• ISSN 1008-505X
  • CN 11-3996/S

留言板

尊敬的读者、作者、审稿人, 关于本刊的投稿、审稿、编辑和出版的任何问题, 您可以本页添加留言。我们将尽快给您答复。谢谢您的支持!

姓名
邮箱
手机号码
标题
留言内容
验证码

小麦钾离子通道蛋白基因TaPC1介导植株抵御低钾逆境功能研究

师新新 张佳祺 张雨萌 王妮 马金荣 肖凯

引用本文:
Citation:

小麦钾离子通道蛋白基因TaPC1介导植株抵御低钾逆境功能研究

    作者简介: 师新新 E-mail:15830955831@163.com;
    通讯作者: 肖凯, E-mail:xiaokai@hebau.edu.cn
  • 基金项目: 高校大学生创新创业训练计划项目(201910086009);国家重点科技研发计划粮食丰产科技工程项目(2017YFD0300902)。

Functional characterization on the wheat potassium channel gene TaPC1 in mediating plant adaptation to potassium deprivation

    Corresponding author: XIAO Kai, E-mail:xiaokai@hebau.edu.cn
  • 摘要:   【目的】  钾离子通道 (potassium channel, PC) 蛋白通过介导离子跨膜转运,增强低钾胁迫下植株对钾素的吸收和利用能力。本研究以采用RNAseq鉴定小麦应答低钾基因获得的PC家族基因TaPC1为对象,对该基因分子特征、应答低钾表达模式及其介导植株抵御低钾逆境的能力进行研究。  【方法】  采用生物信息学工具分析TaPC1分子特征,采用溶液培养法培养丰钾 (K2O 6 mmol/L )、低钾 (K2O 0.06 mmol/L) 处理小麦和转化株系幼苗,采用 DNA 重组技术构建TaPC1亚细胞定位和表达质粒,利用农杆菌介导法遗传转化烟草。采用常规植株形态、生理和qPCR方法测定植株生长、生理指标和基因表达。  【结果】  TaPC1与植物种属PC家族基因具有较高的同源性,该基因编码蛋白具有植物种属PC蛋白跨膜域保守特征,翻译蛋白经内质网分选后定位于细胞质膜。低钾 (0.06 mmol/L) 处理下,根、叶中TaPC1表达增强;将低钾处理植株转入丰钾 (6 mmol/L) 营养液进行恢复处理后,根、叶中该基因表达下调,表明TaPC1呈低钾应答表达模式。基因遗传转化结果表明,与野生型 (WT) 对照相比,低钾处理下,超表达TaPC1烟草株系植株干物质积累量增多,细胞活性氧累积量减少,细胞保护酶 (SOD、CAT和POD) 活性提高,丙二醛含量降低。基因表达分析表明,低钾处理下,转化株系内细胞保护酶编码基因NtSOD1NtCAT1;1NtPOD1;2NtPOD1;6的转录本丰度较野生型 (WT) 显著增多,表明上述基因通过增强表达,在改善转化株系低钾处理下细胞活性氧稳态中发挥重要作用。此外,与WT相比,低钾处理下转化株系的钾累积量显著增多,光合碳同化能力增强。  【结论】  TaPC1呈低钾胁迫增强表达模式,上调表达该基因能显著增强植株钾素吸收,有效维持低钾逆境下的细胞活性氧稳态特征,在改善植株光合物质生产和抵御低钾逆境能力中发挥重要作用。
  • 图 1  TaPC1与植物种属同源基因的系统进化特征

    Figure 1.  Phylogenetic relations among TaPC1 and its homologous genes in plant species

    图 2  根叶中TaPC1应答低钾逆境表达模式

    Figure 2.  Expression patterns of TaPC1 in roots and leaves under K-deficient stress

    图 3  TaPC1亚细胞定位及丰、低钾处理下转化株系长势和干物质量

    Figure 3.  The subcellular location as well as the growth phenotype and dry weight of the transgenic lines under K-sufficient and K-deficient treatments

    图 4  丰钾和低钾处理下转化株系和对照植株的细胞保护酶活性和丙二醛含量

    Figure 4.  Cellular antioxidant enzyme activities and MDA contents of the transgenic lines and wild type under K-sufficient and K-deficient treatments

    图 5  低钾处理下转化株系和对照植株细胞保护酶家族基因表达模式

    Figure 5.  Expression patterns of genes encoding the cellular antioxidant enzymes in transgenic lines and wild typeunder K-deficient treatment

    图 6  丰、低钾处理下转化株系和对照植株含钾量和钾累积量

    Figure 6.  K contents and accumulative amounts in transgenic lines and wild type under K-sufficient and K-deficient treatments

    图 7  丰钾、低钾处理下转化株系和对照光合参数

    Figure 7.  Photosynthetic parameters of transgenic lines and wild type under K-sufficient and K-deficient treatments

    表 1  烟草抗氧化酶基因及扩增引物

    Table 1.  qPCR primers for amplification of antioxidant enzyme genes in N. tabacum

