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添加生物炭改善菜地土壤氨氧化细菌群落提高净硝化率

王先芳 任天志 智燕彩 张贵龙 李洁 王知文

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添加生物炭改善菜地土壤氨氧化细菌群落提高净硝化率

    作者简介: 王先芳 E-mail:wxfde163yx@163.com;
    通讯作者: 任天志, E-mail:rentianzhi@caas.cn ; 李洁, E-mail:lijie@caas.cn
  • 基金项目: 中国农业科学院科技创新工程;国家重点研发计划课题(2018YFD0800404);国家自然科学基金项目(41571292)。

Biochar application improves ammonia oxidation microbial community and increases net nitrification in vegetable soils

    Corresponding author: Ren Tian-zhi, E-mail:rentianzhi@caas.cn ;Li Jie, E-mail:lijie@caas.cn ;
  • 摘要: 【目的】氨氧化过程是硝化作用的限速步骤,对氮循环有着重要影响。因此本文研究生物炭输入对土壤硝化作用的影响及生物学机制,观测生物炭输入下土壤氨氧化微生物群落的变化。【方法】以华北潮土区设施菜地土壤为对象,设置生物炭梯度 (C0、C0.5、C1.5、C4.0) 土壤培养试验,结合PCR和T-RFLP等分析技术,观测生物炭输入下土壤氨氧化细菌群落变化动态,解析生物炭、土壤硝化作用与氨氧化细菌群落之间的互助关系。【结果】添加生物炭显著改变了土壤氨氧化微生物群落结构及氮素硝化过程。与未添加相比,生物炭添加前期土壤氨氧化细菌群落Shannon、Evenness指数分别升高5.4%~18.8%、26.2%~33.8%,后期Shannon指数降低20.7%~34.2%。生物炭输入对AOA群落没有显著影响,AOB群落256 bp、58 bp代表物种丰度分别增加61.4%~56.0%、60.6%~78.6%,488 bp代表物种丰度降低22.8%~26.9%。21 bp代表物种丰度前增加后期降低,与491 bp代表物种丰度变化相反。添加生物炭土壤AOB amoA基因丰度分别增加26.3%~40.2%。土壤NO3-N含量提高1.7%~25.6%,NH4+-N含量下降13.4%~31.1%,土壤净硝化速率提高21.8%~70.2%。【结论】生物炭的输入可以改善以AOB为主的土壤氨氧化微生物群落结构,刺激amoA酶活性,但是对氨氧化古菌微生物群落结构未产生显著影响。因此,生物炭提高土壤净硝化速率的作用与其对土壤氨氧化细菌菌落和组成的影响密切相关。
  • 图 1  土壤AOB和AOA的限制性酶切片段和相对丰度

    Figure 1.  Average relative abundance of soil AOB and AOA T-RFs

    图 3  生物炭处理土壤在不同培养天数AOA和AOB的amoA基因拷贝数

    Figure 3.  amoA gene copies of AOA and AOB in biochar treated soils at different incubation days

    图 4  土壤NH4+-N和NO3-N浓度随培养天数的变化

    Figure 4.  Changes of soil NO3-N and NH4+-N concentrations with incubation days

    图 5  土壤净硝化速率随培养时间的变化

    Figure 5.  Changes in soil net nitrification rate with incubation days

    表 1  生物炭的组分分析和化学性质

    Table 1.  Basic properties of peanut shell biochar and mass fraction of surface elements

    pHNH4+-N (mg/kg)CEC (cmol/k)SSA (m2/g)孔隙度 (nm) Porosity灰分 (%) Ash挥发分 (%) Volatile matter固定碳 (%) Fixed C
    7.920.8340.519.360.893.000.6696.3
    相对原子比Relative atomic ratio (%)
    CHOSPMgClKCa
    80.740.9815.430.070.180.480.340.81.05
    注(Note):SSA—比表面积 Specific surface are; CEC—阳离子交换量 Cation exchange capacity
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    表 2  qPCR引物和反应条件

