Gao J, et al. ABA receptor PYL9 promotes drought resistance and leaf senescence[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2016, 113: 1949–1954. doi:  10.1073/pnas.1522840113
    [7] Hsu Y T, Kao C H. Role of abscisic acid in cadmium tolerance of rice (Oryza sativa L.) seedlings[J]. Plant Cell and Environment, 2003, 26: 867–874. doi:  10.1046/j.1365-3040.2003.01018.x
    [8] Uraguchi S, Mori S, Kuramata M, et al. Root-to-shoot Cd translocation via the xylem is the major process determining shoot and grain cadmium accumulation in rice[J]. Journal of Experimental Botany, 2009, 60: 2677–2688. doi:  10.1093/jxb/erp119
    [9] Fan S K, Fang X Z, Guan M Y, et al. Exogenous abscisic acid application decreases cadmium accumulation in Arabidopsis plants, which is associated with the inhibition of IRT1-mediated cadmium uptake[J]. Frontiers in Plant Science, 2014, 5: 721.
    [10] 任涛, 鲁剑巍. 中国冬油菜氮素养分管理策略[J]. 中国农业科学, 2016, 49(18): 3506–3521. Ren T, Lu J W. Integrated nitrogen management strategy for winter oilseed rape (Brassica napus L.) in China[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2016, 49(18): 3506–3521. doi:  10.3864/j.issn.0578-1752.2016.18.005
    [11] Zhang D, Hua Y, Wang X, et al. A high-density genetic map identifies a novel major QTL for boron efficiency in oilseed rape (Brassica napus L.)[J]. PLoS ONE, 2014, 9: e112089. doi:  10.1371/journal.pone.0112089
    [12] Han Y L, Song H X, Liao Q, et al. Nitrogen use efficiency is mediated by vacuolar nitrate sequestration capacity in roots of Brassica napus[J]. Plant Physiology, 2016, 170: 1684–1698. doi:  10.1104/pp.15.01377
    [13] Kramer G F, Norman H A, Krizek D T, et al. Influence of UV-B radiation on polyamines, lipid peroxidation and membrane lipids in cucumber[J]. Phytochemistry, 1991, 30: 2101–2108. doi:  10.1016/0031-9422(91)83595-C
    [14] Song W Y, Yamaki T, Yamaji N, et al. A rice ABC transporter, OsABCC1, reduces arsenic accumulation in the grain[J]. Proceeding of National Academy of Sciences of the United States of America, 2014, 111: 15699–15704. doi:  10.1073/pnas.1414968111
    [15] Bates L, Waldren R, Teare I. Rapid determination of free proline for water-stress studies[J]. Plant and Soil, 1973, 39: 205–207. doi:  10.1007/BF00018060
    [16] Sharma P, Dubey R S. Modulation of nitrate reductase activity in rice seedlings under aluminum toxicity and water stress: role of osmolytes as enzyme protectant[J]. Journal of Plant Physiology, 2005, 162: 854–864. doi:  10.1016/j.jplph.2004.09.011
    [17] Cataldo D A, Maroon M, Schrader L E, et al. Rapid colorimetric determination of nitrate in plant tissue by nitration of salicylic acid[J]. Communication in Soil Science and Plant Analysis, 1975, 6: 71–80. doi:  10.1080/00103627509366547
    [18] Zanini E. Indophenol blue colorimetric method for measuring cation exchange capacity in sandy soils[J]. Communications in Soil Science and Plant Analysis, 2001, 32: 2519–2530. doi:  10.1081/CSS-120000388