    基因 Gene登录号 Accession number正向引物 Forward primer (5′—3′)反向引物 Reverse primer (5′—3′)
    NtMnSOD1X14482TTGGGCTATCGACACTAACTTTTCAGCCAGCGACTACATGCA
    NtMnSOD2AB093097GACGGACCTTAGCAACAGGGACCAATGGGTCCTGATTAGCAG
    NtSOD1KJ874395GTGGACATGTCGTGTCAAGGTTCTCACCAACTCCTGCACTT
    NtSOD2EU123521ATGTCACGGGACCACATTACAACCCTTCCACCAGCATTTC
    NtFeSODKF724056CATCACAGAGCTTATGTCGACACTAGAACTGACTGCTTCCCA
    NtCATEF532799CAAGGATCTCTACGACTCGATTCTTGAGGGCAAATAATCCACCT
    NtCAT1NTU07627GTCTCAGGCTGACAAGTCTTACGGAAGACAGAGTAGCAGC
    NtCAT3HF564633GTCTTGGGCCAAACTATCTGCATCAGCTTCACATTGTGGGCC
    NtCAT1;1NTU93244TCCTGCTAATGCTCCAAAGTGTAATGCATATGTATTAGGAATGCTC
    NtCAT1;2HF564632GGTATCGACTTGGACCAAACTAGGTCTCACATTAAGCCTAGAAG
    NtCAT1;3HF564631TTGCAGCCGGTGGGAAGATTGGTCTCACATTAAGCCTAGAAG
    NtPOD1;1L02124GGAATTTGTCCTCAAGGTGGAACTTATTGGAATTGCCATTTCAGC
    NtPOD1;2AB044154CTGACATGGTCTGTGCCTACTCAGTTGATAGCAGAGCAAACTT
    NtPOD1;3AB044153AAGATCTTGTCGCTCTTACTGGAATTGGATTTTCCAGCTTGCG
    NtPOD1;4D11396TGCTGGTAGTCAAAGTCAGTTTTCCCATGTTGAACACGTTCTTACC
    NtPOD1;5AB178953AACAGCAACAACGTTAACCCAGCTTAATTTTGGACCACATTCAGGA
    NtPOD1;6AB027753TCAACTCCACTGGTGGCCCTAATTCGATTTTGCAGCTTGCGC
    NtPOD1;7AB027752GCCCAAGAAGTTCAGGCTCAATACAAATACAGTCCTTTACTCG
    NtPOD2;1AB178954AGGGGAAAAGACCTCACCACAGTTTCCCATCTTGATCATAGCA
    NtPOD2;2KF701483AGACAGTGAGTATGCAGCTAAAAAAAAGCTGCCCTTGGCACC
    NtPOD4AY032675AGACTCAAAGATAGCAAACCTCACTTCCTGATGTCACCCTTGA
    NtPOD9AY032674CACCACCTTCATTCAACGCTAACATCTCAGACAAAACACTTGTC
    NttubulinU91563TACACAGGGGAAGGAATGGCTCGAAACCAACGGTATC
    下载: 导出CSV
  • [1] Maathuis F J M. Physiological functions of mineral macronutrients[J]. Current Opinion in Plant Biology, 2009, 12(3): 250–258. doi:  10.1016/j.pbi.2009.04.003
    [2] Lagarde D, Basset M, Lepetit M, et al. Tissue-specific expression of Arabidopsis AKT1 gene is consistent with a role in K+ nutrition[J]. Plant Journal, 1996(2), 9: 195–203. doi:  10.1046/j.1365-313X.1996.09020195.x
    [3] Lebaudy A, Hosy E, Simonneau T, et al. Heteromeric K+ channels in plants[J]. Plant Journal, 2008, 54(6): 1076–1082. doi:  10.1111/j.1365-313X.2008.03479.x
    [4] Wang Y, Wu W H. Potassium transport and signaling in higher plants[J]. Annual Review of Plant Biology, 2013, 64(1): 451–476. doi:  10.1146/annurev-arplant-050312-120153
    [5] Hirsch R E, Lewis B D, Spalding E P, et al. A role for the AKT1 potassium channel in plant nutrition[J]. Science, 1998, 280(5365): 918–921. doi:  10.1126/science.280.5365.918
    [6] Spalding E P, Hirsch R E, Lewis D R, et al. Potassium uptake supporting plant growth in the absence of AKT1 channel activity: inhibition by ammonium and stimulation by sodium[J]. The Journal of General Physiology, 1999, 113(6): 909–918. doi:  10.1085/jgp.113.6.909
    [7] Ivashikina N, Becker D, Ache P, et al. K+ channel profile and electrical properties of Arabidopsis root hairs[J]. FEBS Letters, 2001, 508(3): 463–469. doi:  10.1016/S0014-5793(01)03114-3
    [8] Xu J, Li H D, Chen L Q, et al. A protein kinase, interacting with two calcineurin B-like proteins, regulates K+ transporter AKT1 in Arabidopsis[J]. Cell, 2006, 125(7): 1347–1360. doi:  10.1016/j.cell.2006.06.011
    [9] Guo C, Zhao X, Liu X, et al. Function of wheat phosphate transporter gene TaPHT2;1 in Pi translocation and plant growth regulation under replete and limited Pi supply conditions[J]. Planta, 2013, 237: 1163–1178. doi:  10.1007/s00425-012-1836-2
    [10] Sun Z, Ding C, Li X, et al. Molecular characterization and expression analysis of TaZFP15, a C2H2-type zinc finger transcription factor gene in wheat (Triticum aestivum L.)[J]. Journal of Integrative Agriculture, 2012, 11(1): 31–42. doi:  10.1016/S1671-2927(12)60780-9
    [11] Gao S, Guo C, Zhang Y, et al. Wheat microRNA member TaMIR444a is nitrogen deprivation-responsive and involves plant adaptation to the nitrogen-starvation stress[J]. Plant Molecular Biology Reporter, 2016, 34(5): 931–946. doi:  10.1007/s11105-016-0973-3
    [12] Liu Z, Zhao Y, Wang X, et al. TaNBP1, a guanine nucleotide-binding subunit gene of wheat, is essential in the regulation of N starvation adaptation via modulating N acquisition and ROS homeostasis[J]. BMC Plant Biology, 2018, 18(1): 167. doi:  10.1186/s12870-018-1374-6
    [13] Guo C, Chang W, Zhang L, et al. Effects of choromosome substitution on the utilization efficiency of nitrogen, phosphorus, and potassium in wheat[J]. Frontiers of Agriculture in China, 2011, 5(3): 253–261. doi:  10.1007/s11703-011-1069-3
    [14] Mäser P, Thomine S, Schroeder J I, et al. Phylogenetic relationships within cation transporter families of Arabidopsis[J]. Plant Physiology, 2001, 126(4): 1646–1667. doi:  10.1104/pp.126.4.1646
    [15] Gierth M, Mäser P, Schroeder J I. The potassium transporter AtHAK5 functions in K+ deprivation-induced high-affinity K+ uptake and AKT1 K+ channel contribution to K+ uptake kinetics in Arabidopsis roots[J]. Plant Physiology, 2005, 137(3): 1105–1114. doi:  10.1104/pp.104.057216