    Table 2.  qPCR primers and reaction conditions

    目标基因
    Target gene
    引物
    Primer
    序列5′-3′
    Sequence 5′-3′
    退火温度 (℃)
    Annealingtemperature
    产物片段[26] (bp)
    Product fragmentsize
    氨氧化细菌amoA (AOB)amoA-1FGGGGTTTCTACTGGTGGT56491
    amoA-2RCCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC
    氨氧化古菌amoA (AOA)Arch-amoAFSTAATGGTCTGGCTTAGACG55629
    Arch-amoARGCGGCCATCCATCTGTATGT
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    表 3  培养0和90天AOA和AOB的Shannon指数和Evenness指数

    Table 3.  Shannon and evenness index of soil AOA and AOB at incubation of 0 and 90 days

    培养天数 (d) Incubation dayAOAAOB
    C0C0.5C1.5C4.0C0C0.5C1.5C4.0
    Shannon
    00.76 ± 0.23 a0.81+0.09 a0.77 ± 0.19 a0.84 ± 0.16 a1.28 ± 0.56 c 1.49 ± 0.07 ab1.52 ± 0.08 a1.35 ± 0.01 b
    901.08 ± 0.26 a1.08 ± 0.03 a0.95 ± 0.05 a1.04 ± 0.02 a2.66 ± 0.04 a 2.11 ± 0.10 ab 1.90 ± 0.07 bc1.75 ± 0.10 c
    Evenness
    00.53 ± 0.12 a0.52+0.03 a0.54 ± 0.06 a0.54 ± 0.08 a0.65 ± 0.03 b0.82+0.04 a0.84 ± 0.02 a0.87 ± 0.04 a
    900.68 ± 0.32 a0.61 ± 0.01 a0.61 ± 0.03 a0.69 ± 0.03 a0.86 ± 0.01 a0.79 ± 0.04 a0.84 ± 0.01 a0.78 ± 0.02 a
    注(Note):数据后不同字母表示同一时间不同培养时间之间差异达到 5% 显著水平 Values followed by different small letters meas significant differences among incubation days at the same time (P < 0.05).
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    [18] 丁伟叶江平蒋卫霍沁建陈晓明梁永江张长华袁玲 . 施肥对植烟土壤微生物的影响. 植物营养与肥料学报, doi: 10.11674/zwyf.2012.11415
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-07-01
  • 网络出版日期:  2020-03-19

添加生物炭改善菜地土壤氨氧化细菌群落提高净硝化率

    作者简介:王先芳 E-mail:wxfde163yx@163.com
    通讯作者: 任天志, rentianzhi@caas.cn
    通讯作者: 李洁, lijie@caas.cn
  • 1. 东北农业大学资源与环境学院,黑龙江哈尔滨 150030
  • 2. 农业农村部环境保护科研监测所/天津市农业环境与农产品安全重点实验室,天津 300191
  • 基金项目: 中国农业科学院科技创新工程;国家重点研发计划课题(2018YFD0800404);国家自然科学基金项目(41571292)。
  • 摘要: 【目的】氨氧化过程是硝化作用的限速步骤,对氮循环有着重要影响。因此本文研究生物炭输入对土壤硝化作用的影响及生物学机制,观测生物炭输入下土壤氨氧化微生物群落的变化。【方法】以华北潮土区设施菜地土壤为对象,设置生物炭梯度 (C0、C0.5、C1.5、C4.0) 土壤培养试验,结合PCR和T-RFLP等分析技术,观测生物炭输入下土壤氨氧化细菌群落变化动态,解析生物炭、土壤硝化作用与氨氧化细菌群落之间的互助关系。【结果】添加生物炭显著改变了土壤氨氧化微生物群落结构及氮素硝化过程。与未添加相比,生物炭添加前期土壤氨氧化细菌群落Shannon、Evenness指数分别升高5.4%~18.8%、26.2%~33.8%,后期Shannon指数降低20.7%~34.2%。生物炭输入对AOA群落没有显著影响,AOB群落256 bp、58 bp代表物种丰度分别增加61.4%~56.0%、60.6%~78.6%,488 bp代表物种丰度降低22.8%~26.9%。21 bp代表物种丰度前增加后期降低,与491 bp代表物种丰度变化相反。添加生物炭土壤AOB amoA基因丰度分别增加26.3%~40.2%。土壤NO3-N含量提高1.7%~25.6%,NH4+-N含量下降13.4%~31.1%,土壤净硝化速率提高21.8%~70.2%。【结论】生物炭的输入可以改善以AOB为主的土壤氨氧化微生物群落结构,刺激amoA酶活性,但是对氨氧化古菌微生物群落结构未产生显著影响。因此,生物炭提高土壤净硝化速率的作用与其对土壤氨氧化细菌菌落和组成的影响密切相关。

