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拟南芥生态型Tor-1根系响应镉的转录组学与可变剪接分析

肖燕 姚珺玥 廖琼 吴秀文 宋海星 罗劲松 张振华

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拟南芥生态型Tor-1根系响应镉的转录组学与可变剪接分析

    作者简介: 肖燕 E-mail:xiaoxiaoY8432@163.com;
    通讯作者: 罗劲松, E-mail:625845834@qq.com ; 张振华, E-mail:zhzh1468@163.com
  • 基金项目: 国家重点研发计划项目(2017YFD0200100, 2017YFD0200103)。

Transcriptome and alternative splicing analysis of cadmium response mechanisms in the root system of Arabidopsis thaliana ecotype Tor-1

    Corresponding author: LUO Jin-song, E-mail:625845834@qq.com ;ZHANG Zhen-hua, E-mail:zhzh1468@163.com
  • 摘要:   【目的】  研究拟南芥生态型根系对镉 (Cd) 的适应性机制,挖掘耐Cd基因,为培育修复型植物提供生理基础和理论指导。  【方法】  本研究以高Cd积累同时高耐受性的拟南芥生态型Tor-1为试验材料,测定Cd处理后根系的生理变化、氧化应激反应、抗氧化酶活性,结合转录组学和可变剪接分析,以期从分子水平上解析Tor-1根系对Cd的适应性机制。  【结果】  Cd处理后,拟南芥生态型Tor-1的主根长度和根尖数没有明显差异,但根系总体积、总表面积显著降低,总根长极显著下降,表明根系受到损伤;根系丙二醛浓度较对照有所增加,但变化不显著;脯氨酸浓度显著下降;超氧化物歧化酶 (SOD) 和过氧化氢酶 (CAT) 活性显著增加。基因本位论 (GO) 富集分析显示,在生物过程中,差异表达基因 (DEGs) 在代谢过程和对化学物质的反应功能富集最为显著;在细胞组分中,DEGs在细胞外组分功能显著富集;在核酸功能中,DEGs在氧化应激活性和血红素结合功能显著富集。京都基因和基因组百科全书 (KEGG) 通路表明,高比例诱导的DEGs富集于7条KEGG途径,分别为苯丙素生物合成 (4.49%)、次生代谢物的生物合成 (14.45%)、代谢途径 (20.57%)、硫代葡萄糖苷 (GS) 生物合成 (0.89%)、谷胱甘肽 (GSH) 代谢 (2.04%)、苯丙氨酸和酪氨酸及色氨酸的生物合成 (1.39%)、苯丙氨酸代谢 (1.14%)。在Cd胁迫下,Tor-1根系苯丙素合成与代谢和GSH代谢相关基因表达大部分显著上调,而GS合成相关基因表达受到抑制,并发生可变剪接事件,其中内含子保留事件发生最多。  【结论】  Tor-1根系在应对Cd胁迫时虽然根系形态受到一定损伤,但可通过增加抗氧化酶 (SOD、CAT) 活性减轻镉胁迫产生的危害,并积极通过调节苯丙素合成与代谢、GSH代谢以及抑制GS合成对应的基因来减轻Cd对植物的伤害,还可通过可变剪接来积极适应Cd胁迫。
  • 图 1  Cd胁迫下的根系形态变化

    Figure 1.  Root morphology changes under cadmium stress

    图 2  Cd胁迫下根的氧化胁迫

    Figure 2.  Oxidative stress under cadmium stress in roots

    图 3  样本相关性热图

    Figure 3.  Heat map of sample correlation

    图 4  Cd胁迫下Tor-1的转录变化

    Figure 4.  Transcriptional changes of Tor-1 under cadmium stress

    图 5  Cd胁迫下不同GO通路上调和下调的差异基因数量

    Figure 5.  The number of genes up- and down-regulated in different GO pathways under cadmium stress

    图 6  对Cd响应的KEGG通路分析 (前20)