    [16] Siddiqi M Y, Glass A D M, Ruth T J, et al. Studies of the uptake of nitrate in barley. I. Kinetics of nitrogen-13-labeled nitrate influx[J]. Plant Physiology, 1990, 93(4): 1426–1432. doi:  10.1104/pp.93.4.1426
    [17] Maathuis F J M, Sanders D. Regulation of K+ absorption in plant root cells by external K+: interplay of different plasma membrane K+ transporters[J]. Journal of Experimental Botany, 1997, 48(S): 451–458. doi:  10.1093/jxb/48.Special_Issue.451
    [18] Véry A A, Nieves-Cordones M, Daly M, et al. Molecular biology of K+ transport across the plant cell membrane: what do we learn from comparison between plant species?[J]. Journal of Plant Physiology, 2014, 171(9): 748–769. doi:  10.1016/j.jplph.2014.01.011
    [19] Huang X, Wang W, Zhang Q, Liu J. A basic helix-loop-helix transcription factor, PtrbHLH, of Poncirus trifoliata confers cold tolerance and modulates peroxidase-mediated scavenging of hydrogen peroxide[J]. Plant Physiology, 2013, 162(2): 1178–1194. doi:  10.1104/pp.112.210740
    [20] Gill S S, Tuteja N. Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants[J]. Plant Physiology and Biochemistry, 2010, 48(12): 909–930. doi:  10.1016/j.plaphy.2010.08.016
    [21] Nourimand M, Todd C D. Allantoin increases cadmium tolerance in Arabidopsis via activation of antioxidant mechanisms[J]. Plant Cell and Physiology, 2016, 57(12): 2485–2496. doi:  10.1093/pcp/pcw162
    [22] Distelbarth H, Nägele T, Heyer A G. Responses of antioxidant enzymes to cold and high light are not correlated to freezing tolerance in natural accessions of Arabidopsis thaliana[J]. Plant Biolology, 2013, 15(6): 982–990. doi:  10.1111/j.1438-8677.2012.00718.x
    [23] Uzilday B, Turkan I, Sekmen A H, et al. Comparison of ROS formation and antioxidant enzymes in Cleome gynandra (C4) and Cleome spinosa (C3) under drought stress[J]. Plant Science, 2012, 182: 59–70. doi:  10.1016/j.plantsci.2011.03.015
    [24] Ragel P, Ródenas R, García-Martín E, et al. The CBL-interacting protein kinase CIPK23 regulates HAK5-mediated high-affinity K+ uptake in Arabidopsis roots[J]. Plant Physiology, 2015, 169(4): 2863–2873.
    [25] Scherzer S, Böhm J, Krol E, et al. Calcium sensor kinase activates potassium uptake systems in gland cells of Venus flytraps[J]. Proceeding of National Academy Science of the United States of America, 2015, 112(23): 7309–7314. doi:  10.1073/pnas.1507810112
  • [1] 徐易如赵艳艳孙福来郭营赵岩李斯深孔凡美 . 小麦成熟期产量及钾效率相关性状的全基因组关联分析. 植物营养与肥料学报, 2020, 26(6): 1081-1090. doi: 10.11674/zwyf.19395
    [2] 罗肖艳毕惠惠张旭睿毛培钧王航辉闰永行程西永许海霞 . 小麦耐低钾性状的全基因组关联分析. 植物营养与肥料学报, 2020, 26(3): 401-412. doi: 10.11674/zwyf.19176
    [3] 张艳霞赵艳艳郭营赵岩李斯深孔凡美 . 小麦苗期钾效率相关性状的全基因组关联分析. 植物营养与肥料学报, 2019, 25(5): 699-709. doi: 10.11674/zwyf.18140
    [4] 郭泽李子绅代晓燕王英锋 . 低钾胁迫下外源生长素对烟草根系生长及钾吸收的影响. 植物营养与肥料学报, 2019, 25(7): 1173-1184. doi: 10.11674/zwyf.18321
    [5] 黄明王朝辉罗来超王森曹寒冰何刚刁超朋 . 垄覆沟播及施肥位置优化对旱地小麦氮磷钾吸收利用的影响. 植物营养与肥料学报, 2018, 24(5): 1158-1168. doi: 10.11674/zwyf.17463
    [6] 刘璐王朝辉刁超朋王森李莎莎 . 旱地不同小麦品种产量与干物质及氮磷钾养分需求的关系. 植物营养与肥料学报, 2018, 24(3): 599-608. doi: 10.11674/zwyf.17168
    [7] 杨玉敏张庆玉杨武云田丽雷建容张冀李俊 . 镉胁迫对不同基因型小麦产量及构成因子的影响. 植物营养与肥料学报, 2011, 17(3): 532-538. doi: 10.11674/zwyf.2011.0229
    [8] 李兴涛王伟李晨王晓光赵洪祥曹敏建* . 低钾胁迫下不同低钾耐性大豆光合特性及保护性酶的差异. 植物营养与肥料学报, 2011, 17(2): 384-390. doi: 10.11674/zwyf.2011.0183
    [9] 库文珍彭克勤张雪芹童建华周浩萧浪涛 . 低钾胁迫对水稻苗期矿质营养吸收和植物激素含量的影响 . 植物营养与肥料学报, 2009, 15(1): 69-75. doi: 10.11674/zwyf.2009.0110
    [10] 张建恒李宾兴王斌郭程瑾李雁鸣肖凯 . 低磷条件下不同磷效率小麦品种及其杂种F1光合碳同化特性研究. 植物营养与肥料学报, 2006, 12(2): 169-176. doi: 10.11674/zwyf.2006.0205
    [11] 赵学强介晓磊李有田许仙菊谭金芳化党领 . 不同基因型小麦钾离子吸收动力学分析. 植物营养与肥料学报, 2006, 12(3): 307-312. doi: 10.11674/zwyf.2006.0304
    [12] 韩金玲李雁鸣马春英王文颇 . 施锌对小麦开花后氮、磷、钾、锌积累和运转的影响. 植物营养与肥料学报, 2006, 12(3): 313-320. doi: 10.11674/zwyf.2006.0305
    [13] 杨建立俞雪辉刘强郑绍建 . 铝胁迫对小麦根尖细胞蛋白质及苹果酸分泌的影响. 植物营养与肥料学报, 2005, 11(3): 390-393. doi: 10.11674/zwyf.2005.0318
    [14] 邱慧珍张福锁 . 不同磷效率小麦对低铁胁迫的基因型差异. 植物营养与肥料学报, 2004, 10(4): 361-366. doi: 10.11674/zwyf.2004.0405
    [15] 刘建祥杨肖娥杨玉爱吴良欢 . 低钾胁迫下水稻钾高效基因型若干生长特性和营养特性的研究. 植物营养与肥料学报, 2003, 9(2): 190-195. doi: 10.11674/zwyf.2003.0211
    [16] 邹春琴李振声李继云 . 小麦对钾高效吸收的根系形态学和生理学特征. 植物营养与肥料学报, 2001, 7(1): 36-43. doi: 10.11674/zwyf.2001.0106
    [17] 夏阳林杉陶洪斌张福锁胡恒觉 . 不同基因型小麦对NaCl胁迫的反应. 植物营养与肥料学报, 2000, 6(4): 417-423. doi: 10.11674/zwyf.2000.0409
    [18] 樊小林李玲何文勤尚浩博汪沛洪 . 氮肥、干旱胁迫、基因型差异对冬小麦吸氮量的效应. 植物营养与肥料学报, 1998, 4(2): 131-137. doi: 10.11674/zwyf.1998.0205
    [19] 吴平倪俊健罗安程金戈陶勤南 . 应用分子标记研究水稻耐低钾胁迫数量性状位点. 植物营养与肥料学报, 1997, 3(3): 209-217. doi: 10.11674/zwyf.1997.0303
    [20] 刘国栋李继云李振声 . 低磷胁迫下小麦根系反应的基因型差异. 植物营养与肥料学报, 1996, 2(3): 212-218. doi: 10.11674/zwyf.1996.0304
  • 加载中
图(7)表(1)
计量
  • 文章访问数:  187
  • HTML全文浏览量:  132
  • PDF下载量:  17
  • 被引次数: 0
出版历程
  • 收稿日期:  2019-09-16
  • 网络出版日期:  2020-06-16
  • 刊出日期:  2020-05-01

