• ISSN 1008-505X
  • CN 11-3996/S

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植物微根系原位观测方法研究进展

肖爽 刘连涛 张永江 孙红春 白志英 张科 田士军 董合忠 李存东

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植物微根系原位观测方法研究进展

    作者简介: 肖爽 E-mail:amandaxiaos@foxmail.com;
    通讯作者: 刘连涛, E-mail:liultday@126.com ; 李存东, E-mail:nxylcd@hebau.edu.cn
  • 基金项目: “十三五”国家重点研发计划项目(2018YFD0100306);国家自然科学基金项目(31871569、31571610);河北省产业技术体系(HBCT2018040201)。

Review on new methods of in situ observation of plant micro-roots and interpretation of root images

    Corresponding author: LIU Lian-tao, E-mail:liultday@126.com ;LI Cun-dong, E-mail:nxylcd@hebau.edu.cn
  • 摘要: 植物根系是固定植株、获取水分和营养物质的主要器官。作为连接植物体与土壤环境的枢纽,根系的发育状况直接关系着地上部分的形态建成。由细根及其根毛组成的微根系是根系功能的关键组织。由于土壤中根系的非直观性和根系自身的复杂立体构型,常规研究方法很难准确测定根系的变化动态。微根系原位观测技术、方法的出现为原位根系研究提供了可能的手段。近年来,可用于观测微根系二维形态与立体构型的多种类型的原位生长系统、装置被研制出来,一些根系图像分析软件也不断开发和改进,大大提升了原位根系研究的准确性。本文介绍了几种用于原位微根系观测的装置和图像分析软件与计算方法,并比较了不同方法与软件之间的优劣,指出原位观测研究技术的应用和发展趋势,以期对后续植物微根系研究提供参考。
  • 图 1  RhizoTube示意图

    Figure 1.  Illustration of RhizoTube

    图 2  扫描仪平台示意图[42-43]

    Figure 2.  Schematic representation of scanner

    图 3  微根管及其成像系统示意图

    Figure 3.  Schematic representation of the minirhizotron camera system and minirhizotron tube

    图 4  塑料容器内安插扫描仪的示意图[97]

    Figure 4.  Diagram of scanners in plastic containers[97]

    图 5  三维根系生长与成像系统

    Figure 5.  3D root growth and imaging system

    表 1  根系分析软件概览*

    Table 1.  Overview of available data processing software

    软件
    Software
    可获取的根系形态特征
    Mainly acquired root traits
    自动化水平
    Automation level
    参考文献及软件网址
    Reference and software website
    2D根系图像处理 2D root image processing
    Aria长度形状、凸包、主根、侧根、拓扑结构Length/shape,convex-hull,main root,lateral root,topology自动Automated         [113]
    ARTT定位、方向、速度分布Localisation,orientation,velocity-profile自动Automated         [122]
    BRAT直径、长度、方向Diameter,length,orientation自动Automated         [123]
    http://www.gmi.oeaw.ac.at/researchgroups/wolfgang-busch/resources/brat
    DART插入、长度、拓扑结构Insertion,length,topology手动Manual         [124] http://www.avignon.inra.fr/psh/outils/dart
    DIRT分支角度、密度、直径、分布、长度、数据共享Branch angle,density,diameter,distribution,length,data sharing自动Automated         [125]
    http://dirt.iplantcollaborative.org/
    ElonSim长度length自动Automated         [126]
    EZ-Rhizo插入角、长度、分枝数、拓扑结构Insertion-angle,length,number of branches,topology半自动Semi-automated         [127]
    http://www.ez-rhizo.psrg.org.uk/
    EZ-Root-VIS根长,密度,角度,根据实测数据计算、可视化重建根系Length,density and angle are calculated and visualized according to the measured data自动Automated         [128] http://www.psrg.org.uk/download/Rhizo-64.msi
    GiA Roots凸包、深度、长度、分枝数、周长、表面、体积Convex-hull,depth,length,number of branches,perimeter,surface,volume自动Automated         [129]
    http://www.giaroots.org
    GROW Map-Root速度分布Velocity-profile自动Automated         [130]
    GrowScreen-Root插入角、长度、分枝数Insertion-angle,length,number of branches半自动Semi-automated         [131]
    Growth Explorer速度变化Velocity-profile自动Automated         [132]
    IJ-Rhizo直径、长度Diameter,length自动Automated         [133]
    KineRoot向重力性、增长Gravitropism,growth自动Automated         [134]
    MyROOT根长,识别不同年龄和形态的下胚轴Length,identifying hypocotyls of different ages and shapes半自动Semi-automated         [135]
    https://www.cragenomica.es/research-groups/brassinosteroid-signaling-in-plant-development
    PlantVis速度分布Velocity-profile自动Automated         [136]
    RNQS计数、长度、节点Count,length,nodules自动Automated         [137]
    http://hdl.handle.net/10393/30321
    RootGraph计数、长度、直径、主根、侧根、拓扑结构Count,length,diameter,main,lateral root,topology自动Automated         [112]
    http://www.plant-image-analysis.org/ software/RootGraph
    Root System Analyzer计数、直径、插入角、插入、长度Count,diameter,insertion-angle,insertion,length自动Automated         [111]
    http://www.csc.univie.ac.at/rsa
    rhizoTrak长度、表面积、体积、拓扑结构、根注释、分支结构Length,surface area,volume,topology,root annotation,branch structure手动,半自动Manual,semi-automatic         [138]
    https://prbio-hub.github.io/rhizoTrak
    RootFlowRT伸长,速度分布Growth,velocity-profile自动Automated         [139]
    下载: 导出CSV
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-05-10
  • 网络出版日期:  2020-03-27
  • 刊出日期:  2020-02-01

