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硝化抑制剂对稻田土壤N2O排放和硝化、反硝化菌数量的影响

李杰 石元亮 王玲莉 孙毅 李忠 魏占波 石淏心

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硝化抑制剂对稻田土壤N2O排放和硝化、反硝化菌数量的影响

    作者简介: 李杰E-mail:jieli@iae.ac.cn;
  • 基金项目: 国家重点研发计划项目(2018YFD0200200,2017YFD0200708);国家自然科学基金项目(41807107)。

Comparison of nitrification inhibitors on N2O emission and abundances of nitrifier and denitrifier in paddy soil

  • 摘要: 【目的】本研究旨在明确硝化抑制剂对稻田土壤氮素周转的影响,探讨抑制剂提高氮肥利用率及微生物响应机理。【方法】以草甸黑土发育的水稻土为研究对象,进行了两组培养试验 (25℃),培养周期均为150天。共设4个处理:1) 不施肥 (CK);2) 单施尿素 (Urea);3) 尿素 + 双氰胺 (Urea + DCD);4) 尿素 + 3, 4-二甲基吡唑磷酸盐 (Urea + DMPP)。一组试验从培养第1天起,抽取气体样品,用气相色谱法测定N2O排放量。另一组试验从培养第1天直到结束,取土样测定氨氧化细菌和氨氧化古菌数量,采用荧光定量PCR等技术测定nirK基因和nirS基因拷贝数,用常规方法测定土壤无机氮含量。【结果】施用尿素显著增加了N2O排放量,其中85%的N2O排放发生在培养开始后的前两周内。Urea + DMPP处理土壤NH4+浓度在前23天稳定在较高水平,与Urea处理相比,N2O减排率为78.3%,Urea + DCD处理为21.6%。Urea + DMPP处理排放系数为0.05%,Urea + DCD为0.18%,Urea + DMPP处理显著低于Urea + DCD处理。施用尿素培养,土壤氨氧化细菌 (AOB) 数量显著增加而氨氧化古菌 (AOA) 数量则显著减少。添加DCD和DMPP能显著抑制AOB的数量,但对AOA没有影响。培养第3、30和90天,Urea + DMPP处理土壤中的AOB数量显著低于Urea + DCD处理的30%、56%和60%。对于反硝化细菌来说,所有处理中的nirK基因拷贝数均显著高于nirS基因拷贝数。添加DMPP在培养第3和30天显著减少了含nirKnirS基因的反硝化细菌数量,而添加DCD对两类反硝化细菌数量无明显作用。【结论】东北黑土水稻生产中,硝化抑制剂DMPP降低N2O排放量和排放系数的效果显著好于DCD,因为DMPP在培养后的30天内,可以显著抑制氨氧化细菌繁衍,降低反硝化细菌数量,从而起到减少N2O排放、提高肥料利用率的作用。
  • 图 1  添加不同硝化抑制剂土壤N2O排放通量、NH4+-N和NO3-N含量的变化

    Figure 1.  Variation of N2O emission, NH4+-N and NO3-N contents in soils added with different nitrification inhibitors

    图 2  硝化抑制剂对氨氧化细菌和氨氧化古菌丰度的影响

    Figure 2.  Effect of nitrification inhibitors on abundance of AOB amoA (a) and AOA amoA gene (b)

    图 3  添加不同硝化抑制剂土壤中的反硝化基因nirSnirK基因拷贝数

    Figure 3.  Abundance of nirS and nirK gene in soils added with different nitrification inhibitors

    表 1  定量PCR所用引物及PCR条件

    Table 1.  Primers and conditions for RT-PCR

    目标基因 Target gene引物 Primer引物序列5′–3′ Primer sequence退火温度 Anneal temperature (°C)参考文献 Reference
    AOB amoAAmoA-1FGGGGTTTCTACTGGTGGT60[10]
    AmoA-2RCCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC60
    AOA amoAamoAFSTAATGGTCTGGCTTAGACG60[11]
    amoARGCGGCCATCCATCTGTATGT60
    nirKnirK 1FGGMATGGTKCCSTGGCA55[12]
    nirK 5RGCCTCGATCAGRTTRTGGTT55
    nirSnirS cd3aFGTSAACGTSAAGGARACSGG55[13]
    nirS R3cdGASTTCGGRTGSGTCTTGA55
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    表 2  添加不同抑制剂土壤N2O排放总量和排放系数

    Table 2.  Total N2O emissions and emission factors in soils added with different nitrification inhibitors

    处理
    Treatment
    N2O排放总量 (N2O-N kg/hm2)
    Total N2O emission
    减排率 (%)
    Emission reduction rate
    排放系数 (%)
    Emission factor
    CK1.0 d
    Urea41.2 a0.23 a
    Urea+ DCD32.3 b21.60.18 b
    Urea+DMPP8.9 c78.30.05 c
    注(Note):同列数据后不同小写字母表示施肥处理间差异显著 (P < 0.05) Values followed by different small letters indicate significant difference among the treatments (P < 0.05).
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  • [1] 中华人民共和国国家统计局. 中国统计年鉴[M]. 北京: 中国统计出版社, 2018.