    [19] Fan X, Jia L, Li Y, et al. Comparing nitrate storage and remobilization in two rice cultivars that differ in their nitrogen use efficiency[J]. Journal of Experimental Botany, 2007, 58: 1729–1740. doi:  10.1093/jxb/erm033
    [20] O'Neal D, Joy K W. Glutamine synthetase of pea leaves. I. Purification, stabilization, and pH optima[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1973, 159: 113–122. doi:  10.1016/0003-9861(73)90435-9
    [21] Bustin S A, Benes V, Garson J A, et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments[J]. Clinical Chemistry, 2009, 55: 611–622. doi:  10.1373/clinchem.2008.112797
    [22] Wang Z, Chen Y, Fang H, et al. Selection of reference genes for quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction normalization in Brassica napus under various stress conditions[J]. Molecular Genetics and Genomics, 2014, 289: 1023–1035. doi:  10.1007/s00438-014-0853-1
    [23] Wang T, Hua Y, Chen M, et al. Mechanism enhancing Arabidopsis resistance to cadmium: the role of NRT1.5 and proton pump[J]. Frontiers in Plant Science, 2018, 9: 1892. doi:  10.3389/fpls.2018.01892
    [24] Pompeu G B, Vilhena M B, Gratão P L, et al. Abscisic acid-deficient sit tomato mutant responses to cadmium-induced stress[J]. Protoplasma, 2017, 254: 771–783. doi:  10.1007/s00709-016-0989-4
    [25] Shen G, Niu J, Deng Z. Abscisic acid treatment alleviates cadmium toxicity in purple flowering stalk (Brassica campestris L. ssp. chinensis var. purpurea Hort.) seedlings[J]. Plant Physiology and Biochemistry, 2017, 118: 471–478. doi:  10.1016/j.plaphy.2017.07.018
    [26] Zhang Z H, Song H X, Liu Q, et al. Nitrogen redistribution characteristics of oilseed rape (Brassica napus L .). varieties with different nitrogen-use efficiencies during later growth period[J]. Communications in Soil Science and Plant Analysis, 2010, 41(14): 1693–1706. doi:  10.1080/00103624.2010.489134
    [27] Chen X, Cui Z, Fan M, et al. Producing more grain with lower environmental costs[J]. Nature, 2014, 514(7523): 486. doi:  10.1038/nature13609
    [28] Koprivova A, Harper A L, Trick M, et al. Dissection of the control of anion homeostasis by associative transcriptomics in Brassica napus[J]. Plant Physiology, 2014, 166(1): 442–450. doi:  10.1104/pp.114.239947
    [29] Granstedt R C, Huffaker R C. Identification of the leaf vacuole as a major nitrate storage pool[J]. Plant Physiology, 1982, 70(2): 410–413. doi:  10.1104/pp.70.2.410
    [30] Fuentes S I, Allen D J, Ortiz-Lopez A, Hernández G. Over expression of cytosolic glutamine synthetase increases photosynthesis and growth at low nitrogen concentrations[J]. Journal of Experimental Botany, 2001, 52: 1071–1081. doi:  10.1093/jexbot/52.358.1071
    [31] Oliveira I C, Brears T, Knight T J, et al. Overexpression of cytosolic glutamine synthetase. Relation to nitrogen, light, and photorespiration[J]. Plant Physiology, 2002, 129: 1170–1180. doi:  10.1104/pp.020013