    English Abstract

    • 生物炭作为一种富碳的多功能材料,输入土壤后可为微生物提供栖息场所,丰富碳氮源,影响其生长繁殖[1-3]。研究表明,水稻土中施用小麦秸秆生物炭 (350℃~550℃),短期内显著改变了黄棕壤和潮土的微生物群落结构,其中黄棕壤的微生物丰富度和多样性显著提高[4]。在红壤、棕壤和盐渍土施用水稻秸秆生物炭不同程度地增加了硫杆菌 (Thiobacillus)、假单胞菌 (Pseudomonas) 和黄杆菌 (Flavobacterium) 在土壤中的相对丰度和分布[5-6]。土壤微生物是农田土壤养分循环的重要驱动者,其中氨氧化细菌 (AOB) 和氨氧化古菌 (AOA) 是氮素转化过程中的关键微生物[7-8]。在森林土壤中,已经发现AOB的amoA基因的丰度和硝化速率随着木炭生物炭的添加而增加[9-10]。有研究结果显示,同时添加尿素和玉米秸秆生物炭显著提高了土壤中AOB、AOA的amoA硝化基因及nirS、nirK、nosZ型反硝化基因的基因丰度[11]。生物炭还可以通过提高土壤pH值等环境因子和催化铵态氮的氧化过程等来促进硝化作用[9,12]。然而,也有研究发现施加生物质炭对土壤的硝化作用不产生显著影响,甚至产生抑制作用,认为生物炭中含硝化抑制化合物 (α-pine烯)、微生物毒性芳香类化合物 (PHCs) 等物质,对AOB等微生物生长活动造成不利影响[13-14]。不同原料、热解工艺等制备的生物炭的理化性质差异较大[15],如玉米秸秆生物炭、木屑生物炭、花生壳生物炭等不同材料生物炭本身的理化性状[16]、吸附特征[17]、有害物质释放量[18]等存在差异,高温热解生物炭多呈碱性、灰分成分较少,低温热解生物炭多呈中性或弱碱性,灰分成分多[19]。另外,不同的添加量、土壤类型等[5]也可能导致不同的效应。

      菜地作为一种农田利用类型,耕作方式、栽培管理等有别于粮田,土壤养分循环及生物群落结构等性状有一定的特异性[20]。探索生物炭施用条件下菜地土壤微生物群落的变化特征,解析其与氮素循环的关系,对于丰富生物炭影响土壤肥力的认识具有积极意义。本研究以花生壳为原料,在600℃条件下厌氧热解制备生物炭,设置梯度土壤培养试验,结合qPCR和T-RFLP等分析技术,观测生物炭输入条件下华北潮土设施菜地土壤氨氧化关键微生物群落及土壤硝化作用的变化,解析生物炭、氨氧化微生物及硝化作用之间的关系,以揭示生物炭对菜地土壤氮素转化的影响及机制,为生物炭在菜地氮肥优化管理中的应用提供科学依据。