    National Bureau of Statistics of China. China statistical yearbook[M]. Beijing: China Statistics Press, 2018.
    [2] 冯裕华. 气候变暖的风险与对策[J]. 上海环境科学, 2000, 19(6): 272–275. Feng Y H. Risks and countermeasures of climate changes[J]. Shanghai Environmental Sciences, 2000, 19(6): 272–275.
    [3] IPCC. Climate Change 2001: The Scientific Basis: Chapter 4: Atmosphere chemistry and greenhouse gases[M]. Cambridge: Cambridge University Press, 2001.
    [4] 杨光明, 武文明, 沙丽清. 西双版纳地区稻田甲烷的排放通量[J]. 山地学报, 2007, 25(4): 461–468. Yang G M, Wu W M, Sha L Q. CH4 emission from paddy fields in Xishuangbanna, southwest China[J]. Journal of Mountain Science, 2007, 25(4): 461–468. doi:  10.3969/j.issn.1008-2786.2007.04.012
    [5] Weiske A, Benckiser G, Herbert T, Ottow J. Influence of the nitrification inhibitor 3,4-dimethylpyrazole phosphate (DMPP) in comparison to dicyandiamide (DCD) on nitrous oxide emissions, carbon dioxide fluxes and methane oxidation during 3 years of repeated application in field experiments[J]. Biology and Fertility of Soils, 2001, 34: 109–117. doi:  10.1007/s003740100386
    [6] Di H J, Cameron K C. The use of a nitrification inhibitor, dicyandiamide (DCD), to decrease nitrate leaching and nitrous oxide emissions in a simulated grazed and irrigated grassland[J]. Soil Use and Management, 2002, 18(4): 395–403. doi:  10.1079/SUM2002151
    [7] Menéndez S, Barrena I, Setien I, et al. Efficiency of nitrification inhibitor DMPP to reduce nitrous oxide emissions under different temperature and moisture conditions[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2012, 53: 82–89. doi:  10.1016/j.soilbio.2012.04.026
    [8] Schinner F, Ohlinger R, Kandeler E, Margesin R. Methods in soil biology[M]. Washington D. C.: Springer-Verlag, 1996: 426.
    [9] Chen Z, Luo X Q, Hu R G, et al. Impact of long-term fertilization on the composition of denitrifier communities based on nitrite reductase analyses in a paddy soil[J]. Microbial Ecology, 2010, 60(4): 850–861. doi:  10.1007/s00248-010-9700-z
    [10] Rotthauwe J H, Witzel K P, Liesack W. The ammonia monooxygenase structural gene amoA as a functional marker: molecular fine-scale analysis of natural ammonia-oxidizing populations[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1997, 63(12): 4704–4712.
    [11] Francis C A, Roberts K J, Beman J M, et al. Ubiquity and diversity of ammonia-oxidizing archaea in water columns and sediments of the ocean[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2005, 102: 14683–14688. doi:  10.1073/pnas.0506625102
    [12] Braker G, Zhou J Z, Wu L Y, et al. Nitrite reductase genes (nirK and nirS) as functional markers to investigate diversity of denitrifying bacteria in Pacific northwest marine sediment communities[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2000, 66: 2096–2104. doi:  10.1128/AEM.66.5.2096-2104.2000
    [13] Throbäck I N, Enwall K, Jarvis Å, Hallin S. Reassessing PCR primers targeting nirS, nirK and nosZ genes for community surveys of denitrifying bacteria with DGGE[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2004, 49: 401–417. doi:  10.1016/j.femsec.2004.04.011
    [14] Lopez-Gutierrez J C, Henry S, Hallet S, et al. Quantification of a novel group of nitrate-reducing bacteria in the environment by real-time PCR[J]. Journal of Microbiological Methods, 2004, 57(3): 399–407. doi:  10.1016/j.mimet.2004.02.009