    [32] Wang W, Hu B, Yuan D, et al. Expression of the nitrate transporter gene OsNRT1.1A/OsNPF6.3 confers high yield and early maturation in rice[J]. The Plant Cell, 2018, 30(3): 638–651. doi:  10.1105/tpc.17.00809
    [33] 邹小云, 刘宝林, 宋来强, 等. 花期渍水逆境下氮素对油菜产量及氮肥利用效率的影响[J]. 应用生态学报, 2016, 27(4): 1169–1176. Zou X Y, Liu B L, Song L Q, et al. Effects of nitrogen application on yield and nitrogen use efficiency of rapeseed (Brassica napus) under waterlogging stress at flowering stage[J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2016, 27(4): 1169–1176.
  • [1] 潘维徐茜茹卢琪刘越薛琬蕾宋必秀都韶婷* . 不同氮形态对镉胁迫下小白菜生长及镉含量的影响. 植物营养与肥料学报, 2017, 23(4): 973-982. doi: 10.11674/zwyf.16416
    [2] 谭长强何琴飞秦玉燕申文辉刘秀曹艳云 . 施氮对镉胁迫下杂交相思树生长及镉吸收分配的影响. 植物营养与肥料学报, 2017, 23(5): 1326-1334. doi: 10.11674/zwyf.17011
    [3] 周健郝苗刘永红付庆灵朱俊胡红青 . 不同价态硒缓解小油菜镉胁迫的生理机制. 植物营养与肥料学报, 2017, 23(2): 444-450. doi: 10.11674/zwyf.16283
    [4] 肖强王刚衣艳君史衍玺杨洪兵刘家尧 . 外源脱落酸增强甘薯幼苗耐盐性的作用. 植物营养与肥料学报, 2016, 22(1): 201-208. doi: 10.11674/zwyf.14317
    [5] 李鹏程董合林刘爱忠刘敬然李如义孙淼李亚兵毛树春 . 施氮量对棉花功能叶片生理特性、 氮素利用效率及产量的影响. 植物营养与肥料学报, 2015, 21(1): 81-91. doi: 10.11674/zwyf.2015.0109
    [6] 刘春梅罗盛国刘元英 . 硒对镉胁迫下寒地水稻镉含量与分配的影响. 植物营养与肥料学报, 2015, 21(1): 190-199. doi: 10.11674/zwyf.2015.0121
    [7] 刘柿良潘远智杨容孑丁继军何杨王力马明东* . 外源一氧化氮对镉胁迫下长春花质膜过氧化、ATPase及矿质营养吸收的影响. 植物营养与肥料学报, 2014, 20(2): 445-458. doi: 10.11674/zwyf.2014.0222
    [8] 郭磊蔡志翔张斌斌许建兰宋宏峰马瑞娟* . 叶片喷施脱落酸对桃果实着色及相关基因表达的影响. 植物营养与肥料学报, 2013, 19(6): 1464-1470. doi: 10.11674/zwyf.2013.0622
    [9] 杨玉敏张庆玉杨武云田丽雷建容张冀李俊 . 镉胁迫对不同基因型小麦产量及构成因子的影响. 植物营养与肥料学报, 2011, 17(3): 532-538. doi: 10.11674/zwyf.2011.0229
    [10] 姜琳琳韩立思韩晓日战秀梅左仁辉吴正超袁程 . 氮素对玉米幼苗生长、根系形态及氮素吸收利用效率的影响. 植物营养与肥料学报, 2011, 17(1): 247-253. doi: 10.11674/zwyf.2011.0134
    [11] 尤江峰候宁宁徐睦芸刘宁张红梅兰图杨振明 . 铝胁迫下大豆根系脱落酸累积与柠檬酸分泌的关系研究. 植物营养与肥料学报, 2010, 16(4): 899-905. doi: 10.11674/zwyf.2010.0418
    [12] 路文静张树华郭程瑾段巍巍肖凯 , . 不同氮素利用效率小麦品种的氮效率相关生理参数研究. 植物营养与肥料学报, 2009, 15(5): 985-991. doi: 10.11674/zwyf.2009.0501
    [13] 范洪黎王旭周卫* . 添加有机酸对土壤镉形态转化及苋菜镉积累的影响 . 植物营养与肥料学报, 2008, 14(1): 132-138. doi: 10.11674/zwyf.2008.0121
    [14] 张桃红徐国明陈苗苗张桂银袁建华 . 几种铵盐对土壤吸附Cd2+和Zn2+的影响. 植物营养与肥料学报, 2008, 14(3): 445-449. doi: 10.11674/zwyf.2008.0306
    [15] 李燕婷白灯莎买买提艾力张福锁江荣风毛达如 . 根际施肥调控对油菜硝酸盐含量的影响研究. 植物营养与肥料学报, 2005, 11(4): 524-529. doi: 10.11674/zwyf.2005.0416
    [16] 马建军朱京涛张淑霞吴贺平邹德文 . 稀土对缓解油菜镉胁迫的研究. 植物营养与肥料学报, 2004, 10(2): 221-224. doi: 10.11674/zwyf.2004.0223
    [17] 李海云王秀峰 . 含硝酸根化肥对黄瓜叶片脱落酸含量及叶绿体超微结构的影响. 植物营养与肥料学报, 2004, 10(3): 324-326. doi: 10.11674/zwyf.2004.0320
    [18] 刘厚诚邝炎华陈日远 . 缺磷胁迫对长豇豆幼苗脱落酸含量的影响. 植物营养与肥料学报, 2004, 10(6): 629-632. doi: 10.11674/zwyf.2004.0614
    [19] 汪洪周卫林葆 . 钙对镉胁迫下玉米生长及生理特性的影响. 植物营养与肥料学报, 2001, 7(1): 78-87. doi: 10.11674/zwyf.2001.0112
    [20] 周卫汪洪林葆 . 镉胁迫下钙对镉在玉米细胞中分布及对叶绿体结构与酶活性的影响. 植物营养与肥料学报, 1999, 5(4): 335-340. doi: 10.11674/zwyf.1999.0407
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-05-10
  • 网络出版日期:  2020-04-23
  • 刊出日期:  2020-03-01