植物微根系原位观测方法研究进展

    作者简介:肖爽 E-mail:amandaxiaos@foxmail.com
    通讯作者: 刘连涛, liultday@126.com
    通讯作者: 李存东, nxylcd@hebau.edu.cn
  • 1. 河北农业大学/河北省作物生长调控重点实验室,河北保定 071000
  • 2. 山东农业科学院山东棉花研究中心,山东济南 250100
  • 基金项目: “十三五”国家重点研发计划项目(2018YFD0100306);国家自然科学基金项目(31871569、31571610);河北省产业技术体系(HBCT2018040201)。
  • 摘要: 植物根系是固定植株、获取水分和营养物质的主要器官。作为连接植物体与土壤环境的枢纽,根系的发育状况直接关系着地上部分的形态建成。由细根及其根毛组成的微根系是根系功能的关键组织。由于土壤中根系的非直观性和根系自身的复杂立体构型,常规研究方法很难准确测定根系的变化动态。微根系原位观测技术、方法的出现为原位根系研究提供了可能的手段。近年来,可用于观测微根系二维形态与立体构型的多种类型的原位生长系统、装置被研制出来,一些根系图像分析软件也不断开发和改进,大大提升了原位根系研究的准确性。本文介绍了几种用于原位微根系观测的装置和图像分析软件与计算方法,并比较了不同方法与软件之间的优劣,指出原位观测研究技术的应用和发展趋势,以期对后续植物微根系研究提供参考。

    English Abstract

    • 根系是植物获取土壤养分、水分和固定植株的重要器官[1],与地上部进行物质和信息交换。它在土壤中的分布与环境因子密切相关,对其影响最大的土壤环境因子为水分和养分[2]。作物的高产优质需要发育良好的根系作为基础,因此阐明根系的发育特征对生产实践具有重要价值[3-4]

      细根和根毛是根系功能的主要执行部位,共同组成“微根系”,其水分和养分的吸收量占根系总吸收量的75%以上[5],直接影响根系功能。细根通常指直径小于2 mm的根系[6],生物量占根系总生物量比例不足30%,但其表面积大、生理活性强,是地下部分最活跃、对土壤环境反应最敏感的部分,它的生长状态直接或间接影响植物的生长及活力[7-8]。根毛是特化的根表皮细胞向环境中伸出的管状结构,它扩展了根系与土壤的接触面积[9-10],部分作物的根毛表面积可达根系总表面积的2/3[5],在营养和水分吸收方面发挥着重要作用[11-12],其生长状态对植株地上部发育具有重大影响。因此,微根系的形态特征变化动态在植物发育过程中起到重要作用,已成为根系研究的重点和热点[13]

      由于土壤的不透明性和根系的复杂形态,植物根系研究迫切需要无损伤、快速、准确的微根系原位观察方法[14]。传统的根系获取法诸如挖掘法、根钻法、土块法,都需要进行破坏性取样使其脱离培养土壤[15-16],进而获取根拓扑结构、形态分布等信息[17]。这类方法获取的根系损失率较高,且无法连续的开展微根系动态观测研究。目前微根系的原位形态获取和分析方法仍处于发展阶段,本文从栽培系统、成像系统、软件支持三方面梳理微根系原位观测和分析方法,对近年来微根系原位观测前沿技术特点及适用范围进行归纳与剖析,以期为今后植物微根系研究方法采用提供参考。

      • 气培法,又称雾培法,由Carter[18]于1942年提出,之后经国际水稻研究所改良而发展成的新型根系研究法[19]。该方法培养系统一般由空气压缩机、水泵和培养容器组成。用定植板将植株固定在培养容器上,空气压缩机将容器内的营养液雾化,雾化的营养液经由培养容器底部向上喷射到根系上[20]。通过该方式使植物根系生长环境处于最佳根域状态下[21]

        该方法为根系生长提供了伸展空间,为观测记录根系的发育动态提供了条件。与珍珠岩培养基质比较发现,气培番茄的根长和根体积均显著大于珍珠岩培养[22],气培法通过改善根际通气状况增强根系的代谢和营养吸收能力,促进了根系的生长。气培法同样可用于植株根毛的观测,莫亿伟等[12]利用该方法研究水稻幼苗根尖受不同浓度IAA诱导后形成大量根毛,在扫描电镜下观察并通过计算得到根毛数、根毛密度和根毛长度等数据。另外,气培法具有观察植株完整根系的优势,这一特点常被应用于植物病害的研究,如Wagner等[23]用于研究大豆疫霉菌 (Phytophthora sojae) 侵染大豆 (Glycine max L.) 主根的发病机理,Toit等[24]用于筛选玉米 (Zea mays L.) 抗禾谷镰刀菌引起的根腐病基因型等。