小麦钾离子通道蛋白基因TaPC1介导植株抵御低钾逆境功能研究

  • 基金项目: 高校大学生创新创业训练计划项目(201910086009);国家重点科技研发计划粮食丰产科技工程项目(2017YFD0300902)。
  • 摘要:   【目的】  钾离子通道 (potassium channel, PC) 蛋白通过介导离子跨膜转运,增强低钾胁迫下植株对钾素的吸收和利用能力。本研究以采用RNAseq鉴定小麦应答低钾基因获得的PC家族基因TaPC1为对象,对该基因分子特征、应答低钾表达模式及其介导植株抵御低钾逆境的能力进行研究。  【方法】  采用生物信息学工具分析TaPC1分子特征,采用溶液培养法培养丰钾 (K2O 6 mmol/L )、低钾 (K2O 0.06 mmol/L) 处理小麦和转化株系幼苗,采用 DNA 重组技术构建TaPC1亚细胞定位和表达质粒,利用农杆菌介导法遗传转化烟草。采用常规植株形态、生理和qPCR方法测定植株生长、生理指标和基因表达。  【结果】  TaPC1与植物种属PC家族基因具有较高的同源性,该基因编码蛋白具有植物种属PC蛋白跨膜域保守特征,翻译蛋白经内质网分选后定位于细胞质膜。低钾 (0.06 mmol/L) 处理下,根、叶中TaPC1表达增强;将低钾处理植株转入丰钾 (6 mmol/L) 营养液进行恢复处理后,根、叶中该基因表达下调,表明TaPC1呈低钾应答表达模式。基因遗传转化结果表明,与野生型 (WT) 对照相比,低钾处理下,超表达TaPC1烟草株系植株干物质积累量增多,细胞活性氧累积量减少,细胞保护酶 (SOD、CAT和POD) 活性提高,丙二醛含量降低。基因表达分析表明,低钾处理下,转化株系内细胞保护酶编码基因NtSOD1NtCAT1;1NtPOD1;2NtPOD1;6的转录本丰度较野生型 (WT) 显著增多,表明上述基因通过增强表达,在改善转化株系低钾处理下细胞活性氧稳态中发挥重要作用。此外,与WT相比,低钾处理下转化株系的钾累积量显著增多,光合碳同化能力增强。  【结论】  TaPC1呈低钾胁迫增强表达模式,上调表达该基因能显著增强植株钾素吸收,有效维持低钾逆境下的细胞活性氧稳态特征,在改善植株光合物质生产和抵御低钾逆境能力中发挥重要作用。

    English Abstract

    • 钾素是影响作物植株生长、发育和产量形成能力的必需大量营养元素。增强作物植株钾素吸收和利用能力,对于实现作物高产、优质具有重要实践意义[1]。植株根系对生长介质中钾素吸收、植株体内钾素组织间转运及与钾通道 (potassium channel,PC) 基因编码蛋白介导钾离子跨膜转运联系紧密[2]。通过ATP提供驱动能量,PC和钾离子转运蛋白逆浓度陡度,介导介质中钾离子转运至根系表皮细胞及植株其他组织器官[3],参与植株体内许多生物学过程的调节。