    [15] Wu Y, Lu L, Wang B, et al. Long-term field fertilization significantly alters community structure of ammonia-oxidizing bacteria rather than archaea in a paddy soil[J]. Soil Science Society of America Journal, 2011, 75: 1431. doi:  10.2136/sssaj2010.0434
    [16] Guo Y, Li B, Di H, et al. Effects of dicyandiamide (DCD) on nitrate leaching, gaseous emissions of ammonia and nitrous oxide in a greenhouse vegetable production system in northern China[J]. Soil Science and Plant Nutrition, 2012, 58: 647–658. doi:  10.1080/00380768.2012.726921
    [17] Fettweis U, Mittelstaedt W, Schimansky C, Führ F. Lysimeter experiments on the translocation of the carbon-14-labelled nitrification inhibitor 3, 4-dimethylpyrazole phosphate (DMPP) in a gleyic cambisol[J]. Biology and Fertility of Soils, 2001, 34: 126–130. doi:  10.1007/s003740100385
    [18] Zerulla W, Barth T, Dressel J, et al. 3, 4-Dimethylpyrazole phosphate (DMPP)—a new nitrification inhibitor for agriculture and horticulture[J]. Biology and Fertility of Soils, 2001, 34: 79–84. doi:  10.1007/s003740100380
    [19] Verchot L V, Groffman P M, Frank D A. Landscape versus ungulate control of gross mineralization and gross nitrification in semi-arid grasslands of Yellowstone National Park[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2002, 34: 1691–1699. doi:  10.1016/S0038-0717(02)00155-4
    [20] Di H J, Cameron K C. Inhibition of ammonium oxidation by a liquid formulation of 3,4-dimethylpyrazole phosphate (DMPP) compared with a dicyandiamide (DCD) solution in six new Zealand grazed grassland soils[J]. Journal of Soils and Sediments, 2011, 11: 1032–1039. doi:  10.1007/s11368-011-0372-1
    [21] Li J L, Li Y, Wan Y F, et al. Combination of modified nitrogen fertilizers and water saving irrigation can reduce greenhouse gas emissions and increase rice yield[J]. Geoderma, 2018, 315: 1–10. doi:  10.1016/j.geoderma.2017.11.033
    [22] Schleper C, Jurgens G, Jonuscheit M. Genomic studies of uncultivated archaea[J]. Nature Reviews Microbiology, 2005, 3: 479–488. doi:  10.1038/nrmicro1159
    [23] Valentine D L. Adaptations to energy stress dictate the ecology and evolution of the Archaea[J]. Nature Reviews Microbiology, 2007, 5: 316–323. doi:  10.1038/nrmicro1619
    [24] O'Callaghan M, Gerard E M, Carter P E, et al. Effect of the nitrification inhibitor dicyandiamide (DCD) on microbial communities in a pasture soil amended with bovine urine[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2010, 42: 1425–1436. doi:  10.1016/j.soilbio.2010.05.003
    [25] Dobbie K E, Smith K A. Nitrous oxide emission factors for agricultural soils in Great Britain: the impact of soil water-filled pore space and other controlling variables[J]. Global Change Biology, 2003, 9: 204–218. doi:  10.1046/j.1365-2486.2003.00563.x
    [26] Braker G, Fesefeldt A, Witzel K P. Development of PCR primer systems for amplification of nitrite reductase genes (nirK and nirS) to detect denitrifying bacteria in environmental samples[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1998, 64: 3769–3775.