        气培法解决了植物根系从溶液中吸收营养与氧气供应之间的矛盾,具有节水、节肥的特点。但该方法受供水量和培养容器限制,较适合蔬菜、花卉或大田作物苗期的根系研究,暂不适用于大田作物全生育期的根系观测。

      • 传统的沙、土、蛭石栽培在观察根系时会导致根系损伤,并且较难进行实时观测和根部形态信息的统计。水培法是把植物种植在设有固体支撑装置、内含植物生长必需营养成分的营养液中,进行各种元素不同浓度或缺素试验[25],进行高通量的表型筛选和鉴定[26]。根系在培养液中生长,在开展细根和根毛研究时可使用扫描仪或扫描电镜成像的方式进行研究。

        但是,使用上述常规水培法时由于根系的生长不受限制,会造成后续根系图像分割的困难,实验过程中反复更换营养液还会造成根系构型的改变,不能实现对根系的无损观测。为解决这类问题,余常兵等[26]、Piñeros等[27]在水培容器中加入可维持其立体构型的定根架,使用时将发芽的种子放置在定根架顶层后将定根架放入透明水培容器中,后续使用成像设备进行根系图像采集,实现了原位根系三维构型的持续观测,并在油菜、水稻、高粱、玉米和大豆中得到了成功应用,解决了传统水培条件下根系黏连无法进行三维观测的难题。这种方法避免了试验过程中因更换营养液、取出样品和获取图像时导致的根系构型变化。改进后的方法实现了水培用于原位根系三维构型的观测,但仍存在如下问题[26]:1) 对细小、柔弱的植物根系进行固定和三维重建的难度较大;2) 有大量侧根发生的植物根系会因相互遮挡而降低三维合成效率和数据准确性;3) 若进行长时间培养会因根系较多而难以完成三维合成。

        为解决上述定根水培的部分问题,提升成像自动化水平,实现高通量根系研究,Jeudy等[28]采用扁平化水培容器的思路,开发出一种高通量植物根系表型测量系统RhizoTube (图1)。它包含一根全透明外管和一根不锈钢内管,通过底部螺栓和顶部固定装置集成在一起,中间有一层18 μm厚的蓝色塑料薄膜,该膜具有水分、营养液和微生物可通过、根系无法通过的特点。营养液通过顶部加入,渗入基质,直至充满整个内管与膜中间的区域,以备植物生长所需。根系生长于蓝色塑料薄膜与外管之间的扁平空间内,明显的分散开,便于根系图像获取,通过外部图像传感器获取根系图像。为实现高通量自动化作业,后续将培养容器连接到底座上,并与传送带系统有机整合,实现自动和高通量根系表型测量。Jeudy等[28]在3600 ppi分辨率下清晰观察到豌豆细根根瘤的生长情况。

        图  1  RhizoTube示意图

        Figure 1.  Illustration of RhizoTube

        水培法解决了土壤基质栽培时根系的非可视化,使根系完整暴露,便于根系表型研究。该方法若搭载高分辨率图像采集系统,则成为一个可以获取根系表型信息的生长平台,是微根系研究的有力工具。但是,该方法也存在不足:首先,水培法可能不适用于根毛的研究,因为水培环境下能否形成根毛有很大的不确定性。马雪泷等[29]针对栀子的研究发现,水培下的根系形态结构和生理功能与土培存在很大的差别,根系分支少和根毛缺乏等。孔妤等[30]也得到了相同的结论,并推测是由于根系直接与营养液充分接触,无需再扩大吸收面积增强有效吸收,所以根毛缺乏。其次,受容器或植物自身因素的影响,水培法仅适用于短期根系观察。余常兵等[26]使用定根水培法对油菜进行15天培养后已有大量根系分布在定根架中,造成后期三维合成的困难。

      • 采用透明基质作为植物生长的非土壤基质的可控生长环境,使根系生长于视觉穿透环境下[17],是微根系构型和形态研究的重要手段。

        Bengough等[31]为了观察谷类作物幼苗根系,开发了平板凝胶观察装置。这种装置使幼苗根系位于两层紧密间隔的透明凝胶层之间,放置于塑料板上,并在透明一侧使用平板扫描仪获取根系二维图像,从而测量到根长、根伸长率、最长根、最深根、根数量和根角度等根系性状。凝胶培养法操作简单,最大程度降低了根系意外损伤,可以在完全无损伤的条件下对根系进行整体观测,若图像获取设备的分辨率允许,便可获取包括根毛[32]、根直径[33]、根角度[31]等在内的根系性状,是微根系研究的有力方法。在采用该研究方法时,为达到最优效果,需考虑如下问题:第一,该类方法通常采用遮光措施,避免根系暴露在光下影响根系发育[34-35];第二,在凝胶中会出现根系局部脱水或矿物枯竭[36],为此需要依据培养需求选择培养基质和凝胶类型;第三,培养基质若受到了污染,会使凝胶密度不一致,导致无法支撑植株个体[37];第四,受凝胶系统营养供给和支撑能力的影响,该方法仅适用于幼苗根系研究;第五,以凝胶作为培养基质与土壤的微环境存在差异,导致植物生长习性的改变。