      近年来研究表明,植物种属中部分PC家族基因在植株遭遇低钾胁迫逆境下呈上调表达,增加根系表皮细胞质膜PC蛋白数量[3],在改善植株钾素吸收和利用效率中发挥重要作用[4-6]。前人对拟南芥PC家族基因AKT1研究表明,该基因转录本在低钾胁迫下显著增多,编码蛋白在根系表皮细胞质膜分布密度增大,进而正向调控低钾处理下植株的钾素吸收能力[6]。进一步研究发现,低钾处理下,敲除AKT1突变体株系对低钾胁迫呈超敏特征,其植株长势较对照植株明显变差[7-8]。因此,通过在转录水平上对低钾胁迫产生应答,特定植物种属PC家族成员能改善低钾胁迫下植株钾素营养状况,增强低钾逆境下植株的生长、发育和产量形成能力。

      小麦是我国北方地区重要粮食作物,揭示小麦钾素高效吸收利用分子机制,对于该作物种属钾高效遗传改良具有重要实践意义。基于此,本研究以作者前期小麦养分高效研究工作积累为基础,针对迄今有关小麦种属PC家族基因分子特征及介导植株抵御低钾逆境能力研究尚少的现状,以通过高通量RNA-seq研究鉴定的小麦种属PC家族基因TaPC1为对象,对该基因系统进化特征、应答低钾表达模式、介导植株抵御低钾逆境能力及相关生理基础进行了较系统研究,旨在深入阐明小麦钾高效利用分子机理,为今后小麦钾高效遗传改良和栽培实践提供依据。

      • 试验材料为小麦品种‘科农9204’和遗传转化TaPC1烟草株系。

      • 利用BLAST同源查找,获得TaPC1植株种属同源基因序列。利用DNAStar的Megalign工具,建立TaPC1与其植株种属同源基因系统进化树。参照前人拟南芥AKT1保守域分析方法[6],鉴定TaPC1的跨膜保守域特征。为验证供试基因编码蛋白亚细胞定位,以低钾处理根系cDNA为模板,采用RT-PCR扩增TaPC1 (GenBank登录号:AF207745) 开放阅读框 (ORF)。采用的引物为5′-TTTGTCGACAATGTCGTCGAGGTCCGG (正向,引入SalI切点) 和5′-TTTCCATGGAATAATTTTTACCTCTTAT (反向,引入NcoI切点)。参照Guo等[9]的方法,构建用CaMV35S启动子驱动TaPC1与报告基因GFP融合表达的质粒TaPC1-GFP。采用农杆菌介导法转化烟草 (cv. Wisconsin 35) 叶片,24 h后荧光显微镜下检测融合基因在亚细胞水平上的定位,鉴定供试基因编码蛋白在细胞内分布特征。

      • 以小麦品种‘科农9204’为材料,采用MS营养液 (K2O 6 mmol/L) 在生长室内培养小麦幼苗[10]。三叶期时,将幼苗转入试验室前期鉴定耐低钾小麦品系的适宜低钾浓度 (K2O 0.06 mmol/L) MS营养液进行低钾处理,处理12、24和48 h分别收集根、叶样本。为研究供试基因对恢复丰钾的响应,将部分经48 h低钾处理的幼苗再度转移至MS营养液进行丰钾恢复处理,处理12、24和48 h后分别收集根、叶样本。采用TRIzol试剂盒 (Invitrogen,产品号15596-026) 提取根叶样本总RNA,用DNA酶 (DNase) 去除其中可能含有的基因组DNA。采用M-MLV反转录酶 (TaKaRa,产品号6210A) 将总RNA反转录为cDNA,作为扩增TaPC1的模板。扩增目标基因的正向引物为5′-GAAATAGGGTTATGCCCAGCA,反向引物为5′-AAATRCTGCATGCCTAGCAGAC。qPCR程序为94℃ 变性5 min,然后进行26个循环:94℃ 1 min,54℃退火30 s,72℃延伸30 s。以小麦微管基因 (Tatubulin) 作为各样本TaPC1转录本均一化内参,作为扩增该内参基因的正向引物为5′-CATGCTATCCCTCGTCTCGACC-3′,反向引物为5′-CGCACTTCATGATGGAGTTGTAT-3′。扩增内标程序与目标基因相同。

      • TaPC1质粒为模板,扩增该基因的开放阅读框,采用的正向引物为5′-AAACCATGGCGTCGAGGTCCGGG-3′(引入Nco I切点),反向引物为5′-AAAGGTAACCGGAAAACGTAATTCTCT-3′(引入Bstp I切点),将扩增产物用Nco I和Bstp I 双酶切后融合至表达载体pCAMBIA3301。采用Sun等[10]的方法遗传转化烟草,建立超表达TaPC1烟草转化株系。以典型T3株系Line 1和Line 3为材料,以未遗传转化野生型 (WT) 为对照,研究供试材料在不同钾处理 (丰钾为K2O 6 mmol/L,低钾为K2O 0.06 mmol/L) 条件下的生长和活性氧累积特征。处理4周后选取典型转化株系和WT植株,用数码相机拍照记录植株生长状态。采用烘干法获得不同供钾处理供试材料植株干物质量。参照Gao等[11]的细胞染色方法,检测转化株系和WT植株的超氧阴离子和H2O2等活性氧累积量。

      • 以上述不同供钾处理转化株系和WT为材料,选取各处理下不同试验材料上部展开叶片,测定超氧化物岐化酶 (SOD)、过氧化氢酶 (CAT) 和过氧化物酶 (POD) 活性以及细胞膜质过氧化产物丙二醛 (MDA) 含量。上述性状测定均参照Liu等[12]的方法进行。