    [27] Yoshida M, Ishii S, Otsuka S, Senoo K. Temporal shifts in diversity and quantity of nirS and nirK in a rice paddy field soil[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2009, 41: 2044–2051. doi:  10.1016/j.soilbio.2009.07.012
    [28] Yuan Q, Liu P, Lu Y. Differential responses of nirK-and nirS-carrying bacteria to denitrifying conditions in the anoxic rice field soil[J]. Environmental Microbiology Reports, 2012, 4: 113–122. doi:  10.1111/j.1758-2229.2011.00311.x
    [29] Bao Q, Ju X, Gao B, et al. Response of nitrous oxide and corresponding bacteria to managements in an agricultural soil[J]. Soil Science Society of America Journal, 2012, 76: 130–141. doi:  10.2136/sssaj2011.0152
    [30] Di H J, Cameron K C. Effects of temperature and application rate of a nitrification inhibitor, dicyandiamide (DCD), on nitrifiation and microbial biomass in a grazed pasture soil[J]. Soil Research, 2005, 42(8): 927–932.
  • [1] 呼娟娟陶瑞褚贵新 . 有机无机肥配合生化抑制剂抑制土壤有机碳的转化. 植物营养与肥料学报, 2020, 26(1): 19-31. doi: 10.11674/zwyf.19031
    [2] 崔磊李东坡武志杰李学红肖富容李永华闫增辉郑野张金明崔永坤高波 . 用于黑土的稳定性氯化铵的适宜硝化抑制剂和氮肥增效剂组合. 植物营养与肥料学报, 2019, 25(12): 2178-2188. doi: 10.11674/zwyf.19298
    [3] 油伦成李东坡崔磊武志杰李学红肖富容李永华闫增辉郑野张金明高波崔永坤 . 不同硝化抑制剂组合对铵态氮在黑土和褐土中转化的影响. 植物营养与肥料学报, 2019, 25(12): 2113-2121. doi: 10.11674/zwyf.19338
    [4] 李双双陈晨段鹏鹏许欣熊正琴 . 生物质炭对酸性菜地土壤N2O排放及相关功能基因丰度的影响. 植物营养与肥料学报, 2018, 24(2): 414-423. doi: 10.11674/zwyf.17272
    [5] 董强吴得峰党廷辉郭胜利 . 黄土高原南部不同减氮模式对春玉米产量及土壤硝态氮残留的影响. 植物营养与肥料学报, 2017, 23(4): 856-863. doi: 10.11674/zwyf.16484
    [6] 毕智超张浩轩房歌郭澍熊正琴 . 不同配比有机无机肥料对菜地N2O排放的影响. 植物营养与肥料学报, 2017, 23(1): 154-161. doi: 10.11674/zwyf.16119
    [7] 宋燕燕赵秀娟张淑香白中科龙怀玉岳继生赵来明 . 水肥一体化配合硝化/脲酶抑制剂实现油菜减氮增效研究. 植物营养与肥料学报, 2017, 23(3): 632-640. doi: 10.11674/zwyf.16162
    [8] 魏珊珊王艳群李迎春舒晓晓彭正萍石新丽门明新 . 土壤N2O排放量和小麦、玉米效益俱佳的吡啶喷涂尿素适宜用量研究. 植物营养与肥料学报, 2017, 23(1): 231-237. doi: 10.11674/zwyf.16070
    [9] 王雪薇刘涛褚贵新 . 三种硝化抑制剂抑制土壤硝化作用比较及用量研究. 植物营养与肥料学报, 2017, 23(1): 54-61. doi: 10.11674/zwyf.16126
    [10] 吴得峰姜继韶高兵刘燕王蕊王志齐党廷辉郭胜利巨晓棠 . 添加DCD对雨养区春玉米产量、 氧化亚氮排放及硝态氮残留的影响. 植物营养与肥料学报, 2016, 22(1): 30-39. doi: 10.11674/zwyf.14556
    [11] 刘敏张翀何彦芳高兵苏芳江荣风巨晓棠 . 追氮方式对夏玉米土壤N2O和NH3排放的影响. 植物营养与肥料学报, 2016, 22(1): 19-29. doi: 10.11674/zwyf.15108
    [12] 王斌万运帆郭晨李玉娥秦晓波任涛赵婧 . 控释尿素、稳定性尿素和配施菌剂尿素提高双季稻产量和氮素利用率的效应比较. 植物营养与肥料学报, 2015, 21(5): 1104-1112. doi: 10.11674/zwyf.2015.0502
    [13] 苏朋傅昱何艳徐建明吴建军吴良欢 . 控温条件下秸秆腐解过程中黄泥田氮素转化及酸度对水肥耦合的应答. 植物营养与肥料学报, 2014, 20(6): 1431-1440. doi: 10.11674/zwyf.2014.0613
    [14] 陈雪双刘娟*姜培坤周国模李永夫吴家森 . 施肥对山核桃林地土壤N2O排放的影响. 植物营养与肥料学报, 2014, 20(5): 1263-1271. doi: 10.11674/zwyf.2014.0523
    [15] 张文学孙刚何萍梁国庆王秀斌刘光荣周卫 . 脲酶抑制剂与硝化抑制剂对稻田氨挥发的影响. 植物营养与肥料学报, 2013, 19(6): 1411-1419. doi: 10.11674/zwyf.2013.0615
    [16] 郝小雨高伟王玉军金继运黄绍文唐继伟张志强 . 有机无机肥料配合施用对设施菜田土壤N2O排放的影响. 植物营养与肥料学报, 2012, 18(5): 1075-1088. doi: 10.11674/zwyf.2012.12038
    [17] 李莉李东坡武志杰张丽莉张玉兰聂彦霞 . 脲酶/硝化抑制剂对尿素氮在白浆土中转化的影响. 植物营养与肥料学报, 2011, 17(3): 646-650. doi: 10.11674/zwyf.2011.0347
    [18] 梁国庆周卫夏文建王秀斌孙静文李双来胡诚陈云峰 . 优化施氮下稻-麦轮作体系土壤N2O排放研究 . 植物营养与肥料学报, 2010, 16(2): 304-311. doi: 10.11674/zwyf.2010.0207
    [19] 王改玲郝明德陈德立 . 秸秆还田对灌溉玉米田土壤反硝化及N2O排放的影响. 植物营养与肥料学报, 2006, 12(6): 840-844. doi: 10.11674/zwyf.2006.0614
    [20] 王改玲郝明德陈德立 . 硝化抑制剂和通气调节对土壤N2O排放的影响. 植物营养与肥料学报, 2006, 12(1): 32-36. doi: 10.11674/zwyf.2006.0106
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-08-30
  • 网络出版日期:  2019-12-20
  • 刊出日期:  2019-12-01