      • 纸基培养法是一种基于发芽纸的根系原位观察系统,具有成本低,操作简便的优点,可以高效率对根系形态进行评估并进行大量重复[38-41]。该方法的基本思路是将种子与发芽纸直接接触,并使其根系附着于发芽纸上生长,通过营养液浸润的发芽纸获取营养,或通过能够喷淋或运输营养液的装置,后续再使用数码设备获取根系图像 (图2)[42-43]

        图  2  扫描仪平台示意图[42-43]

        Figure 2.  Schematic representation of scanner

        营养袋培养法[44]是纸基培养法的最简易应用,由梁泉等创制,该系统由蓝色无磷吸水纸和具有0.5 mm孔径均匀的聚乙烯塑料袋、支撑架、营养液组成,能使根系正常生长,并且同时满足了种子萌发和根系观察的双重研究需要。Marié等[45]使用类似思路开发了纸基生长系统——Rhizoslides,此方法使用润湿的发芽纸和透明PE箔片覆盖在有机玻璃板两侧,形成一个三明治结构,种子放置在有机玻璃顶端,位于两侧发芽纸中间,胚根在纸和有机玻璃板间生长,可以直接观察到根系在发芽纸和透明箔片中生长。并于2016年开发了第二代平台,命名为RADIX[46],对灌溉和成像系统进行改进,可同时监测200株幼苗根系发育,达到了高通量。Wu等[36]采用类似的方法,开发了The Rhizo Chamber-Monitor (RCM) 平台,将发芽纸换为布料包裹在三元乙丙橡胶 (EPDM) 材料的平板两侧,并在布料外覆盖上透明聚碳酸酯 (PC) 板,使根系在布基和PC板间生长。

        基于发芽纸的根系原位观测法已成功应用在大豆[47]、玉米[48]、小麦[49]、油菜[50]、棉花[36]等多种作物中。该方法中培养方法简单,易于处理,造价低廉,能在有限的空间内进行大量复制;由于纸基较土壤具有更好的可控性,可依据研究人员的喜好改变发芽纸的颜色,以便为后期的根系成像提供良好的光学对比度[51]。采用这种方式能够简便的获取细根图像,增加图像采集设备分辨率后,则可采集根毛的图像。在试验处理周期内增加图像采集次数,可进一步获取微根系形态变化信息。纸基培养法虽具有上述优点,但是根系在发芽纸的发育形态与在土壤中存在很大差异,不具代替作用和普适性;试验时为使根系获取水分和养分,通常需要借助外力让根系与纸基紧密接触,阻碍了根系的伸展状态;纸基培养法同样仅适用于幼苗根系的观测[51-52]。前人使用该方法时对幼苗的培养周期一般不超过两周,培养时间过长,则出现养分供应不足、根系霉烂和地上部植株倒伏等问题。

      • 为了缩小室内与田间试验之间的差距,研究人员更倾向于使用土壤作为培养基质开展根系研究。为此,将植物种植在含有一个或多个透明平面的根系观察隔室 (根室) 中,通常采用玻璃板或者透明PVC材料,待根系生长至透明容器壁后,使用图像采集装置获取原位根系图像。近年来,基于该透明根室法的装置大量应用。Leigh等[53]将该方法用于桑树细根周转的研究,采用半圆柱型的PVC根室法,验证了该方法用于大型植物根系研究的可行性;Singh等[54]采用透明有机玻璃板组装成中央可填入土壤的根室,研究了高粱和玉米根系发育;Bao等[55]将作物种植在透明亚克力材料制作的根室中,使用数码相机捕捉图像,应用数字图像关联技术 (Digital Image Correlation) 比较了一系列图像序列间土壤颗粒位移的思路,反推了根系的生长;Mahmud等[56]使用根室法开展了葡萄砧木细根生长的日变化动态的研究。Nagel等[57]为提高根室法研究自动化水平,基于根室法原理研制出一种新型根系生长平台GROWSCREEN-Rhizo,可自动获取根室的根系图像,达60个根室/h,效率显著提高;赖勇林等[58]为了能够在普通根室的基础上获得更大的根系观察面,研制了可调控水肥状况的玻璃制“Y”形根系生长室,对烟草根系动态生长进行观测,保证了原位根系观察需要的同时进一步减少了二维平面对根系的限制效应;Richard等[59]对24个小麦品种进行试验,将四周透明的塑料桶作为根室,种子沿桶壁2.5 cm处播种一周,以便根系可以在桶壁透明侧生长。

        综上可知,透明根室法在研究植物微根系方面具有良好的可行性:研究者设计出能够展示部分或完整根系的植物生长装置,后续根据需要自行选择成像方式和成像时间间隔,可实现根系的原位动态监测。增加成像设备分辨率,可对细根乃至根毛生长动态开展研究。然而透明根室法仅能够观测到触及透明面的根系,无法获取全部根系信息。

      • 采用上述原位根系研究方法时需要获取根系图像以及对图像进行分析,由于手工分析耗时长,主观差距大,此时获得根系形态信息就需要成像设备或成像系统的支持。

      • 近年来随着现代高新探测技术的发展,医学上被成熟使用的X射线断层扫描技术 (XCT) 和核磁共振成像技术 (MRI) 被运用到根系无损研究上,为原位植物根系的研究提供了新的方法和手段[60]