    Figure 6.  KEGG pathway analysis of cadmium response (Top 20)

    图 7  对Cd响应的代谢途径相关基因表达 (TD-VS-TK,TD Tor-1 CK;TK Tor-1 Cd)

    Figure 7.  Expression of metabolism-related genes in response to cadmium (TD-VS-TK, TD Tor-1 CK; TK Tor-1 Cd)

    图 8  根部可变剪接分类和数量统计

    Figure 8.  Alternative splicing classification and quantitative statistics in roots

    图 9  根部相关基因表达水平

    Figure 9.  Related gene expression in roots

    表 1  qRT-PCR引物序列

    Table 1.  Primer sequences for qRT-PCR analysis

    Gene nameForward (5′—3′)Reverse (5′—3′)
    MYB4GGAAAGTCAACAACGCCACGGCTACCTCCGACTACATCGC
    CAD5GACCAAGCGAAGATGAGCGACCCGTTATCACTTTCCTCCCA
    GSTF7CCAACTTGTCTCCCTTGGCTCTTGGACTCACCAAGCCTGT
    ALDH2C4GAGCCACGACGGTGAAGTTACAGCATCAATGAACTGGCCG
    GSTF2GACGGTGAGCACAAGAAGGATGTGGTCAAGCCGTAGATGG
    GSTU24TAACCCTCTCCTTCCCTCCGTGACCGCCCAAATCCTTCTC
    F6'H1ATCTGCCCTAATCCGGACCTCCAGTTCCCTGAAGCCAGAG
    MAM3GAAGTATGCGAAGAGGCCGACATCAGCCCCTGGAGTGTTT
    CYP83A1TCCTTATCCCTCGTGCTTGCACTCGTAGTCCGTGCCTTTG
    PAL4GAGTCAAGGCGAGTAGCGAAGTTGACACGGACGAGCATTG
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    表 2  基因类型统计

    Table 2.  Genotype statistics

    样本
    Sample
    参考基因组总数
    Refer gene number
    检测到的基因数占比
    Sequenced refer gene
    (%)
    新发现基因数
    Novel gene number
    新基因数及占比
    Sequenced novel gene
    (%)
    基因总数
    Total gene number
    检测到的基因总数及占比
    Sequenced total gene
    (%)
    TD-12762822408 (81.11%)344271 (78.78%)2797222679 (81.08%)
    TD-22762821942 (79.42%)344255 (74.13%)2797222197 (79.35%)
    TD-32762822170 (80.24%)344259 (75.29%)2797222429 (80.18%)
    TK-12762822293 (80.69%)344258 (75.00%)2797222551 (80.62%)
    TK-22762822345 (80.88%)344267 (77.62%)2797222612 (80.84%)
    TK-32762822153 (80.18%)344268 (77.91%)2797222421 (80.16%)
    注(Note):TD—Tor-1 进行 10 μmol/L Cd 处理 Tor-1 under 10 μmol/L Cd stress; TK—对照 Tor-1 in CK.
    下载: 导出CSV
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-12-20
  • 网络出版日期:  2020-09-23
  • 刊出日期:  2020-08-31