      • 为鉴定低钾处理下转化株系活性氧清除分子机制,对低钾处理下的转化株系和WT植株体内SOD、CAT和POD家族基因的表达模式进行了分析。用于供试的SOD家族基因5个,分别为NtMnSOD1 (X14482)、NtMnSOD2 (AB093097)、NtSOD1 (KJ874395)、NtSOD2 (EU123521) 和NtFeSOD (KF724056);CAT家族基因6个,分别为NtCAT (EF532799)、NtCAT1 (NTU07627)、NtCAT3 (HF564633)、NtCAT1;1 (NTU93244)、NtCAT1;2 (HF564632) 和NtCAT1;3 (HF564631);POD家族基因11个,分别为NtPOD1;1 (L02124)、NtPOD1;2 (AB044154)、NtPOD1;3 (AB044153)、NtPOD1;4 (D11396)、NtPOD1;5 (AB178953)、NtPOD1;6 (AB027753)、NtPOD1;7 (AB027752)、NtPOD2;1 (AB178954)、NtPOD2;2 (KF701483)、NtPOD4 (AY032675) 和NtPOD9 (AY032674)。采用上述提取小麦总RNA和合成cDNA的方法获得低钾处理下转化株系和WT植株cDNA,作为上述细胞保护酶家族基因qPCR模板。以烟草组成型表达基因Nttubulin (U91563) 作为供试细胞保护酶基因转录本均一化内参。用于扩增上述细胞保护酶家族基因和内参基因引物见表1

        表 1  烟草抗氧化酶基因及扩增引物

        Table 1.  qPCR primers for amplification of antioxidant enzyme genes in N. tabacum

        基因 Gene登录号 Accession number正向引物 Forward primer (5′—3′)反向引物 Reverse primer (5′—3′)
        NtMnSOD1X14482TTGGGCTATCGACACTAACTTTTCAGCCAGCGACTACATGCA
        NtMnSOD2AB093097GACGGACCTTAGCAACAGGGACCAATGGGTCCTGATTAGCAG
        NtSOD1KJ874395GTGGACATGTCGTGTCAAGGTTCTCACCAACTCCTGCACTT
        NtSOD2EU123521ATGTCACGGGACCACATTACAACCCTTCCACCAGCATTTC
        NtFeSODKF724056CATCACAGAGCTTATGTCGACACTAGAACTGACTGCTTCCCA
        NtCATEF532799CAAGGATCTCTACGACTCGATTCTTGAGGGCAAATAATCCACCT
        NtCAT1NTU07627GTCTCAGGCTGACAAGTCTTACGGAAGACAGAGTAGCAGC
        NtCAT3HF564633GTCTTGGGCCAAACTATCTGCATCAGCTTCACATTGTGGGCC
        NtCAT1;1NTU93244TCCTGCTAATGCTCCAAAGTGTAATGCATATGTATTAGGAATGCTC
        NtCAT1;2HF564632GGTATCGACTTGGACCAAACTAGGTCTCACATTAAGCCTAGAAG
        NtCAT1;3HF564631TTGCAGCCGGTGGGAAGATTGGTCTCACATTAAGCCTAGAAG
        NtPOD1;1L02124GGAATTTGTCCTCAAGGTGGAACTTATTGGAATTGCCATTTCAGC
        NtPOD1;2AB044154CTGACATGGTCTGTGCCTACTCAGTTGATAGCAGAGCAAACTT
        NtPOD1;3AB044153AAGATCTTGTCGCTCTTACTGGAATTGGATTTTCCAGCTTGCG
        NtPOD1;4D11396TGCTGGTAGTCAAAGTCAGTTTTCCCATGTTGAACACGTTCTTACC
        NtPOD1;5AB178953AACAGCAACAACGTTAACCCAGCTTAATTTTGGACCACATTCAGGA
        NtPOD1;6AB027753TCAACTCCACTGGTGGCCCTAATTCGATTTTGCAGCTTGCGC
        NtPOD1;7AB027752GCCCAAGAAGTTCAGGCTCAATACAAATACAGTCCTTTACTCG
        NtPOD2;1AB178954AGGGGAAAAGACCTCACCACAGTTTCCCATCTTGATCATAGCA
        NtPOD2;2KF701483AGACAGTGAGTATGCAGCTAAAAAAAAGCTGCCCTTGGCACC
        NtPOD4AY032675AGACTCAAAGATAGCAAACCTCACTTCCTGATGTCACCCTTGA
        NtPOD9AY032674CACCACCTTCATTCAACGCTAACATCTCAGACAAAACACTTGTC
        NttubulinU91563TACACAGGGGAAGGAATGGCTCGAAACCAACGGTATC
      • 以不同供钾处理转化株系和WT为材料,测定供试材料植株钾累积量和叶片光合参数。其中,参照Guo等[13]的方法,测试样本含钾量,通过单株干重与含钾量乘积计算植株钾累积量。以植株上部展开叶为样本,采用叶绿素仪 (SPAD 502) 测定叶绿素含量,测定数据用SPAD值表示;采用光合测定系统 (CIA310),测定光合速率 (Pn)、气孔导度 (Gs) 和胞间CO2浓度 (Ci)。测定条件如下:温度26℃~28℃,空气湿度73%~78%,CO2浓度365~376 μl/L,光通量密度E 486~493 μmol/(m2·s);参照Gao等[11]的方法,测定光系统II光化学效率 (ΨPSII) 和光系统非光化学淬灭系数 (NPQ)。

      • 各测试性状、参数及基因表达均进行3次重复。采用SPSS软件,对单株干物质量、含钾量、钾累积量、细胞保护系统和光合参数、基因表达的平均值、标准差和显著性进行分析。