        XCT是利用一束X射线穿过样品,样品会吸收部分射线从而降低射线的强度,这个过程称为衰减,X射线的衰减主要取决于材料的性质,尤其是电子密度[61]。1992年,Wantanabe等[62]将XCT技术应用于植物根系研究,他们以2~5 mm分辨率研究山药根系,但是无法清楚的观察到完整的根系形态;1997年,Heeraman等[63]使用高能工业CT对矮菜豆8 mm深度范围的土芯 (100 mm × 50 mm) 连续扫描40次,成功地检测到直径0.35 mm左右的根系;随着技术的进步,Tracy等[64]和Lucas等[65]使用新型XCT系统观察到直径仅微米级的拟南芥细根;Keyes等[66]使用同步X射线计算机断层扫描 (SRXCT) 成像,配合合适的植物生长基质,可以实现高分辨率 (精确至1 μm) 下根际形态的无损三维观测,新的根毛生长算法的应用允许计算生成3D根毛的个体类型,并做出根毛生长动力学的预测。这是对微根系原位动态研究的开拓性研究成果。XCT系统成像时根系土壤中某些物质衰减相近,并且会随着土壤类型、土壤含水量、根系与基质的孔隙和根系的含水量等因素而变化,引起对比度差[67-68],增加根系图像分割与识别难度[69-70]。因此,XCT可能会高估根系的直径,由于对根系与土壤中的其它颗粒的区分度较差,会低估根的长度与侧根数[70]

        MRI是以射频电磁波为信息载体,通过检测磁场中物体不同位置的核磁共振信号获得编码核磁共振信息生成图像,进而利用计算机重建物体内部影像的一种现代层析成像技术[71]。该技术在根系研究中的应用已涉及植物病理[72]、根的内部结构[73]和根系与土壤间的水分流动等[74]。前人研究认为,MRI技术一般适用于细根及较粗根系研究,根系直径在2 mm或者接近2 mm时,其三维重建图像就变成了断点组成的虚线,远小于2 mm的侧根则无法呈现[75]。但是,并不是所有的培养基质都适用于MRI成像,Pflugfelder等[76]以大麦 (Hordeum vulgare L. var Barke) 为试验材料,研究6种常见的商用土壤对于成像的适应性,并与已用于MRI成像的两种人工合成基质做比较,发现培养基质类型和其含水量对于MRI成像的精度有很大影响,在人工合成的基质中,土壤含水量超过最大持水量的70%则会阻碍根系成像,然而50%~80%最大持水量的天然基质则对图像质量没有影响,并最终确定了3种可用于直径小于 300 µm根系成像的培养基质。

        XCT和MRI两种成像技术是进行微根系原位观测及动态发育研究的得力工具,但在应用过程中存在一定差异。首先,XCT具有较高的空间分辨率,可以对细根进行精细的研究,甚至可有效探测到根毛的影像;MRI则更适合对发育后期的根系进行探测。在实际运用中将MRI与XCT技术结合开展根系研究,扬长避短,是一个有效的办法[61]。其次,MRI与XCT对数据分析过程不同,两者扫描时间相当,XCT方法从图像中分割根系的时间比扫描时间长得多,它进行图像分割时可继续扫描其它样本。采用MRI方法所获取的图像数据信息则可以立即进行量化处理。

      • 微根管法由Bates于1937年提出,使用插入土壤中的玻璃管原位观察与玻璃管管壁接触的根系[77],1974年,Böhm用“Minirhizotron”(微根管,又名微根窗) 这个词描述这种根系观测方法,比较了微根管技术和在田间使用的其他观测技术[78]。最初微根管是通过肉眼进行观察的,定量效果不足。近年来,随着数码技术进步,研究者开始利用一系列工具来帮助观察和记录,如袖珍照相机[79]、小型彩色摄像机[80]等。对观测到的根系图像进行记录和分析,从早期的人工记录发展到计算机存储、分析图像。典型的微根管根系分析系统由根管、图像采集器、调节控制装置、标定手柄、计算机和图像分析软件组成 (图3A)[81]。使用360°多层次旋转式扫描仪,将主机探头放置在根管的不同位置即可获取到不同深度无形变的根系分布或土壤剖面图像。作物生长发育过程中测定可获取微根系形态动态变化信息。该方法已成功应用到多种作物的根系研究中,如小麦[82]、玉米[83]、棉花[84]、大豆[85]等。

        图  3  微根管及其成像系统示意图

        Figure 3.  Schematic representation of the minirhizotron camera system and minirhizotron tube

        微根管作为一种田间非破坏性根系原位观测法,是目前直接观察细根较好的工具之一[86],在研究细根寿命、周转率和分解速率等方面具有优势[87]。Wells等[88]采用微根管法发现,不同糖槭的根系直径范围的细根寿命不同,且随着细根直径的增加,其死亡概率会呈现下降的趋势;Baddeley等[89]采用微根管法在甜樱桃细根研究中获得相似结论,细根直径每增加0.1 mm其死亡率便会下降16% 。还有研究认为,微根管法与土壤取样法具有线性关系[84, 90]