外源ABA提高甘蓝型油菜抗镉胁迫能力和氮素生理利用效率

    作者简介:王涛E-mail:849953259@qq.com
    通讯作者: 张振华, zhzh1468@163.com
  • 湖南农业大学资源环境学院/南方粮油作物协同创新中心/土壤肥料资源高效利用国家工程实验室/农田污染控制与农业资源利用湖南省重点实验室/植物营养湖南省普通高等学校重点实验室,湖南长沙 410128
  • 基金项目: 国家重点研发计划(2017YFD0200100,2017YFD0200103);国家油菜产业体系项目;湖南农业大学双一流建设项目(kxk201801005)。
  • 摘要:   【目的】  植物脱落酸 (ABA) 可调节植物生长、种子休眠和叶片衰老,还可对非生物胁迫作出反应。比较添加外源ABA前后镉 (Cd) 胁迫下甘蓝型油菜的生理反应,可深化对脱落酸提高作物抗性和氮素生理利用效率作用机理的认识。  【方法】  供试甘蓝型油菜品种为814号,试验设3个处理:正常培养 (CK)、10 μmol/L CdCl2 (Cd) 和5 μmol/L ABA + 10 μmol/L CdCl2 (A + Cd)。在处理4天后,观察甘蓝型油菜表型,测定脯氨酸及丙二醛 (MDA) 含量、Cd含量、硝酸盐和铵盐含量以及硝酸还原酶 (NR)、谷氨酰胺合成酶 (GS) 活性等相关指标。  【结果】  与Cd处理相比,A + Cd处理甘蓝型油菜新叶SPAD值提高了1.1倍,根部脯氨酸含量增加了29.0%,MDA 含量降低了48.3%。外源ABA的添加会抑制甘蓝型油菜对Cd的吸收,降低甘蓝型油菜地上部和地下部Cd含量,减小Cd对甘蓝型油菜的毒害作用,影响甘蓝型油菜对NO3的吸收,降低油菜体内的总氮含量。与Cd处理相比,A + Cd处理甘蓝型油菜根部NR活性显著提高82.8%,更多的NH4+分配到了地上部,地上部GS活性升高了32.1%,增强了甘蓝型油菜体内的氮同化和代谢过程,氮素生理利用效率显著提高了17.2%。  【结论】  外源ABA的添加可降低Cd的吸收量,提高氮代谢相关酶活性,促进脯氨酸的合成和降低丙二醛的生成,进而增强甘蓝型油菜对Cd的抗性,增强甘蓝型油菜体内氮同化和代谢的过程,并提高甘蓝型油菜的氮素生理利用效率。

    English Abstract

    • 据不完全统计,我国目前约有2000万hm2的耕地受镉污染,约占总耕地面积的1/5,每年因此造成的经济损失仅在粮食作物上就达200 亿元[1]。镉是众所周知的重金属“五毒”元素之一,具有污染周期长、移动性大、毒性高等特点,在生产活动中容易被作物吸收富集,不仅严重影响作物的产量和品质,而且可以通过食物链在人体中积累危害人体健康[2-3]

      植物脱落酸 (ABA) 不仅可以调节植物生长、种子休眠和叶片衰老,而且还可以对不同的非生物胁迫作出反应[4-6]。许多研究报道,外源ABA的添加抑制了镉的吸收,增加了拟南芥和水稻对镉的抗性[7-9]。氮素是植物最重要的营养元素之一,植物高效的氮素利用效率是植物产量和品质的保证[10]。因此在镉污染地区,研究如何使植物减少对镉的吸收以减少通过食物链进入人体的镉,并且能保证植物有一个较高的氮素利用效率意义十分重大。

      基于此,通过水培实验,比较研究镉处理及镉加ABA处理对甘蓝型油菜幼苗镉积累、镉抗性、氮代谢和氮素利用效率的影响,以期为实现增强植物抗镉能力和氮素养分的持续高效利用提供科学依据。

      • 采用水培试验,选择甘蓝型油菜 (Brassica napus) 品种‘814号’作为供试材料,该品种从湖南省国家油料作物改良中心获得。将油菜种子播种于塑料盒内铺设的纱布上,用去离子水浸泡。6 天后,将幼苗移植到含有营养液的4 L塑料盒中。试验采用完全随机区组设计,重复6 次。营养液由5.0 mmol/L KNO3、1.0 mmol/L KH2PO4、2.0 mmol/L MgSO4·7H2O、5.0 mmol/L Ca(NO3)2·4H2O、0.05 mmol/L Fe-EDTA、9 μmol/L MnCl2·4H2O、0.8 μmol/L ZnSO4·7H2O、0.3 μmol/L CuSO4·5H2O、0.1 μmol/L NaMoO4·2H2O和50 μmol/L H3BO3组成[11]。每5 天更换一次营养液,并且在培养10 天后,再处理4 天。试验设置3 个处理,分别为CK (正常培养)、10 μmol/L Cd和5 μmol/L ABA + 10 μmol/L Cd处理。

        光照培养室设立于湖南农业大学第八教学楼内,温室环境如下:相对湿度为70%,温室温度恒定为22℃,光照强度300~320 mm/(m2∙s),光照/黑暗周期为14 h/10 h。培养塑料盒以完全随机的方式排列,为避免培养过程产生差异,在下次更换营养液时再一次随机摆放塑料盒的顺序,每次试验的各个处理设置4次生物学重复,2个实验平行。

      • 采用SPAD仪 (SPAD–502 Plus) 进行测定。

      • 将植株样品按地上部和根部分开取样后,将其放入105℃烘箱内杀青30 min,并在65℃下烘两天,保证样品完全烘干并保持稳定,称取其重量。将样品转移至消煮瓶内,加入5 mL浓H2SO4,并在350℃下消煮至流体状,待稍微冷却后再加入适量的H2O2,继续消煮使之清澈透明。用蒸馏水稀释至一定浓度后用AA3流动分析仪 (Autoanalyzer 3,SEAL,德国) 测定样品的总氮含量[12]。氮素生理利用效率 (physiological nitrogen use efficiency,PNUE) 计算公式为:PNUE (kg/kg) = 植株总生物量 (kg/plant)/植株总氮量 (kg/plant)。