拟南芥生态型Tor-1根系响应镉的转录组学与可变剪接分析

  • 基金项目: 国家重点研发计划项目(2017YFD0200100, 2017YFD0200103)。
  • 摘要:   【目的】  研究拟南芥生态型根系对镉 (Cd) 的适应性机制,挖掘耐Cd基因,为培育修复型植物提供生理基础和理论指导。  【方法】  本研究以高Cd积累同时高耐受性的拟南芥生态型Tor-1为试验材料,测定Cd处理后根系的生理变化、氧化应激反应、抗氧化酶活性,结合转录组学和可变剪接分析,以期从分子水平上解析Tor-1根系对Cd的适应性机制。  【结果】  Cd处理后,拟南芥生态型Tor-1的主根长度和根尖数没有明显差异,但根系总体积、总表面积显著降低,总根长极显著下降,表明根系受到损伤;根系丙二醛浓度较对照有所增加,但变化不显著;脯氨酸浓度显著下降;超氧化物歧化酶 (SOD) 和过氧化氢酶 (CAT) 活性显著增加。基因本位论 (GO) 富集分析显示,在生物过程中,差异表达基因 (DEGs) 在代谢过程和对化学物质的反应功能富集最为显著;在细胞组分中,DEGs在细胞外组分功能显著富集;在核酸功能中,DEGs在氧化应激活性和血红素结合功能显著富集。京都基因和基因组百科全书 (KEGG) 通路表明,高比例诱导的DEGs富集于7条KEGG途径,分别为苯丙素生物合成 (4.49%)、次生代谢物的生物合成 (14.45%)、代谢途径 (20.57%)、硫代葡萄糖苷 (GS) 生物合成 (0.89%)、谷胱甘肽 (GSH) 代谢 (2.04%)、苯丙氨酸和酪氨酸及色氨酸的生物合成 (1.39%)、苯丙氨酸代谢 (1.14%)。在Cd胁迫下,Tor-1根系苯丙素合成与代谢和GSH代谢相关基因表达大部分显著上调,而GS合成相关基因表达受到抑制,并发生可变剪接事件,其中内含子保留事件发生最多。  【结论】  Tor-1根系在应对Cd胁迫时虽然根系形态受到一定损伤,但可通过增加抗氧化酶 (SOD、CAT) 活性减轻镉胁迫产生的危害,并积极通过调节苯丙素合成与代谢、GSH代谢以及抑制GS合成对应的基因来减轻Cd对植物的伤害,还可通过可变剪接来积极适应Cd胁迫。

    English Abstract

    • 据不完全统计,目前我国受重金属污染的耕地面积已达千万hm2[1],根据中国土壤环境质量限值,全国有16%的土壤受到污染,其中农业土壤占19%[2]。在农业生产上,重金属污染不仅使土壤肥力下降,而且在污染土壤上生产出的农产品质量不符合生态安全的要求[3]。美国有毒物质和疾病登记处 (ATSDR) 将镉 (Cd) 列为十大危险物质之一[4]。Cd与其他重金属元素相比,危害植物的生长,同时也更容易被植物吸收[5],进而通过食物链给人类带来潜在的健康风险[6-7],文献报道摄入或吸入过量的镉会对人体的免疫系统、泌尿系统、骨骼、神经系统、生殖系统等造成损伤,同时镉还具有较强的致癌、致畸、致突变的作用[8]

      高浓度的Cd会扰乱植物体内离子平衡,造成氧化胁迫,对植物的生长和发育产生毒害作用[9]。当过量的Cd进入植物细胞质后,会引起植物的许多氧化应激反应,如脂质过氧化、蛋白质变性[10]、活性氧的增加 (ROS)[11]等,对植物的生长发育造成毒害。而Cd诱导的氧化胁迫导致植物中如超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化氢酶 (CAT) 抗氧化酶的活性增加[12-13]。同时,植物可以通过Cd外排、转运分配、金属硫蛋白和植物螯合肽的螯合以及Cd的液泡区隔化[14-17]降低Cd毒害。而这些过程的发生离不开相关基因的表达调控,其调控网络还有待深入认识。

      近年来,测序技术的迅猛发展和测序成本的大幅下降,极大地推动了基因组学和分子生物学等多种学科领域的研究,越来越多的研究利用转录组学探究植物对Cd的差异响应基因[18-20]。选择性剪接 (alternative splicing,AS) 是一种典型的转录后调控。研究表明,AS在植物对非生物胁迫的响应中起着重要的作用,如盐胁迫[21]、温度胁迫[22],但是关于响应Cd胁迫的研究仍然较少[23]。因此,从生理水平结合转录组学及可变剪接分析了解植物对Cd的耐受机制具有重要意义。