        该方法是一种可供长期观察根系的研究方法[91],但是在测定过程中需要考虑如下问题才能获得有价值信息,1) 微根管的安装会对土壤和根系造成干扰[92-93];2) 根的生长路径会随着根管的安装而改变,根长密度与实测值之间的相关性随着管径的增大而减小[94];3) 微根管的安装会导致根系过度增殖,特别是在土壤表面附近[95];4) 根管在土壤中时间过长往往会发生位置改变,土壤中的杂质吸附在管壁上也会使观测的清晰度下降。如上问题很大程度上受限于微根管的安装技术、取样数量、采集图像质量和不同软件对于图像分析的差异等人为及设备因素。笔者所在的研究团队改进了微根管方法[96],在埋设根管时采用一种动力定位打孔装置,在定向打孔时,保障孔壁平滑及与微根管间隙小,填充空隙采用过细筛的生土,最后经过6个月以上的沉实,以保障获得优质的根系图像[84]。优质图像为精确区分活根、死根提供了条件,一定程度上改进了微根窗法(图3B)。

      • 近年来采用简单栽培装置结合数码设备 (智能手机、扫描仪、数码相机) 共同完成根系图像的获取已被大量报道。

        Hammac等[97]将两台高分辨率 (4800 dpi) 台式扫描仪埋在装满土壤的容器中探究油菜、亚麻和扁豆在2个水分水平下的根毛发育特征 (图4);Nahar等[98]使用类似方法以2400 dpi观察盆栽蓖麻生长28天内的微根系形态变化特征,确定了根和根毛的形态在不同时间间隔内对土壤的响应;Nakahata等[99]将扫描仪插入柏树和橡树林土壤中,连续数年每周对土壤剖面进行扫描,然后通过图像分析定量估计根系的精细动态,并认为根扫描法是一种定量描述森林细根动态的可行技术;Mohamed等[100]同时使用平板扫描仪、手持扫描仪、智能手机扫描应用程序和延时相机4种设备对核桃树根进行扫描。

        图  4  塑料容器内安插扫描仪的示意图[97]

        Figure 4.  Diagram of scanners in plastic containers[97]

        使用数码设备对植物根系进行观测时可将设备安插于田间、室内的土壤栽培系统中,也可以依据研究需求搭载于各种自行开发的非土壤基质栽培系统中。Clark等[101]基于凝胶培养法开发了一种新颖的三维成像系统,由灯箱、相机、内部转盘、外部转盘、生长室、光学校正箱、磁性界面和可控制转盘与相机的计算机组成 (图5)。将水稻种植在填充了结冷胶的可转动柱形观察装置中,通过数码相机获取多个角度下的微根系图像。该方法能在5 min内快速获取到一个培养体的根系三维图像,提高了根系信息获取速度。

        图  5  三维根系生长与成像系统

        Figure 5.  3D root growth and imaging system

        此类方法适应性广且设备成本相对较低,可以根据根系研究的精度需要自行调节数码设备的分辨率和图像质量,对于植物微根系的原位成像灵活性强。

      • 作物根系图像分析需要使用专为获取根系形态性状而设计的高通量分析软件。随着研究的深入,近年来出现一系列根系图像分析软件,下文主要针对几个有代表性的软件做简要介绍。

      • WinRHIZO是目前应用较多、最为普及的根系分析系统之一[102],由加拿大Regent公司 (http://www.regentinstruments.com) 设计,可应用于各类方法获得RGB根系图像,用于分析包括根长、直径、表面积、体积、根尖数在内的根系形态特征及根系颜色等指标。功能强大、操作简单,广泛运用于根系形态与根系构型的研究。该软件通过像素数乘以像素大小来计算根长,通过对象的投影面积除以长度来计算平均直径,依据根的直径和长度计算出表面积 (假设根的横截面是圆形),只要图像的分辨率允许,即可通过对图像的缩放来获取微根系参数[103]。WinRHIZO可以检测根重叠区域并对其进行校正,将根长分配给预定义的一类直径,从而给出整个根系统的直径分布[102]。Zobel等[104]用该软件分析小麦、豇豆、可可等12个植物品种的细根直径对养分的响应;Wang等[105]发现在有残根和无残根的样品中,根长、根直径和根表面积均存在显著差异,认为残根的影响可能超过了WinRHIZO的重叠校正效果;在检验WinRHIZO方法与Tennant[106]方法的一致性时发现二者在根长、根投影面积和根直径上同样存在差异,说明根测量值的差异很可能与选择的方法有关,选择根系分析软件时须考虑这一点。

      • SmartRoot是一款独立于操作系统,基于开放源Image J图像分析软件的一款根系分析软件 (https://smartroot.github.io),通过分析根系图像可得到细根长度、表面积、体积和平均根直径等信息。该软件由Lobet等[107]于2011年研发,简化了复杂根系生长和结构发育的定量分析。比较SmartRoot和WinRHIZO两种根系软件分析细根性状,发现所获取根系指标结果基本一致,认为SmartRoot具有一定的精度和可靠性[108-109]。SmartRoot为半自动分析,需要手动描出每条根系并进行命名,分析效率远低于WinRHIZO。SmartRoot可以为每一条根系命名,进而区分主根和侧根,这是其优势。另一优势为,它对图片分辨率要求低,支持图像格式多,利于对低分辨率的根系图像分析。