      • TaPC1全长cDNA为3300 bp,开放阅读框2694 bp,编码897个氨基酸。TaPC1分子量为100.92 kD,等电点7.63。系统进化分析表明,TaPC1与植物种属同源基因呈较高序列一致性 (图1)。其中,与源于大麦AKT1 (H. vulgare,DQ465922)、短芒大麦草AKT1 (H. brevisubulatum,MF101259)、星星草AKT1 (P. tenuiflora,GU296229) 和水稻AKT1 (O. sativa,AY065970) 的PC家族基因在序列组成上高度同源。这表明TaPC1与上述基因具有相似祖先。

        图  1  TaPC1与植物种属同源基因的系统进化特征

        Figure 1.  Phylogenetic relations among TaPC1 and its homologous genes in plant species

      • 丰钾条件下,TaPC1在根、叶中表达水平较低。低钾处理下,TaPC1在上述器官中的表达均明显上调,表现为48 h处理时间内,随处理进程表达水平不断增高。将低钾处理48 h幼苗转入恢复处理后,该基因在根、叶中表达下调,随恢复处理进程,表达水平不断降低 (图2)。上述结果表明,TaPC1呈典型低钾诱导表达模式。该基因通过在转录水平上应答低钾逆境,在介导植株抵御低钾逆境中可能发挥着重要作用。

        图  2  根叶中TaPC1应答低钾逆境表达模式

        Figure 2.  Expression patterns of TaPC1 in roots and leaves under K-deficient stress

      • 亚细胞定位预测结果表明,TaPC1经内质网分选后,定位于细胞质膜。试验表明,与GFP分布于细胞各部位 (图3A) 不同,TaPC1-GFP融合蛋白分布于细胞质膜 (图3B),证实了上述亚细胞预测结果。采用qPCR鉴定了6个转化株系和WT的靶基因丰度,结果如图3C所示。基于Line 1和Line 3较其他转化株系显著增高靶基因表达水平,故选取上述株系鉴定靶基因介导植株抵御低钾逆境能力。结果表明,丰钾处理下,与WT相比,超表达TaPC1株系 (Line 1 和Line 3) 长势未发生改变 (图3D),植株干物质量与对照相近 (图3E)。低钾处理下,与WT相比,Line 1和Line 3长势明显增强 (图3D),干物质量较WT显著增加 (图3E)。上述结果表明,超表达TaPC1具有增强低钾处理下植株干物质生产能力,该基因在介导植株低钾抵御过程中发挥着重要作用。

        图  3  TaPC1亚细胞定位及丰、低钾处理下转化株系长势和干物质量

        Figure 3.  The subcellular location as well as the growth phenotype and dry weight of the transgenic lines under K-sufficient and K-deficient treatments

        采用细胞组织化学染色技术,检测了低钾处理后转化株系和WT的细胞超氧阴离子含量和过氧化氢 (H2O2) 含量。结果表明,与对照相比,转化株系Line 1和Line 3的细胞H2O2累积数量 (DAB组织染色,图3F) 和超氧阴离子累积数量 (氮蓝四唑NBT组织染色,图3G) 均显著减少。上述结果表明,TaPC1通过抑制低钾处理下植株细胞活性氧累积,在调控植株生长中发挥着正调控作用。

      • 以丰、低钾处理下转化株系和WT的植株上位展开叶片为材料,对不同处理下转化株系的细胞保护酶活性和丙二醛 (MDA) 含量进行了测定。结果表明,丰钾处理下,Line 1和Line 3与对照 (WT) 的SOD、CAT和POD活性及MDA含量无明显差异 (图4AD);低钾处理下,转化株系的上述细胞保护酶活性均较WT显著增高 (图4AC),MDA含量则明显低于WT(图4D)。因此,超表达TaPC1增强了植株低钾胁迫处理下的细胞保护酶活性,进而减少细胞内活性氧累积、减轻细胞的膜质过氧化程度。

        图  4  丰钾和低钾处理下转化株系和对照植株的细胞保护酶活性和丙二醛含量

        Figure 4.  Cellular antioxidant enzyme activities and MDA contents of the transgenic lines and wild type under K-sufficient and K-deficient treatments

      • 为揭示编码细胞保护酶家族基因与低钾处理下植株各种细胞保护酶活性的内在联系,对低钾处理下转化株系中5个SOD家族基因、6个CAT家族基因和11个POD家族基因的表达特征进行了检测。结果表明,与WT相比,Line 1和Line 3中1个SOD基因 (NtSOD1)、1个CAT基因 (NtCAT1;1) 和2个POD基因 (NtPOD1;2NtPOD1;6) 的表达水平显著提高。其他供试基因表达水平在转化株系和WT间无明显差异 (图5AC)。上述结果表明,低钾处理下转化株系中各种细胞保护酶活性的提高,与低钾处理下上述差异表达的各种抗氧化酶家族基因呈增强表达具有密切联系。

        图  5  低钾处理下转化株系和对照植株细胞保护酶家族基因表达模式

        Figure 5.  Expression patterns of genes encoding the cellular antioxidant enzymes in transgenic lines and wild typeunder K-deficient treatment

      • 对丰钾、低钾处理下转化株系和WT的植株含钾量和钾累积量的测定结果表明,丰钾处理下,Line 1和Line 3与WT植株的含钾量和钾累积量相近 (图6)。低钾处理下,与WT相比,Line 1和Line 3含钾量呈增加趋势,植株钾累积量显著增多 (图6),表明超表达TaPC1增强低钾处理下植株长势和干物质量生产能力,与其显著改善植株钾素吸收和累积有关。

        图  6  丰、低钾处理下转化株系和对照植株含钾量和钾累积量

        Figure 6.  K contents and accumulative amounts in transgenic lines and wild type under K-sufficient and K-deficient treatments