      我们的研究表明,Tor-1属于镉较高积累且又对镉较耐受的品种(数据未发表)。本研究主要以拟南芥生态型Tor-1为代表,着重解析较高积累同时耐受的拟南芥生态型根系对Cd的转录响应机制,为挖掘耐Cd基因和培育植物修复型材料提供理论指导以及开拓新的思路。

      • 试验材料为拟南芥生态型 (Arabidopsis thaliana ecotype) Tor-1。

      • 试验设在湖南农业大学资源环境学院人工培养气候室中,采用水培试验。拟南芥种子播种于育苗盘中,10 天后挑选长势一致的壮苗,用海绵包裹植株根部,移栽至水培盒中,培养密度为48株/盒,盒子外围包裹黑色塑料袋,抑制水培液中藻类生长。水培液为1/4 PNS (plant nutrient solution) 培养液,具体如下:1 mol/L KNO3、1 mol/L KH2PO4、1 mol/L MgSO4、1 mol/L Ca(NO3)2、0.02 mol/L Fe-Na2-EDTA、70 mmol/L H3BO3、14 mmol/L MnCl2、1 mmol/L ZnSO4、0.2 mmol/L NaMoO4、10 mmol/L NaCl、0.01 mmol/L CoCl2、0.5 mmol/L CuSO4,每4 天更换一次营养液,光照培养室环境温度为22℃~24℃,光照周期为16 h (光照)/8 h (黑暗)。当植株正常培养20 天后,进行10 μmol/L CdCl2处理,以不作任何处理为对照,3 天后分别对大小相对一致的地下部取样进行各项指标测定,每次试验至少设置4次生物学重复。

      • 采用EPSON Expression 11000XL进行根系的扫描,总根长、总根表面积、总根体积和根尖数采用WinRHIZO Pro2013系统进行分析。

      • 丙二醛 (MDA) 的测定用硫代巴比妥酸法 (TBA法)[24],即用三氯乙酸研磨提取,TBA显色后,于450、532、600 nm比色。

      • 用酸性茚三酮法测定脯氨酸含量[25],即用磺基水杨酸于沸水中提取,加入冰醋酸、酸性茚三酮后,沸水浴30 min。冷却后加甲苯显色,吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于520 nm波长比色,以甲苯为空白对照。

      • 采用索莱宝的过氧化氢酶活性检测试剂盒 (BC0205)提取测定CAT活性;用索莱宝的超氧化物歧化酶活性检测试剂盒 (BC0175) 提取测定SOD活性。

      • 当植株正常培养20 天后,进行10 μmol/L CdCl2处理,以不作任何处理为对照,3 天后取大小相对一致的根置于液氮中,用TRIzol (Ambion,United States) 提取总RNA[26]。具体方法如下:将样品用SCIENTZ-48高通量组织研磨器 (Scientz,Ningbo) 打碎后,加1 mL TRIzol、500 μL氯仿,混匀静置5 min后离心。吸取上清液300 μL,加等体积的异丙醇,混匀后静置5 min,离心,用75%乙醇清洗沉淀后干燥,根据RNA的浓度加相对应的dd H2O彻底溶解。使用HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Vazyme) 合成cDNA 模板。基因的相对表达定量测定使用SYBR Premix Ex-TaqTM II (TAKARA)。qRT-PCR所用引物采用Primer 6.0软件设计,引物序列如表1所示。