硝化抑制剂对稻田土壤N2O排放和硝化、反硝化菌数量的影响

    作者简介:李杰E-mail:jieli@iae.ac.cn
  • 1. 中国科学院沈阳应用生态研究所,辽宁沈阳 110016
  • 2. 吉林农业大学资源与环境学院,吉林长春 130033
  • 基金项目: 国家重点研发计划项目(2018YFD0200200,2017YFD0200708);国家自然科学基金项目(41807107)。
  • 摘要: 【目的】本研究旨在明确硝化抑制剂对稻田土壤氮素周转的影响,探讨抑制剂提高氮肥利用率及微生物响应机理。【方法】以草甸黑土发育的水稻土为研究对象,进行了两组培养试验 (25℃),培养周期均为150天。共设4个处理:1) 不施肥 (CK);2) 单施尿素 (Urea);3) 尿素 + 双氰胺 (Urea + DCD);4) 尿素 + 3, 4-二甲基吡唑磷酸盐 (Urea + DMPP)。一组试验从培养第1天起,抽取气体样品,用气相色谱法测定N2O排放量。另一组试验从培养第1天直到结束,取土样测定氨氧化细菌和氨氧化古菌数量,采用荧光定量PCR等技术测定nirK基因和nirS基因拷贝数,用常规方法测定土壤无机氮含量。【结果】施用尿素显著增加了N2O排放量,其中85%的N2O排放发生在培养开始后的前两周内。Urea + DMPP处理土壤NH4+浓度在前23天稳定在较高水平,与Urea处理相比,N2O减排率为78.3%,Urea + DCD处理为21.6%。Urea + DMPP处理排放系数为0.05%,Urea + DCD为0.18%,Urea + DMPP处理显著低于Urea + DCD处理。施用尿素培养,土壤氨氧化细菌 (AOB) 数量显著增加而氨氧化古菌 (AOA) 数量则显著减少。添加DCD和DMPP能显著抑制AOB的数量,但对AOA没有影响。培养第3、30和90天,Urea + DMPP处理土壤中的AOB数量显著低于Urea + DCD处理的30%、56%和60%。对于反硝化细菌来说,所有处理中的nirK基因拷贝数均显著高于nirS基因拷贝数。添加DMPP在培养第3和30天显著减少了含nirKnirS基因的反硝化细菌数量,而添加DCD对两类反硝化细菌数量无明显作用。【结论】东北黑土水稻生产中,硝化抑制剂DMPP降低N2O排放量和排放系数的效果显著好于DCD,因为DMPP在培养后的30天内,可以显著抑制氨氧化细菌繁衍,降低反硝化细菌数量,从而起到减少N2O排放、提高肥料利用率的作用。

    English Abstract

    • 水稻是世界上主要的粮食作物,是50%人口的主要口粮。据统计,2017年我国水稻播种面积为3020万hm2 (4.53亿亩),约占全国粮食播种总面积的26.1%[1]。提高水稻综合生产能力,是保障我国粮食安全的长期战略目标。氧化亚氮 (N2O) 是导致全球气候变暖的重要温室气体之一[2]。虽然大气中N2O的浓度远低于二氧化碳 (CO2),但其增温潜势却是CO2的296倍[3]。为了获得水稻高产,中国农田化肥的投入量在持续增加。淹水种植条件下的稻田土壤利于反硝化作用的发生,导致N2O的产生和排放。研究结果显示我国水稻田N2O排放量约占农田总排放量的22%,被认为是大气中N2O的重要排放源之一[4]。因此,减少稻田温室气体排放已成为农业排放源中的研究热点。

      目前,为了提高肥料利用率和保护稻田生态环境,人们通过在肥料中添加硝化抑制剂来减少氮素损失。市场化的硝化抑制剂主要有两种,双氰胺 (DCD) 和3, 4-二甲基吡唑磷酸盐 (DMPP)。DCD和DMPP的作用机理不同,DCD主要通过干扰AOB对底物的利用来影响硝化作用,而DMPP则通过引起亲核取代活性和降低相邻N的pKa来影响硝化作用[5]。大量研究表明DCD和DMPP在不同类型农田和草地土壤中均能很好地抑制硝化作用过程,减少N2O排放和硝酸盐淋溶[5-7]。但是,目前硝化抑制剂在长期淹水条件下的北方水稻黑土中对硝化作用影响和作用机理的研究尚不多见。因此,评估硝化抑制剂对水稻土壤的硝化抑制效果,对于减少温室气体排放和硝酸盐淋溶,实现氮肥的高效利用具有重要的意义。

      本研究以寒地黑土区水稻土为研究对象,通过分子生物学手段探讨氮肥在土壤中的转化过程,硝化抑制剂DCD和DMPP对氮素循环关键功能微生物的抑制效果及其与氮素转化动态的联系机制。从而为水稻生产中氮肥合理施用,评估硝化抑制剂在北方水稻黑土上的应用效果和提高氮肥利用效率提供理论依据。