      • 图7结果表明,丰钾条件下,与WT相比,Line 1和Line 3各测试叶 [ 旗叶和春4叶 (小麦返青后长出的第4片叶) ] 的叶绿素含量 (Chl)、净光合速率 (Pn)、气孔导度 (Gs)、胞间CO2浓度 (Ci)、光系统II光化学效率 (ΨPSII) 和光系统非光化学淬灭系数 (NPQ) 均无明显差异。低钾处理下,与WT相比,转化株系各测试叶位Chl、Pn、Gs和ΨPSII显著增加,Ci和NPQ则显著降低。上述结果表明,超表达TaPC1具有改善低钾胁迫下植株叶绿素生物合成和光合碳同化的能力。低钾处理下光合能力的增强,是转化株系植株长势改善和干物质生产能力提升的重要生理基础。

        图  7  丰钾、低钾处理下转化株系和对照光合参数

        Figure 7.  Photosynthetic parameters of transgenic lines and wild type under K-sufficient and K-deficient treatments

      • 植物种属钾通道蛋白编码基因以家族的形式存在[14]。其中,部分介导植株钾素吸收和细胞中钾素组织间转运的PC或高亲和钾转运蛋白 (HAK) 基因呈典型低钾诱导表达模式[6-8]。如拟南芥AtHAK5[15]、大麦HvHAK1及番茄该基因同源家族成员[16],在低钾逆境下的转录本显著上调。本研究对小麦TaPC1应答低钾逆境的表达模式研究表明,该基因表达呈典型的低钾诱导特征。表明TaPC1的转录受到低钾信号调节,该基因通过增强表达参与植株对低钾逆境下的钾素吸收和植株体内钾素的组织间转运过程。

        研究表明,特定植物种属PC家族基因在增强植株低钾逆境钾素吸收能力中发挥重要作用[6]。当生长介质中K+浓度较低 (通常0.5 mmol/L以下) 时,PC和HAK家族基因通过转录和翻译后水平调节调控植株体内钾素的相对稳态,增强植株对低钾胁迫的适应能力[17-18]。目前已证实,拟南芥PC家族基因AKT1在增强低钾处理下植株的钾素吸收中发挥重要作用[6]。敲除该基因突变体株系,植株对低钾胁迫呈超敏特征[7-8]。通过对TaPC1转化株系在丰、低钾处理下的植株生长特性、钾素吸收、干物质生产及光合特性的研究,发现与野生型 (WT) 对照相比,超表达TaPC1株系在丰钾处理下的生长和相关生理参数未发生明显改变,这表明该基因对丰钾条件下的植株钾素营养和生长状况不产生明显影响。低钾处理下,与WT相比,转化株系植株长势增强,钾含量和累积量增加,光合碳同化能力显著增强。这表明TaPC1通过增强低钾逆境下的植株钾素吸收能力,改善转化株系植株的叶片叶绿素生化合成代谢和光合碳同化能力,进而增强植株低钾逆境下的长势和干物质积累能力。因此,该小麦PC家族基因在今后小麦等麦类作物钾高效遗传改良中可能具有重要应用价值。

        低钾等非生物逆境条件下,植株体内的超氧阴离子、过氧化氢和羟基自由基等活性氧累积数量增多,造成细胞和组织的损伤和功能衰退[11, 19-20]。较高的超氧化物岐化酶 (SOD)、过氧化氢酶 (CAT) 和过氧化物酶 (POD) 等抗氧化酶活性,通过清除逆境诱发的活性氧,维持细胞内活性氧相对良好稳态,在延缓植株器官衰老、增强逆境下植株生长发育和改善植株抵御逆境胁迫能力中发挥着重要作用[11, 21-23]。本研究表明,与野生型对照植株相比,超表达TaPC1的烟草转化株系在低钾处理下植株体内的SOD、CAT和POD等细胞保护酶活性显著增强,细胞内累积的活性氧 (超氧阴离子和H2O2) 数量减少,膜质过氧化程度减轻。表达分析表明,特定抗氧化酶基因家族成员如NtSOD1NtCAT1;1NtPOD1;2NtPOD1;6,在低钾处理下转化株系植株体内的表达水平较野生型对照植株显著提高,表明上述特定细胞保护酶基因通过增强转录效率,提高转化株系低钾逆境下的细胞保护酶活性、减少活性氧累积数量、减轻膜质的过氧化程度。因此,TaPC1介导植株抵御低钾能力的增强,与转化株系植株特定细胞保护酶基因的转录效率增强有关。低钾逆境下上述细胞保护酶基因转录激活及其调控相关细胞保护酶活性的机制有待进一步探讨。

        增强植物种属PC家族基因在转录水平上对低钾逆境的应答,与上游信号组分介导低钾逆境信号的传递有关。研究表明,拟南芥蛋白激酶CIPK23是植株体内低钾信号传递的重要上游组分,参与对拟南芥AKT1HAT5的转录调控[24-25]。因此,进一步开展TaPC1转录关联的上游信号组分鉴定及基因启动子应答低钾逆境的关键顺式作用元件研究,将有助于深入阐明钾通道/转运蛋白介导钾离子转运和植株适应低钾逆境的分子机理。

      • 小麦PC 家族基因TaPC1 在核苷酸序列水平上与植物种属PC 家族基因高度同源,该基因编码蛋白含有 PC 蛋白跨膜保守域,经内质网分选后定位于细胞质膜。TaPC1 表达呈典型低钾诱导表达模式。与野生型对照相比,低钾处理下超表达TaPC1 烟草株系钾累积量和植株干物质量增多,光合能力增强,细胞保护酶活性提高,丙二醛含量降低。低钾处理下转化株系细胞保护酶基因 NtSOD1NtCAT1;1NtPOD1;2NtPOD1;6 转录本丰度显著高于野生型对照,表明上述基因通过增强表达,在改善低钾处理下转化株系细胞活性氧稳态、进而改善其光合和物质生产能力中发挥重要作用。TaPC1 在创制耐低钾小麦种质中具有重要应用价值。

    参考文献 (25)

    目录

      /

      返回文章
      返回