      • RootReader2D是Clark等[110]于2013年开发的一个基于java的独立程序 (http://www.plantmineralnutrition.net/),为一种半自动分析软件,旨在量化整个根系和特定根系的生长响应,该软件能够高效地分析高分辨率、高对比度、高精度的根图像,具有适用性广的特点,用于水培、凝胶、土壤和纸基等多种培养环境下根系图像的分析。

      • Leitner等[111]开发了一种可完全自动进行二维根系追踪的算法—Root System Analyzer (http://www.csc.univie.ac.at/rsa),用于从根系统的二维图像中恢复根架构参数,使用动态架构模型来决定特定的路径是否可以用来表示根,有助于区分根重叠和分支;在根追踪步骤之后,可计算根系的全局特征。

        Root System Analyzer与SmartRoot有类似的后处理、参数检索和图像序列处理功能,但是根系追踪的基础算法有所不同。Root System Analyzer在与RootReader2D的比较中显示了类似的自动骨架化和图形创建过程。但是在RootReader2D中,必须通过至少一次鼠标单击进行手动根系跟踪;此外,Root System Analyzer更适合追踪较大的根系,分析根系的动态发展,如单个根系的伸长率等。

      • 在根系研究中,主根和侧根响应胁迫的特异性反应存在差异,因此定量分析主根和侧根随时间的发育特征及两者的关系是十分必要的。这就需要能够自动提取有关根系定量信息的分析方法,区分主根、侧根根系信息,并尽可能的从含有较高噪声的根系图像中区分。为应对该问题,Cai等[112]开发出一种全自动化的算法工具—RootGraph (www.plant-image-analysis.org/software/RootGraph)。该软件结合了图像处理和图形优化技术,可以自动区分主根和侧根并量化每个主根以及每个主根的相关侧根形状,最终可把侧根及其性质与产生侧根的特定初生根联系起来。与SmartRoot相比,RootGraph可以在高通量的条件下区分主根和侧根。此外,还可以排除附着在根毛上的土壤颗粒引起的干扰,最终准确地估计根的数量、长度和直径等信息。目前同样有一些软件工具可以达到将主根与侧根分离的目的,例如SmartRoot[107],ARIA[113],RootNav[114],Root System Analyzer[111]和RTipC[115]等。

      • 针对根毛图像的获取和分析十分具有挑战性,付艳茹等[116]使用图像分析软件Image J的基础功能测量水稻根毛和主根面积,根据公式 (根毛和主根面积−主根面积)/(2 × 所选区域的长度) 计算得到根毛的平均长度,使对根毛长度的精确量化成为可能;Vincent等[117]于2017年开发出一种量化数字图像中根毛面积的方法,即使用Image J和R开源软件,并结合代码实现部分自动化,它需要手工追踪一组根毛图像,将图像中的每个颜色通道作为自变量进行多元逻辑回归,然后将该模型应用于所选根毛进而估计根毛面积,可以快速实现对根毛面积的定量与根毛面积动态的评价,该方法可用于各种土壤类型和不同根毛特征的研究中,拓展了对原位水平根毛研究;还有研究直接使用图像处理软件Adobe Photoshop的测量工具进行根毛长度的数据获取[97]

      • 除了以半自动、全自动的软件获取根系特征数据,还有研究者为了增强使用体验和数据的共享性,开发了能够进行数据交流与分享的根系分析平台。Das等[118]开发了名为Digital Imaging of Root Traits (DIRT,http://dirt.iplantcollaborative.org/) 的自动化高通量根系表型计算和协作在线平台,能够存储、管理和共享带有元数据的作物根系图像,并行地从数千幅图像中计算根系结构特征,并允许实现数据共享,团队成员可通过基于互联网的交互界面访问;该软件还支持基于用户访问权限的各类功能,比如数据的所有者可以编辑、上传、下载和删除图像和相应的元数据。

        Lobet等[119]开发了Root System Markup Language(RSML,http://rootsystemml.github.io),以简单和可互操作的方式实现了不同软件之间根结构数据的可移植性,有助于在不同软件、实验和研究小组之间共享根系结构信息,允许无缝协作工作,并提供一种标准格式,在此基础上建立根表型中央资源库。RSML遵循XML标准来存储二维或三维图像元数据、植物和根的几何结构、沿单个根路径的连续函数以及一个或多个时间点上图像、植物或根比例的一组注释。目前,RSML已成功应用于5个根图像分析软件 (RhizoScan、RootNav、RooTrak、Root System Analyzer、SmartRoot) 和3种功能结构根模型 (RootBox,ArchiSimple,R-SWMS) 中,并开发了5个开源包 (c#、R、Excel、Java和Python) 用于分析和可视化RSML数据文件。

        由于现有软件工具的多样性,使得研究人员很难确定最适合的软件,Lobet等[120]基于这个问题,开发了一个在线数据库 (www.plant-image-analysis.org)。该数据库包含90余个植物图像分析软件 (包括根系图像分析软件),以非常简洁的方法使用户能够快速找到满足试验需求的解决方案,该网站还支持用户的反馈和新软件的上传。