        表 1  qRT-PCR引物序列

        Table 1.  Primer sequences for qRT-PCR analysis

        Gene nameForward (5′—3′)Reverse (5′—3′)
        MYB4GGAAAGTCAACAACGCCACGGCTACCTCCGACTACATCGC
        CAD5GACCAAGCGAAGATGAGCGACCCGTTATCACTTTCCTCCCA
        GSTF7CCAACTTGTCTCCCTTGGCTCTTGGACTCACCAAGCCTGT
        ALDH2C4GAGCCACGACGGTGAAGTTACAGCATCAATGAACTGGCCG
        GSTF2GACGGTGAGCACAAGAAGGATGTGGTCAAGCCGTAGATGG
        GSTU24TAACCCTCTCCTTCCCTCCGTGACCGCCCAAATCCTTCTC
        F6'H1ATCTGCCCTAATCCGGACCTCCAGTTCCCTGAAGCCAGAG
        MAM3GAAGTATGCGAAGAGGCCGACATCAGCCCCTGGAGTGTTT
        CYP83A1TCCTTATCCCTCGTGCTTGCACTCGTAGTCCGTGCCTTTG
        PAL4GAGTCAAGGCGAGTAGCGAAGTTGACACGGACGAGCATTG
      • 拟南芥正常培养20天后,进行10 μmol/L Cd处理,同时以不做处理作为对照。3 天后取根置于液氮中。混合取样,即取3个大小相对一致的根为一个生物学重复,设置3个生物学重复。测序平台使用Illumina HiSeq2500平台上的转录组测序 (Denovo Biotechnology Co,中国广州)。

      • 为保证数据质量,对下机的raw reads利用fastp (https://github.com/OpenGene/fastp) 进行质控,过滤低质量数据,得到clean reads。利用HISAT2[27]软件,开展基于参考基因组的比对分析,根据比对结果,利用Stringtie[28]重构转录本,并计算每个样本中所有基因的表达量,表达量以原始reads count和FPKM展示。我们取每一个基因 (全体基因集) 在任意两个样品中的表达量,计算每两个样品之间的皮尔斯 (Pearson) 相关系数,再将这些相关系数以热图形式直观地展示任意两个样品之间的相关性。

      • 根据基因表达水平分析中得到的reads count数据,使用DESeq2软件进行基因差异表达分析,基于差异分析结果,以差异表达倍数 ( fold change,FC) 和错误发现率 (false discovery rate,FDR) 作为差异表达基因的筛选条件,筛选阈值为FDR<0.05且|log2FC|>1。

      • 首先,将基因向GO数据库 (http://www.geneontology.org/) 的各term映射,并计算每个term的基因数,从而得到具有某个GO功能的基因列表及基因数目统计,然后应用超几何检验,与整个基因组背景相比,找出在基因中显著富集的GO条目。我们使用KEGG公共数据库对基因Pathway富集分析。通过Pathway显著性富集能确定基因参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径。利用rMATS[29]检测5种可变剪接事件,并且可以对有生物学重复的样品进行差异AS分析。

      • 采用SPSS系统LSD最小差异性分析多重范围比较对试验数据进行统计分析,每个试验至少进行4次生物重复。P < 0.05为差异显著;P < 0.01为差异极显著;P > 0.05为没有显著差异。用GraphPad Prism 8软件制作热图,EXCEL软件制作柱形图。

      • 与对照相比,Cd处理后Tor-1的主根长度和根尖数没有明显差异 (图1-AB),但是根系总体积、总表面积显著降低,总根长极显著下降 (图1-B),根系形态受到一定的毒害。

        图  1  Cd胁迫下的根系形态变化

        Figure 1.  Root morphology changes under cadmium stress

      • 图2可见,经过Cd处理之后,Tor-1根系的MDA浓度与CK没有显著性差异。Cd处理下的MDA含量增加说明Tor-1的脂质过氧化程度增加,其根系受到一定的毒害。同时单位鲜重的脯氨酸含量显著降低,SOD和CAT活性极显著增加。这些指标表征Tor-1的根系受到Cd的毒害,同时积极的响应Cd并减轻其毒害。

        图  2  Cd胁迫下根的氧化胁迫

        Figure 2.  Oxidative stress under cadmium stress in roots

      • 为了鉴定拟南芥生态型Tor-1根系中对Cd胁迫响应的差异表达基因 (DEGs),我们对其进行RNA-Seq测序。信息分析前对原始数据进行数据过滤,过滤掉低质量数据,得到clean reads。基因转录丰度用counts数定量,以RPKM计量。参考基因为27628个,其中基本80%以上的转录本在我们的样本中表达 (表 2)。Pearson相关系数以热图的形式呈现 (图3),图中横坐标和纵坐标都分别为各个样品,颜色深浅表示两样本的相关性系数大小。越接近红色表示相关性越大,越接近绿色,相关性越小,结果表明相同处理相关性比较好 (图3)。