      • 试验土壤采自黑龙江省方正县水稻科技园区 (116°23′E、39°54′N) 的水稻土。土壤类型为草甸黑土,土壤有机质25.8 g/kg、碱解氮187.56 mg/kg、有效磷23.6 mg/kg、速效钾213 mg/kg,pH为6.1。土壤采集时间为2018年10月30日。将鲜土采回实验室后,剔除残留根系,过2 mm筛,25℃培养箱中预培养两周待用 (将土壤放入培养容器中,不做任何处理,用以恢复土壤微生物活性)。供试氮肥为分析纯试剂尿素,硝化抑制剂双氰胺 (DCD) 和3, 4-二甲基吡唑磷酸盐 (DMPP) 均为分析纯,纯度分别为99.5%和97%。

      • 采用室内培养方法,尿素施用量为N 0.8 g/kg干土,DCD与DMPP添加量为尿素纯氮量的2%和0.5%。设置如下4个处理:对照 (CK);单施尿素处理 (Urea);尿素 + DCD (Urea + DCD);尿素 + DMPP (Urea + DMPP)。

        试验分为两部分。一部分土壤采用300 mL培养瓶装土,每瓶装100 g风干土 (过2 mm筛),调节水分至淹水条件,使土面上保持2~3 cm的水层 (在整个培养时期)。将尿素和硝化抑制剂均匀施入到相应处理的土壤中,透气膜封口后25℃下恒温恒湿培养,每个处理4次重复。于培养的第1、2、3、4、5、6、7、9、11、13、20、27、34、41、48、55、62、69、76、83、90、100、122、137、150天采集气体样品。另外一部分土壤采用植物培养皿装土,培养方法和条件同上。分别于1、3、5、9、16、23、30、37、44、59、73、90、100、122、150天破坏性采样。土壤样品一式两份保存,一份于–80℃保存,用于分子微生物分析;另一份于–20℃保存,用于速效氮测定。

      • 测定瓶内N2O含量时,先用空气泵置换瓶内空气,待空气置换干净后,用带有不锈钢针头的橡胶塞封口,针头处连接三通阀。25℃下密闭培养5 h后用注射器抽取35 mL瓶内气体,用安捷伦气象色谱仪 (GC-7890A) 自动进样并测定N2O含量。检测器为电子捕获器ECD,计算机程序控制1 mL定量管和十通阀自动进样,载气为高纯氮。分离柱温度、进样口温度和检测器温度分别为60℃、100℃和330℃。采样结束后用空气泵置换瓶内气体,以透气膜封口,置于25℃培养箱中培养,定期采样。

        根据公式F = △m/ (W × △t) = ρ × V × △C/ (W × △t) 计算N2O排放通量。式中:F为N2O排放通量;△t是密闭培养时间;△m和△C分别为△t时间内培养瓶中增加或减少的气体质量和混合比浓度;V和W分别是培养瓶内有效空间的体积和土样重量;ρ为标况下气体密度。

        累积N2O排放量计算方法:用两次连续测量的N2O排放速率的均值乘以两次测量时期间隔的时间,最后累计相加[7-8]。N2O排放系数的计算公式为:N2O排放系数 (EF,%) = 施肥增加的土壤N2O排放总量 (N kg/hm2) / 施氮量 (kg/hm2) × 100。

        硝化抑制剂对N2O排放的减排率计算公式为:硝化抑制剂对N2O减排率 (%) = (添加硝化抑制剂处理N2O排放量–单施尿素处理N2O排放量) /单施尿素处理N2O排放量 × 100。

      • 土壤pH采用pH计测定 (水土比2.5∶1);铵态氮 (NH4+-N) 和硝态氮 (NO3--N) 含量采用2 mol/L KCl浸提 (水土比5∶1),流动分析仪测定 (Auto AnalyzerIII,BRAN+LUEBBE,Germany);碱解氮采用碱解扩散法;有效磷采用NaHCO3浸提—分光光度计比色法;速效钾采用醋酸铵浸提—火焰光度计法测定。

      • 土壤总DNA采用MoBio PowersoilTM DNA试剂盒 (San Diego,CA,USA) 提取,方法参照试剂盒说明书。用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测所提DNA片段大小,并用NanoDrop核酸蛋白测定仪 (ND-1000) 测定DNA的浓度及质量[9]

        Real-time PCR检测:

        1) 引物 定量PCR的目标基因为总细菌16S rRNA基因;硝化过程相关基因为AOA amoA和AOB amoA,用二者的拷贝数分别表示AOA和AOB的数量;反硝化过程相关基因为nirKnirS。目标基因的引物、出处、序列见表1。引物由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。