        将烘干样品置于10 mL离心管中,然后用4∶1 HNO3∶HClO4消化,在沸水浴中消煮至完全溶解。定容稀释一定倍数后再用ICP-MS质谱仪 (NexION 350X,PerkinElmer) 测定Cd2+含量。

      • 丙二醛含量测定参考Kramer等[13]和Song等[14]的方法。取0.5 g甘蓝型油菜的根,加5 mL 5% (w/v) 三氯乙酸 (TCA),在研钵中研磨后所得到的匀浆在3000 r/min、4℃条件下离心10 min,取上清液2 mL用于测定丙二醛含量。在2 mL上清液中加入2 mL TBA试剂 [0.6% (w/v) TBA溶解于10% (w/v) TCA],混合后在100℃水浴中反应30 min,冷却后在4000 r/min下再离心10 min,取上清液在450、532和600 nm处测定吸光值。脯氨酸含量测定参考Bates等[15]和Sharma等[16]的方法,采用酸性茚三酮反应显色,再用甲苯萃取,最后用比色法进行测定。取甘蓝型油菜的根约0.5 g,在研钵中用5 mL 3%磺基水杨酸溶液混合研磨成匀浆并转移至10 mL离心管中,在10000 r/min、4℃条件下离心10 min,上清液用于测定脯氨酸含量。取2 mL上清液、2 mL酸性水合茚三酮溶液和2 mL冰醋酸于10 mL离心管中,置于沸水浴中反应15 min,最后将反应混合物用4 mL甲苯振荡萃取,室温下静置30 min后,吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液,测定其在520 nm处的吸光值。

      • 称取一定量的组织样品 (芽1.0 g,根0.50 g) 置于10 mL离心管中,加入适量的去离子水,在沸水浴中保持30 min后,将其放置室温下冷却2 h,再定容到10 mL。取0.1 mL样品溶液置于10 mL离心管中,加入0.4 mL 5%的水杨酸–硫酸溶液,并混合使之充分反应。将混合物在室温下冷却20 min然后加入9.5 mL 8%氢氧化钠溶液。然后将样品冷却至室温,并测定410 nm处的吸光值[17]

      • 采用靛酚蓝比色法进行测定[18]。分别称取植株地上部和根部新鲜样品,用无氨的蒸馏水研磨,转入离心管中,10000 r/min、4℃离心15 min,吸取0.5 mL上清液到离心管中,依次加入2.5 mL无氨蒸馏水、0.5 mL酚溶液和0.5 mL次氯酸钠碱性溶液并摇匀,在20℃左右室温下放置30 min使之充分反应。加入0.1 mL掩蔽剂以溶解可能生成的沉淀物,然后加蒸馏水6.0 mL,摇匀后在625 nm波长处进行比色测定,以 (NH4) 2SO4系列标准液来制作标准曲线。

      • 植物硝酸还原酶 (NR) 活性测定参考了Fan等[19]的方法。称取植物鲜样约0.3 g用液氮研磨成粉末,添加4 mL提取缓冲液 (25 mmol/L磷酸缓冲液,pH 8.7,含10 mmol/L L-半胱氨酸和1 mmol/L EDTA-Na2),将匀浆转入10 mL离心管中混匀使之充分提取,在10000 r/min、4℃的条件下离心10 min,取上清液用于NR活性测定。下一步的反应体系中含有0.4 mL上清液,0.1 mol/L KNO3,3 mmol/L NADH。在室温条件下反应30 min后往体系中加入1 mL 1%磺胺和1 mL 0.02% α-萘胺来终止反应,显色30 min后在540 nm处测定其吸光值。以单位蛋白含量NO2产生速率来表示NR活性。

        植物谷氨酰胺合成酶 (GS) 活性测定参照了O′Neal等[20]的方法,称取植物鲜样约0.3 g用液氮研磨成粉末,添加4 mL Tris-HCl提取液 (pH 7.8,含0.5 mmol/L MgCl2、1 mmol/L DDT、1 mmol/L EDTA-Na2),将匀浆转入10 mL离心管中,在10000 r/min、4℃的条件下离心10 min,取上清液用于GS活性测定。下一步反应体系中含有1.2 mL上清液、0.25 mol/L咪唑缓冲液 (pH 7.0)、0.3 mol/L谷氨酸钠、0.3 mmol/L ATP、0.5 mol/L MgSO4和2 mol/L NH2OH,在25℃水浴中反应30 min,然后加入FeCl3混合试剂 (含88 mmol/L FeCl3、670 mmol/L HCl和200 mmol/L TCA) 来终止反应,室温静置30 min后离心使蛋白质沉淀,取上清液在540 nm处测定其吸光值 (A540)。以1 min生成1 µmol/L γ-谷氨酰羟亏酸所需的酶量定义为一个酶活力单位。