        表 2  基因类型统计

        Table 2.  Genotype statistics

        样本
        Sample
        参考基因组总数
        Refer gene number
        检测到的基因数占比
        Sequenced refer gene
        (%)
        新发现基因数
        Novel gene number
        新基因数及占比
        Sequenced novel gene
        (%)
        基因总数
        Total gene number
        检测到的基因总数及占比
        Sequenced total gene
        (%)
        TD-12762822408 (81.11%)344271 (78.78%)2797222679 (81.08%)
        TD-22762821942 (79.42%)344255 (74.13%)2797222197 (79.35%)
        TD-32762822170 (80.24%)344259 (75.29%)2797222429 (80.18%)
        TK-12762822293 (80.69%)344258 (75.00%)2797222551 (80.62%)
        TK-22762822345 (80.88%)344267 (77.62%)2797222612 (80.84%)
        TK-32762822153 (80.18%)344268 (77.91%)2797222421 (80.16%)
        注(Note):TD—Tor-1 进行 10 μmol/L Cd 处理 Tor-1 under 10 μmol/L Cd stress; TK—对照 Tor-1 in CK.

        图  3  样本相关性热图

        Figure 3.  Heat map of sample correlation

      • 通过比较对照和Cd处理的Tor-1根的转录组数据,揭示Cd胁迫下的转录变化。对照组和Cd处理后样品的基因表达谱的全球比较如图4所示,共鉴定到2673个DEGs,其中包括1229个上调基因和1444个下调基因 (图4-BC)。

        图  4  Cd胁迫下Tor-1的转录变化

        Figure 4.  Transcriptional changes of Tor-1 under cadmium stress

        我们分析了这些基因所代表基因本体论 (GO) 富集项,GO富集分析显示,在生物过程中,DEGs在代谢过程、细胞进程、单组织进程、刺激反应等富集最为显著;在细胞组分中,细胞、细胞部分、膜、器官等显著富集;在核酸功能中,结合、催化活性显著富集 (图5)。我们绘制了京都基因和基因组百科全书 (KEGG) 气泡图,进一步确定响应Cd胁迫的显著富集通路,这些通路可以分为112个预测生物合成途径,其中,18个代谢途径明显丰富 (Q value < 0.05)。高比例诱导的DEGs富集于7条KEGG途径 (图6),分别为苯丙素生物合成 (4.49%);次生代谢物的生物合成 (14.45%);代谢途径 (20.57%);GS生物合成 (0.89%);GSH代谢 (2.04%);苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成 (1.39%);苯丙氨酸代谢 (1.14%)。

        图  5  Cd胁迫下不同GO通路上调和下调的差异基因数量

        Figure 5.  The number of genes up- and down-regulated in different GO pathways under cadmium stress

        图  6  对Cd响应的KEGG通路分析 (前20)

        Figure 6.  KEGG pathway analysis of cadmium response (Top 20)

      • 经过对苯丙素代谢途径富集的基因分析,确定15个苯丙素代谢相关基因在Cd处理下有普遍的表达反应。经过Cd处理后,与苯丙素生物合成相关的基因ALDH2C4CAD5、F6'H1CYP84A1CCOAMTCCR2都显著表达增加,而TSM1表达下调 (图7A)。与苯丙素代谢相关基因PAL44CL1PAL2UGT75C14CL3表达也显著上调,而LAC17SNG1表达下调 (图7A),MYB4转录因子极显著上调 (图7A)。同时在GS生物合成途径中,GS生物合成相关基因除开CYP79B2外,其他10个差异表达基因基本下调表达 (图7B)。GSH代谢途径中,除GSTU26GSTF11GSTU20APX4GSTU6APXTGSTU17这7个基因表达下调外,其他18个基因都有不同程度的上调表达 (图7C)。