        表 1  定量PCR所用引物及PCR条件

        Table 1.  Primers and conditions for RT-PCR

        目标基因 Target gene引物 Primer引物序列5′–3′ Primer sequence退火温度 Anneal temperature (°C)参考文献 Reference
        AOB amoAAmoA-1FGGGGTTTCTACTGGTGGT60[10]
        AmoA-2RCCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC60
        AOA amoAamoAFSTAATGGTCTGGCTTAGACG60[11]
        amoARGCGGCCATCCATCTGTATGT60
        nirKnirK 1FGGMATGGTKCCSTGGCA55[12]
        nirK 5RGCCTCGATCAGRTTRTGGTT55
        nirSnirS cd3aFGTSAACGTSAAGGARACSGG55[13]
        nirS R3cdGASTTCGGRTGSGTCTTGA55

        2) 反应体系 amoA:5 ng DNA模板,上下游引物各100 nM,5 μL 2X SYBR® Premix Ex TaqTM (Takara,日本),双蒸水补至10 μL。nirK:2.5 ng DNA模板,上下游引物各150 nM,5 μL 2 × SYBR® Premix Ex TaqTM (Takara日本),双蒸水补至10 μL。16s rRNA基因:2.5 ng DNA模板,上下游引物各150 nmol/L,1 μL of 10 × 反应缓冲液,0.8 μL dNTPs (10 μmol/L),0.25 μL 10 × SYBR® Premix Ex TaqTM (Takara日本),0.5 U of HS Taq酶,双蒸水补至10 μL。

        3) PCR扩增程序 95℃预变性3 min;并在94℃变性30 s,60℃(退火温度视目标基因而定,见表1) 30 s,72℃延伸30 s,共35个循环,72℃修复延伸8 min。PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。

        4) 标准曲线制备 分别构建细菌16s rRNA、amoAnirK基因的质粒标准曲线,标准曲线的范围在102~108[14]。扩增效率和拷贝数通过下列公式计算:

      • 数据采用SPSS 16.0中单因素方差分析 (ANOVA) 的Duncan检验进行差异显著性 (P < 0.05) 检验。用Sigmaplot 13.0软件作图[15]

      • 与对照相比,施肥处理铵态氮和硝态氮含量均显著增加,并分别在第3天和第16天达到最大值 (图1)。铵态氮在培养后的第23天左右降低至对照水平。在培养前23天内,与单施尿素处理相比,添加硝化抑制剂处理保持了较高的NH4+浓度。说明添加的硝化抑制剂DCD和DMPP均延缓了氨氧化过程,减缓了NH4+向NO3的转化。与添加DCD的处理相比,添加DMPP处理的硝态氮浓度可在更长的培养时间内保持最低水平。

        图  1  添加不同硝化抑制剂土壤N2O排放通量、NH4+-N和NO3-N含量的变化

        Figure 1.  Variation of N2O emission, NH4+-N and NO3-N contents in soils added with different nitrification inhibitors

      • 研究结果显示,在尿素施用后,各施肥处理N2O排放迅速增加,在第4天时均达到峰值后快速下降。从图1可以看出,N2O排放主要集中在施肥后的前两周内。添加DMPP处理排放系数为0.05%,添加DCD处理为0.18%,添加DMPP显著低于添加DCD。添加硝化抑制剂DCD和DMPP均显著减少了N2O排放峰值和累积排放量,其减排率分别达到21.6%和78.3% (图1表2)。

        表 2  添加不同抑制剂土壤N2O排放总量和排放系数

        Table 2.  Total N2O emissions and emission factors in soils added with different nitrification inhibitors

        处理
        Treatment
        N2O排放总量 (N2O-N kg/hm2)
        Total N2O emission
        减排率 (%)
        Emission reduction rate
        排放系数 (%)
        Emission factor
        CK1.0 d
        Urea41.2 a0.23 a
        Urea+ DCD32.3 b21.60.18 b
        Urea+DMPP8.9 c78.30.05 c
        注(Note):同列数据后不同小写字母表示施肥处理间差异显著 (P < 0.05) Values followed by different small letters indicate significant difference among the treatments (P < 0.05).
      • 图2显示,与CK相比,培养3天时,含尿素处理土壤AOB数量均显著增加;与单施尿素处理相比,培养3天时尿素+DCD处理土壤的AOB数量显著减少32.4%,但在培养30天时的AOB数量与单施尿素处理相当,培养90天时,AOB数量显著高于单施尿素处理。尿素+DMPP处理在培养第3、30和90天时,土壤中的AOB数量显著低于尿素+DCD处理。与单施尿素相比,尿素+DMPP处理对AOB数量的抑制率可达35%~58% (P < 0.05)。土壤AOA对施肥的响应与AOB相反。在整个培养期间,施加尿素的AOA数量并没有增加,反而显著减少。尿素+DMPP处理在培养前期能显著减少AOA amoA基因拷贝数,培养后期无显著抑制作用;而尿素+DCD处理AOA没有显著变化。

        图  2  硝化抑制剂对氨氧化细菌和氨氧化古菌丰度的影响

        Figure 2.  Effect of nitrification inhibitors on abundance of AOB amoA (a) and AOA amoA gene (b)