      • 取油菜的根部用于基因表达分析。

        RNA的提取:将植物鲜样在液氮中研磨成粉末,加入1 mL TRIzol试剂 (Ambion,USA) 混匀,室温放置5 min。加入0.2 mL氯仿,摇匀后室温放置5 min,4℃、13000 r/min离心10 min,取上清液0.6 mL。再往上清液中加入0.6 mL氯仿再次提取,摇匀后室温放置5 min,4℃、13000 r/min离心10 min,轻拿出,出现分层现象,取上清液0.45 mL,加入0.45 mL异丙醇 (核酸沉淀),摇匀后在4℃再放置10 min,之后4℃、12000 r/min离心10 min,弃上清液。往沉淀中加入1 mL用DEPC水配制的5%乙醇,使沉淀悬浮并轻轻摇晃清洗,4℃、5000 r/min离心5 min,弃上清液,室温放置至乙醇完全挥发 (沉淀边缘透明即可),加入20 µL DEPC水溶解沉淀 (RNA) 待用。

        cDNA合成:取1 µL RNA,参照PrimeScript逆转录 (RT) 试剂盒 (TaKaRa,Shiga,Japan) 的使用说明及程序将RNA反转录合成cDNA,将反转录得到的cDNA稀释4倍 (稀释倍数可根据浓度来改变) 后,作为待检测相关基因表达的模板。

        RT-qPCR:采用SYBR Green染料法,使用StepOne™ Real-Time PCR System仪器进行分析,使用的试剂盒为SYBR Premix Ex-Taq (TaKaRa,Shiga,Japan),参照说明书上的反应体系进行。反应程序为95℃ 20 s,60℃ 1 min,72℃ 15 s,40个循环。内参基因为BnACT7,3′-5′序列为:GCTGACCGTATGAGCAAAG;5′-3′序列为:AAGATGGATGGACCCGAC。BnNRT1.1引物3′-5′序列为:CTCTCAACTATCATACCGGGACTG;5′-3′序列为:GGACCGTTCTTTCGGTTCG[21-22]

      • 试验数据采用SPSS19统计分析软件 (IBM SPSS Statistic 19) 进行方差分析和相关分析,不同处理间采用最小显著差数法 (LSD法) 进行差异显著性检验 (P < 0.05)。

      • 图1可见,相比于正常处理 (CK),甘蓝型油菜在经过10 µmol/L Cd处理4天后,油菜的新叶已经黄化,表现出明显的镉中毒现象,而加入5 µmol/L外源ABA的油菜新叶不仅没有黄化,还比CK的新叶更绿 (图1-a)。Cd胁迫下,油菜根部明显变短,但A + Cd处理的油菜根长变化略少一些 (图1-b)。通过SPAD值的比较可以发现,由于ABA的作用使得A + Cd处理下的甘蓝型油菜子叶表现得更加黄化 (图1-c)。甘蓝型油菜的新叶是镉中毒的主要部位,ABA处理后,甘蓝型油菜新叶的SPAD值显著高于镉处理下的SPAD值,提高了1.1倍 (图1-d)。

        图  1  不同处理甘蓝型油菜表型、SPAD值及干生物量和鲜生物量

        Figure 1.  Resistant phenotype, SPAD values and biomass of B. napus under different treatments

        图1-e可以得出,CK的油菜鲜生物量显著高于Cd处理和A + Cd处理的,但是CK和Cd处理下的油菜干生物量没有显著差异,并且显著高于A + Cd处理下的干生物量 (图1-f)。

      • 加入外源ABA后 (A + Cd处理),油菜地上部和根部镉含量均显著低于Cd处理,地上部Cd含量降低了63.0%,根部降低了73.7%,这显示出外源ABA抑制油菜镉吸收的明显效果 (图2)。

        图  2  不同处理甘蓝型油菜植株地上部和根部镉含量

        Figure 2.  Cadmium content in shoots and roots of B. napus under different treatments

      • 脯氨酸和丙二醛含量是反映植物逆境胁迫耐受性的重要指标。脯氨酸能够保持膜结构的稳定性并消除活性氧。脯氨酸的积累与植物胁迫耐受性呈正相关。与CK相比,Cd处理后,油菜根部的脯氨酸含量显著上升29.0%,A + Cd处理比Cd处理又显著上升,表明ABA的添加增强了甘蓝型油菜的抗镉能力 (图3-a)。

        图  3  不同处理下甘蓝型油菜根部脯氨酸和丙二醛含量

        Figure 3.  Proline and MDA contents in roots of B. napus under different treatments