        上述根系软件极大促进了根系研究深度。选用分析软件需要考虑培养基质和软件功能。大部分软件能够完成分辨高质量2D根系表型信息,但基质培养的成体根系分析会受到部分限制。这是由于部分基质的颗粒可能附着到微根系上,对图像处理形成干扰,导致部分软件 (如WinRHIZO和EZ-Rhizo等) 在处理该类型微根系图像时会产生一定偏差[121]。因此基质条件下开展微根系研究要选取合适的培养基质。若采用凝胶培养法和纸基培养法不会造成基质颗粒的影响,分析时受到的干扰较少。Marié等[43]使用多个软件对基于纸基的根系原位图像进行分析,认为SmartRoot可以对根的生长进行精确评估,但需要手工追踪根系;GiA Roots可以对全局根特征进行良好的分析,为批量处理提供了最佳的分割方法,但是会高估根的长度;而WinRHIZO虽能提供最快速和精确的根长、直径类评估,但在图像分割和根系统架构分析方面存在弱点。由于各软件均是针对不同根系图像的特点解决某一类相应的问题,因此在图像分析方法的选择上还需要研究者视具体研究对象、期望结果等来选取适合的工具,目前缺乏适用于所有类型根系分析的完美工具。表1中简要总结了部分现有根系分析软件。

        表 1  根系分析软件概览*

        Table 1.  Overview of available data processing software

        软件
        Software
        可获取的根系形态特征
        Mainly acquired root traits
        自动化水平
        Automation level
        参考文献及软件网址
        Reference and software website
        2D根系图像处理 2D root image processing
        Aria长度形状、凸包、主根、侧根、拓扑结构Length/shape,convex-hull,main root,lateral root,topology自动Automated         [113]
        ARTT定位、方向、速度分布Localisation,orientation,velocity-profile自动Automated         [122]
        BRAT直径、长度、方向Diameter,length,orientation自动Automated         [123]
        http://www.gmi.oeaw.ac.at/researchgroups/wolfgang-busch/resources/brat
        DART插入、长度、拓扑结构Insertion,length,topology手动Manual         [124] http://www.avignon.inra.fr/psh/outils/dart
        DIRT分支角度、密度、直径、分布、长度、数据共享Branch angle,density,diameter,distribution,length,data sharing自动Automated         [125]
        http://dirt.iplantcollaborative.org/
        ElonSim长度length自动Automated         [126]
        EZ-Rhizo插入角、长度、分枝数、拓扑结构Insertion-angle,length,number of branches,topology半自动Semi-automated         [127]
        http://www.ez-rhizo.psrg.org.uk/
        EZ-Root-VIS根长,密度,角度,根据实测数据计算、可视化重建根系Length,density and angle are calculated and visualized according to the measured data自动Automated         [128] http://www.psrg.org.uk/download/Rhizo-64.msi
        GiA Roots凸包、深度、长度、分枝数、周长、表面、体积Convex-hull,depth,length,number of branches,perimeter,surface,volume自动Automated         [129]
        http://www.giaroots.org
        GROW Map-Root速度分布Velocity-profile自动Automated         [130]
        GrowScreen-Root插入角、长度、分枝数Insertion-angle,length,number of branches半自动Semi-automated         [131]
        Growth Explorer速度变化Velocity-profile自动Automated         [132]
        IJ-Rhizo直径、长度Diameter,length自动Automated         [133]
        KineRoot向重力性、增长Gravitropism,growth自动Automated         [134]
        MyROOT根长,识别不同年龄和形态的下胚轴Length,identifying hypocotyls of different ages and shapes半自动Semi-automated         [135]
        https://www.cragenomica.es/research-groups/brassinosteroid-signaling-in-plant-development
        PlantVis速度分布Velocity-profile自动Automated         [136]
        RNQS计数、长度、节点Count,length,nodules自动Automated         [137]
        http://hdl.handle.net/10393/30321
        RootGraph计数、长度、直径、主根、侧根、拓扑结构Count,length,diameter,main,lateral root,topology自动Automated         [112]
        http://www.plant-image-analysis.org/ software/RootGraph
        Root System Analyzer计数、直径、插入角、插入、长度Count,diameter,insertion-angle,insertion,length自动Automated         [111]
        http://www.csc.univie.ac.at/rsa
        rhizoTrak长度、表面积、体积、拓扑结构、根注释、分支结构Length,surface area,volume,topology,root annotation,branch structure手动,半自动Manual,semi-automatic         [138]
        https://prbio-hub.github.io/rhizoTrak
        RootFlowRT伸长,速度分布Growth,velocity-profile自动Automated         [139]
      • 综上所述,在植物微根系形态的原位观测方法开发方面,前人已经开展了大量研究,在微根系生长平台、图像获取平台和图像分析软件支持上已进入比较深入的研究阶段。国内外大量研究者提出的解决方案,极大促进了根系研究深度,如根系形态发育规律、高通量根系表型筛选、根毛发育规律等。但由于微根系原位研究大多基于实验室内采用特征基质培养植株,前提是培养基质中不存在孔隙,这些要求在实际大田中是不可能实现的。此外,大田土壤中的根系成像还需要与根系构成较大颜色对比和密度差异,因此,作物微根系形态方法真正服务于真实根系生长规律的研究,尚有大量实践问题函待解决,需要农学、数学、植物学、生命科学及计算机等多个学科的合作与大量的重复试验,才有可能使研究成果更好的服务于生产实践。

    参考文献 (145)

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