        图  7  对Cd响应的代谢途径相关基因表达 (TD-VS-TK,TD Tor-1 CK;TK Tor-1 Cd)

        Figure 7.  Expression of metabolism-related genes in response to cadmium (TD-VS-TK, TD Tor-1 CK; TK Tor-1 Cd)

      • AS是真核生物重要的基因调控机制,利用rMATS检测外显子跳跃 (skipped exon,SE)、内含子保留 (retained intron,RI)、互斥外显子 (mutually exclusive exons,MXE)、5′可变剪接位点 (alternative 5′ splice site,A5SS)、3′可变剪接位点 (alternative 3′ splice site,A3SS) 5种可变剪接事件,并且可以对有生物学重复的样品进行AS差异分析。结果如图8-A所示,只使用Junction Counts进行AS事件检测,在全部AS中,17.65%发生A3SS事件,11.27%发生A5SS事件,1.03%发生MXE事件,41.29%发生RI事件,28.76%发生SE事件。而在AS差异表达中,13.89%发生A3SS事件,10.88%发生A5SS事件,0.46%发生MXE事件,64.35%发生RI事件,10.42%发生SE事件 (图8-B),AS差异表达主要发生RI事件。而使用Junction Counts 和 reads on target进行AS事件检测与只使用Junction Counts 进行AS检测结果相似 (图8-CD)。

        图  8  根部可变剪接分类和数量统计

        Figure 8.  Alternative splicing classification and quantitative statistics in roots

      • 挑选差异基因富集途径的基因进行qRT-PCR验证 (图9),Cd处理后,MYB4CAD5ALDH2C4CSTU24F6′H1PAL4CSTF7CSTF2表达都显著上调,而CYP83A1MAM3显著下调 (图9),这些基因的表达趋势和转录组数据一致。

        图  9  根部相关基因表达水平

        Figure 9.  Related gene expression in roots

      • Cd胁迫会引起植物体内一系列生理生化代谢过程的紊乱,最终导致植物的生长发育受到抑制。当植物最初接触到Cd,植物根形态结构损伤 (图1);而当Cd进入植物体内,则会引起一系列氧化应激及适应性反应,在转录水平上,DEGs主要富集到的GO条目包括代谢过程、对化学物质的反应功能、氧化应激活性、血红素结合功能等,而KEGG途径主要富集于苯丙素生物合成,次生代谢物的生物合成代谢途径,GSH代谢,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成,苯丙氨酸代谢等 (图6)。这与水稻[30]、玉米[31]、和白菜[32]等植物 Cd 胁迫下转录组的研究结果相似。

        MDA是细胞中多不饱和脂肪酸过氧化的最终产物之一,作为胁迫下脂质过氧化的标志物,细胞自由基 (ROS) 的增加会导致MDA的过量产生[33-35]。本研究中,Tor-1受到Cd胁迫后,根部MDA浓度较正常培养增加,但是没达到显著差异 (图2A),说明其根系受到一定的毒害,但是稍有缓解。脯氨酸是一种环状氨基酸,在初级代谢中起重要作用[36]。有研究表明高等植物脯氨酸的积累是对外界胁迫 (如重金属、干旱、高盐等) 的应激反应,有利于植物应对外界胁迫[37-38],而同时又有研究表明脯氨酸能清除羟自由基和单态氧,从而保护细胞免受ROS诱导的损伤[39]。Cd胁迫后,根的脯氨酸浓度较正常培养下显著降低 (图2B),说明根系在积极响应并减轻Cd毒害。