        丙二醛 (MDA) 是膜脂过氧化最重要的产物之一,具有细胞毒性,可以促进活性大分子 (如蛋白质和核酸) 的交联聚合,降低膜结构的稳定性[23]。Cd处理的油菜根部MDA含量比CK显著增加,但是A + Cd处理的MDA含量显著低于Cd处理,降低了48.3%,甚至显著低于CK,添加外源ABA不仅可降低Cd胁迫产生的MDA量,还可提高非Cd胁迫下甘蓝型油菜膜的稳定性 (图3-b)。

      • 图4可看出,相较于CK,Cd处理下的甘蓝型油菜全氮含量没有显著变化,但加入ABA后,甘蓝型油菜全氮含量显著降低,比Cd处理下降了42.2% (图4-a)。从BnNRT1.1的基因表达水平来看,CK和Cd处理没有显著差异,但A + Cd处理BnNRT1.1的基因表达水平显著上升,比Cd处理提高了55% (图4-b)。

        图  4  不同处理下甘蓝型油菜植株氮素含量与BnNRT1.1基因表达

        Figure 4.  The nitrogen content and expression of BnNRT1.1 of B. napus under different treatments

        图4-c可知,CK和Cd处理的甘蓝型油菜地上部硝酸盐含量没有显著差异,而A + Cd处理比Cd处理硝酸盐含量显著降低了50%。根部硝酸盐含量Cd处理显著高于CK和A + Cd处理,分别比二者提高了48.4%和26.2% (图4-d)。CK和Cd处理甘蓝型油菜地上部的铵盐含量没有显著差异,而A + Cd处理比Cd处理铵盐含量显著升高了23% (图4-e)。根部铵盐含量表现为Cd处理显著高于CK和A + Cd处理,分别提高了 43.2%和23.7% (图4-f)。

      • 图5-a可知,在甘蓝型油菜的地上部,CK和Cd处理下的硝酸还原酶 (NR) 活性没有显著差异,而A + Cd处理NR活性相比于Cd处理则显著降低了92.3%。在甘蓝型油菜的根部,Cd处理下的NR活性显著高于CK,提高了76.5%。相比于Cd处理,A + Cd处理其NR活性显著提高了82.8% (图5-b)。对于甘蓝型油菜的地上部分,CK和Cd处理下的谷氨酰胺合成酶 (GS) 活性没有显著差异,而A + Cd处理GS活性相比于Cd处理则显著升高了32.1% (图5-c)。在甘蓝型油菜的根部,Cd处理下的GS活性显著高于CK和A + Cd处理,分别提高了32.6%和32.3% (图5-d)。

        图  5  不同处理下甘蓝型油菜NR和GS活性

        Figure 5.  NR and GS activities of B. napus under different treatments

        从甘蓝型油菜地上部和根部的铵盐含量 (图4-ef) 可以看出甘蓝型油菜体内铵盐的分配 (根部的铵盐含量/地上部的铵盐含量) 状况。在A + Cd处理下,根部铵盐和地上部铵盐的比值显著低于镉处理下的比值,说明在A + Cd处理下,有更多的铵盐分配在了地上部 (图6-a)。并且A + Cd处理下的甘蓝型油菜氮素生理利用效率显著高于Cd处理下的氮素生理利用效率,提高了17.2% (图6-b)。

        图  6  不同处理甘蓝型油菜根部与地上部的铵盐比值和植株氮素生理利用效率

        Figure 6.  The NH4+ root/shoot ratio and physiological nitrogen use efficiency of B. napus under different treatments

      • 很多文献曾报道,外源ABA的添加会增强植物对Cd胁迫的耐受性[24-25]。在本试验中观察到,甘蓝型油菜在镉胁迫下,添加外源ABA后其新叶没有出现黄化,仅在Cd处理下的甘蓝型油菜新叶表现出明显的黄化,通过SPAD值也可以看出。从主根的长度来看,Cd胁迫会抑制主根的伸长,但是在有ABA的Cd处理下,其主根长度大于单独的Cd胁迫处理。一方面,用Cd和ABA处理的甘蓝型油菜体内脯氨酸的含量升高,缓解Cd对植物造成的损伤;另一方面,还抑制了富有毒性的MDA的产生,进一步减小植物受Cd胁迫的程度 (图3)。因此综合这几个逆境指标来看,外源ABA的添加确实增强了油菜对Cd胁迫的耐受性。