      • 与对照相比,施肥处理能够显著增加nirKnirS基因拷贝数 (图3),nirK基因拷贝数为nirS基因拷贝数的4.5~11.3倍。与单施尿素处理相比,尿素+DMPP处理在培养第3天和第30天nirSnirK基因拷贝数均显著减少,DMPP在一定程度上影响了反硝化作用;DCD处理对nirSnirK数量无显著抑制。

        图  3  添加不同硝化抑制剂土壤中的反硝化基因nirSnirK基因拷贝数

        Figure 3.  Abundance of nirS and nirK gene in soils added with different nitrification inhibitors

      • 本研究中所有施肥处理的N2O排放均主要发生在前两周,且在第4天时达到峰值,与前人[16-17]研究结果一致。尿素添加DCD和DMPP均能较长时间保持高含量的铵态氮,减缓硝酸盐的生成,从而实现N2O的减排。这说明硝化抑制剂DCD和DMPP可抑制水稻土壤中NH4+向NO3的转化,减缓硝化作用过程,进而减少温室气体N2O的排放。尽管DMPP施用量是DCD的四分之一,但其对硝化作用的抑制效果要远远好于DCD。这可能是由于DMPP相对于DCD具有降解速度慢[17]、吸附力强等特点[17],使其在土壤中硝化抑制效果可以保持更长久并且不易与NH4+分离[18],也可能与不同硝化抑制剂的结构及作用机理有关[19]

        本试验结果表明,由于尿素水解后形成了氨,为氨氧化细菌提供了可以利用的底物,施用尿素显著刺激了氨氧化细菌 (AOB) 的生长[20],但在培养第90天时,AOB数量显著下降,可能是因为培养前期土壤中氨氧化细菌的快速生长消耗除铵外的其他营养物质,抑制了后期氨氧化细菌的继续生长。此外,土壤中铵根离子在培养后期的大量减少也可能是造成氨氧化细菌数量下降的原因之一。与氨氧化细菌相反,氨氧化古菌 (AOA) 在施用尿素后,其数量不但没有增加,反而显著减少,说明AOB在土壤氨氧化过程中起主要作用。

        本试验中,尿素与硝化抑制剂DCD和DMPP配施显著抑制了AOB的生长,但未对AOA有显著影响。Di等[20]研究也发现,添加DCD能显著减少土壤中AOB的数量,而AOA在牧场土壤中的数量在整个培养期间无显著变化。Li等[21]通过田间试验也发现与单施尿素相比,DMPP混施尿素处理能显著减少AOB数量,并且在两年时间内可使稻田AOB数量减少24.5%~30.9%。以上研究结果均表明,水稻土中的AOB对硝化抑制剂非常敏感,而AOA对硝化抑制剂DCD和DMPP的耐受性要好于AOB,这可能与二者不同的生理特性有关[22-23],也与硝化抑制剂的作用机理有关。硝化抑制剂主要通过抑制AOB繁殖来减缓硝化作用[2024]。通过比较硝化抑制剂DCD和DMPP对AOB数量抑制的程度,可以发现DMPP抑制AOB生长的时间和程度均明显好于DCD。这与DMPP减少N2O排放和NO3浓度的作用以及延缓NH4+氧化的作用均远远好于DCD的研究结果相吻合。

        NO3 经NH4+氧化生成后可通过土壤反硝化过程产生N2O[25]。对于水稻土,生成的较高硝酸盐和淹水条件使得大量N2O通过土壤反硝化作用排放。反硝化过程的限速步骤主要由含nirK或含nirS基因的反硝化细菌参与完成[26]。本研究中,在所有处理中nirK基因拷贝数均显著高于nirS基因拷贝数,说明含nirK基因的反硝化细菌在反硝化作用中贡献可能大于含nirS基因的反硝化细菌。其他研究者在农田和稻田土壤也发现了相似的结果[27-29]。添加DMPP在施肥前期 (施肥后第3和30天) 显著减少了nirSnirK基因拷贝数,后期抑制作用有减缓的趋势。而DCD对nirSnirK基因拷贝数在整个试验期间无明显影响。这种差异可能是由于DCD相对于DMPP对硝化过程有较弱的抑制作用,使得NO3生成较快,大量的NO3为含nirK或含nirS基因的反硝化细菌提供了底物,进而使得DCD相对于DMPP对反硝化细菌的抑制效果并不明显[30]

      • 1) 硝化抑制剂DCD和DMPP显著抑制氨氧化细菌数量,但对氨氧化古菌没有影响,并且DMPP对氨氧化细菌的抑制效果要好于DCD。

        2) 施用硝化抑制剂DMPP能显著减少含nirSnirK基因的反硝化细菌数量,从而延缓NH4+氧化,而DCD对其无明显影响。

        3) DMPP减排N2O的效果好于DCD,供试条件下,二者的减排率分别为21.6%和78.3%。

    参考文献 (30)

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