      • 供试土壤取自天津市静海区生宝谷物设施农业园区 (38.48° N、117.16° E) 的设施黄瓜菜地,采样深度为耕层的0—20 cm。供试土壤理化性质:pH 7.87、电导率2.68 μS/cm、铵态氮28.6 mg/kg、硝态氮191 mg/kg、有机质20.31 g/kg、全氮16.96 g/kg、C/N为1.19。将采集的土壤挑去细根和石块,分两部分保存,一部分过2 mm筛用于培养试验,另一部分风干研磨过0.25 mm、1 mm筛用于测定其基本理化性质。

      • 以花生壳为原料,研磨过1 mm筛后在600℃条件下高温裂解制成生物炭,后经酸洗再水洗至中性,烘干研磨过2 mm筛,密封保存备用。生物炭基本性质以及表面元素质量分数如下表。

        表 1  生物炭的组分分析和化学性质

        Table 1.  Basic properties of peanut shell biochar and mass fraction of surface elements

        pHNH4+-N (mg/kg)CEC (cmol/k)SSA (m2/g)孔隙度 (nm) Porosity灰分 (%) Ash挥发分 (%) Volatile matter固定碳 (%) Fixed C
        7.920.8340.519.360.893.000.6696.3
        相对原子比Relative atomic ratio (%)
        CHOSPMgClKCa
        80.740.9815.430.070.180.480.340.81.05
        注(Note):SSA—比表面积 Specific surface are; CEC—阳离子交换量 Cation exchange capacity
      • 将土壤在25℃和55%的持水量 (WHC) 下预培养7天。称取200 g土壤,设置4个梯度生物炭0.0%、0.5%、1.5%、4.0%,分别标记为C0、C0.5、C1.5、C4.0,与等量尿素氮肥 (200 kg/hm2) 混合施入土壤,设置四次重复,放置于玻璃器皿中 (高20 cm、直径5 cm),加水量至田间最大持水量的55%,置于25℃恒温培养。每隔两天用称重法加水,在第0、3、5、10、15、30、55、90天进行取样,取得的土样分别放置于4℃、–20℃、–70℃保存,用于各种指标测定。

      • 土壤含水量采用烘干法测定,土壤有机质含量采用重铬酸钾容量法测定,土壤pH采用电位法 (水土比2.5׃1),土壤全氮含量采用消煮—流动分析仪法测定[21]。土壤硝态氮和铵态氮采用0.01 mol/LCaCl2浸提—流动分析仪测定[22-23],并且根据Persson和Wirén等式计算净硝化率 (n)[24]

      • 采用Power Soil TM Total DNA Isolation 试剂盒 (Mo Bio Laboratories,Solana Beach,CA,USA) 提取土壤总DNA。称取0.25~0.5 g保存于–70℃ 冰箱中的土壤样品,按照试剂盒操作说明进行提取,最后用100 μLddH2O洗脱获得DNA样品。所获得的土壤总DNA质量采用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测,并保存于–70℃ 中用于后续试验与分析。

      • qPCR反应体系含上下游引物各 (10 μmol/L) 1 μL、2 × PCR Master Mix10 μL、模板DNA2 μL、补充ddH2O至20 μL,每个DNA样品各3次重复,并设置无模板对照 (No Template Control,NTC)。对含有克隆amoA基因的线性化质粒进行10倍梯度连续稀释,得到校准曲线。采用PCR效率为90%–110%,相关系数 > 0.98的标准曲线。qPCR引物信息和反应条件见表2

        表 2  qPCR引物和反应条件

        Table 2.  qPCR primers and reaction conditions

        目标基因
        Target gene
        引物
        Primer
        序列5′-3′
        Sequence 5′-3′
        退火温度 (℃)
        Annealingtemperature
        产物片段[26] (bp)
        Product fragmentsize
        氨氧化细菌amoA (AOB)amoA-1FGGGGTTTCTACTGGTGGT56491
        amoA-2RCCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC
        氨氧化古菌amoA (AOA)Arch-amoAFSTAATGGTCTGGCTTAGACG55629
        Arch-amoARGCGGCCATCCATCTGTATGT