        抗氧化酶是抵御生物体内自由基的第一道防线[40],已有相当多的研究证实了抗氧化酶活性增强可以减轻Cd毒害导致的氧化胁迫[41-43]。GSH代谢在调节氧化胁迫和抵抗非生物胁迫中非常重要[44-46],其代谢过程主要是由谷胱甘肽还原酶 (GR)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GP)、谷胱甘肽转硫酶 (GST) 调控[47-48]。其中GST由多基因家族编码,其活性提高有助于对氧化胁迫的抵抗[48]。水稻根系对Cd的转录响应分析表明,在Cd胁迫下,GSTs表达被诱导上调[23]。有研究表明Cd处理下,CAT和SOD浓度显著增加,并可以通过激活抗坏血酸-谷胱甘肽循环以去除过氧化氢[41]。本研究中,植物根系抗氧化酶 (CAT,SOD) 活性显著增加 (图2),谷胱甘肽代谢途径的GSTs大部分显著上调 (图7C),暗示Tor-1根系在Cd胁迫下,可以通过增加抗氧化物酶活性,以及通过GSTs基因调控谷胱甘肽代谢加快,积极的抵抗氧化胁迫,从而减轻植物根系受到的Cd毒害。

        GS是在拟南芥和十字花科植物中发现的富含氮和硫的植物次生代谢物[49-52],GS代谢产物具有清除自由基的能力,而其降解产物异硫氰酸盐类的抗氧化能力更高,对脂质过氧化物的清除能力也更强[53],有研究表明萝卜苗的抗氧化能力与其含有的异硫氰酸盐呈正相关[54]。GS的生物合成是对胁迫的响应,但其在应对非生物胁迫中的生理作用尚不清楚[55-56]。我们发现Cd处理后,Tor-1根系GS合成相关基因显著下调 (图7A),暗示Tor-1根系可以调控GS相关基因来参与抗氧化过程。有研究表明GSH是GS生物合成中的硫供体[57],但是GSH代谢过程中是否能传达某种信号影响GS的合成与代谢,使之协同参与胁迫下的抗氧化过程,还有待进一步探究。

        R2R3-MYB转录因子调节一般的苯丙烷类途径基因的转录,可以参与木质素的调控[58],R2R3-MYB转录因子过表达会导致木质素含量减少[59]SbMYB15可以通过调控抗氧化酶系统来减轻Cd胁迫[60];R2R3-MYB49可以调控Cd的积累[61]MYB4是一个R2R3-MYB转录因子,MYB4的过表达可以增强拟南芥对胁迫的耐受性[62];拟南芥中的MYB4在水稻中的异位表达可以提高其对非生物、环境和生物胁迫的耐受性[63]。我们发现经过Cd处理后,MYB4表达显著增加,与此同时,大部分参与苯丙素生物合成和代谢的基因的表达也是显著增加的 (图7A),暗示MYB4可能作为上游信号,调控苯丙烷代谢相关基因的表达,以减轻Cd胁迫,而这一机制有待进一步研究。

        AS是一种重要的调节机制,用于增加转录组和蛋白质组的多样性,代表了在进化和压力下的适应[64-65]。植物可能通过与逆境胁迫相关基因的选择性剪接来调控抗逆基因的表达以适应逆境[66]。我们在这里提供的数据表明了Cd胁迫下,主要发生RI事件,暗示其对植物适应Cd胁迫发挥重要作用。

      • Cd胁迫下,Tor-1根系产生一系列氧化应激反应,如增加抗氧化酶 (SOD、CAT) 活性,激活GSTs家族的大部分基因加快GSH代谢、调控GS相关基因,以清除活性氧对根系的毒害;另一方面积极调控苯丙素合成代谢相关基因及通过AS发生RI事件进行转录后调控,积极应对Cd胁迫。我们通过对高镉积累且耐受的拟南芥生态型Tor-1根系在Cd胁迫下的生理变化、转录响应、可变剪接的结合分析,旨在提高对这一类拟南芥生态型响应Cd胁迫的分子机理认识,为鉴定抗Cd的作物种质资源和培育植物修复型材料提供部分理论基础。

    参考文献 (66)

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