      • 提高粮食作物或经济作物的氮素利用效率,不仅可以增加实际生产,还可以减少资源浪费以及环境污染[26-27]。因此对氮素利用效率的提升机理研究意义十分重大,虽然氮素利用效率的研究起步较晚,但是在提高作物氮素利用效率重大意义的驱使下,取得了一些可喜的进展。NO3与氮素利用效率息息相关,NO3作为植株体内的无机氮,如果得不到及时的同化和利用,就会明显影响氮素同化效率和生物量,进而显著影响氮素利用效率[28]。NO3对于氮素利用效率的影响主要有以下两个方面,一方面是NO3的跨液泡膜的转运过程即NO3的短途转运以及NO3从地下部运往地上部的过程即长途分配,短途转运和长途分配两者相互配合可提高氮素利用效率[12, 29];另一方面,通过相关的酶促进NO3的同化利用速率,也可以影响氮素利用效率[28]

        在本研究中,我们关注到Cd胁迫下,外源ABA的添加会显著提高甘蓝型油菜的氮素生理利用效率,因此我们主要关注其对NO3的同化和代谢,探究其主要机理。在A + Cd处理下,油菜地上部的NR活性显著低于Cd处理的NR活性,但是其甘蓝型油菜地下部的NR活性要显著高于Cd处理 (图5-ab),说明A + Cd处理的甘蓝型油菜根部有更多的NO3经GS/GOGAT循环同化为NH4+。从NH4+的含量来看,A + Cd处理下甘蓝型油菜地上部的NH4+含量显著高于Cd处理,在根部的却显著低于Cd处理。在检测了GS的活性后,发现在A + Cd处理下甘蓝型油菜的地上部不仅NH4+含量高,它的GS活性也显著高于Cd处理;在地下部,NH4+的含量低,同样它的GS活性也显著低于Cd处理 (图5-cd)。从图6-a可以得出,A + Cd处理下甘蓝型油菜有更多的NH4+被分配在地上部。因此我们推测ABA提高氮素生理利用效率的可能机理为:由于外源ABA的添加,使得根部的NR活性升高,产生了更多的NH4+,由于地上部的NR活性非常低,所以这其中可能存在着NH4+向地上部的转运,导致更多的NH4+分配到地上部,然后地上部的GS活性也显著提高,有研究表明GS的升高会促进植物生长[30-31],之后经过代谢相关酶的作用使得A + Cd处理下甘蓝型油菜的氮素生理利用效率显著升高 (图6-b)。值得注意的是,通过检测BnNRT1.1的基因表达水平,发现A + Cd处理甘蓝型油菜的BnNRT1.1表达量显著高于Cd处理下的甘蓝型油菜 (图4-b)。有文献报道,在水稻中NRT1.1被过表达后会显著提高水稻产量,并且缩短水稻的生长周期[32]。这意味着NRT1.1对植物的生长和发育起到至关重要的调控作用。因此,我们猜测BnNRT1.1很可能参与了NH4+往地上部的转运,从而提高了氮素生理利用效率。当然是否存在该条信号通路以及具体的转运过程还需要进一步的研究和证明。

      • 图1-e可知,在Cd处理和A + Cd处理下的甘蓝型油菜的鲜生物量无显著差异,但是在A + Cd处理下的甘蓝型油菜的干生物量却显著低于Cd处理 (图1-f),因此在A + Cd处理下的甘蓝型油菜虽然具有较强的抗性,但这也影响了甘蓝型油菜的干生物量。植物的生长和抗逆反应都需要能量,因此植物在面临不同的外界环境时也会做出不同的选择。一般来说,在植物面临不利环境的时候,植物自身的选择应该是最先注重自身抵御逆境的能力,这样才能存活下去,所以生存是第一要义,而此时植物的生长发育会变得缓慢;当逆境消散或者退去,此时就会注重自身的生长发育。邹小云等[33]认为,当植物面临胁迫的时候,植物的生长和抗逆活动会存在能量竞争分流关系,逆境下就会分配更多的能量去抵御胁迫;正常情况下就会有更多的能量用于生长发育。所以在A + Cd处理下的甘蓝型油菜,会消耗主要的能量去抵御Cd胁迫而放缓了生长发育的脚步,导致干物质累积量下降。虽然植物中存在这种能量分流的现象,但是具体的过程和作用模式还有待深入研究。

      • 外源ABA的添加显著提高了甘蓝型油菜的脯氨酸含量,降低了丙二醛含量,进而增强了其膜结构的稳定性,提高甘蓝型油菜对Cd胁迫的耐受性;并且能够有效地抑制甘蓝型油菜对Cd的吸收,进而降低Cd对甘蓝型油菜的毒害程度,与此同时,外源ABA的添加也降低了甘蓝型油菜对NO3的吸收。外源ABA不仅增强了甘蓝型油菜的抗性,而且还提高了甘蓝型油菜的氮素生理利用效率,推测其主要作用过程是:ABA提高油菜地下部的NR活性,促使了地下部产生的NH4+向地上部转运,同时增强地上部GS的活性,进而提高甘蓝型油菜的氮素生理利用效率。相比于Cd处理,添加ABA处理的氮素生理利用效率提高了17.2%。

    参考文献 (33)

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