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微生物菌剂对猪粪堆肥过程中堆肥理化性质和优势细菌群落的影响

李昌宁 苏明 姚拓 韩琪琪 梁建军 冉福 刘子越 刘玉祯 柴澍杰 滚双宝

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微生物菌剂对猪粪堆肥过程中堆肥理化性质和优势细菌群落的影响

    作者简介: 李昌宁E-mail:1640432649@qq.com;
    通讯作者: 姚拓, E-mail:yaotuo@gsau.edu.cn
  • 基金项目: 甘肃省畜禽粪便资源化利用(GARS-ZJ-6);甘肃省高等学校产业支撑计划项目基于畜禽废弃物的肥料化生产及示范(2020C-16);新型农用促生、防病菌剂关键技术及新产品开发(2019-1-76)。

Effects of microbial inoculation on compost physical and chemical properties and dominant bacterial communities during composting of pig manure

    Corresponding author: YAO Tuo, E-mail:yaotuo@gsau.edu.cn ;
  • 摘要:   【目的】  掌握猪粪堆肥过程中微生物群落的演替规律与理化指标的相互关系,对提高猪粪堆肥营养品质和加速堆肥进程具有重要的意义。  【方法】  以猪粪和玉米秸秆 (质量比6∶1) 混合物为堆肥原料,耐高温菌剂主要含Acinetobacter pittii、Bacillus subtilis subsp. StercorisBacillus altitudinis。堆体设接种菌剂 (MI) 和未接种 (对照,CK) 两个处理。常规监测堆肥温度和理化指标值,于堆肥开始后第4、12、24和32天采集样品,以16S rRNA高通量测序技术研究堆肥细菌群落的变化。用堆肥第4、12、24和32天采集的新鲜样品制备浸提液,进行紫花苜蓿种子发芽试验。堆肥结束时,测定全氮、全磷和全钾含量,并探讨微生物菌剂对堆肥理化指标和细菌群落演替的影响。  【结果】  接种微生物菌剂可使堆肥高温期提前2天出现,并且能延长高温期2天。堆肥浸提液的促生试验发现,在堆肥24天后紫花苜蓿种子发芽指数 (GI) 大于80%,且MI对幼苗主根的促生能力大于CK (P < 0.05)。随着发酵过程的进行,堆体体积不断缩小,CK和MI中全钾 (TK) 和全磷 (TP) 含量一直呈增加趋势,在堆肥第32天,CK和MI的全磷含量分别为2.28%和2.63%,处理间差异显著 (P < 0.05),而全钾含量分别为1.81%和1.86%,全氮含量分别为2.65%和2.63%,pH分别为8.72和8.78,处理间差异均不显著。在整个堆肥过程中,MI和CK的pH变化范围分别为8.40~8.95和8.61~8.93;CK和MI中总有机碳 (TOC) 的降解速率在堆肥的4~12和24~32天均表现为MI大于CK,CK和MI的碳氮比 (C/N) 分别为13.28和15.26,差异显著 (P < 0.05)。堆肥过程中在门水平上占据主导地位的细菌群落主要包括 Proteobacteria、Actinobacteria、Firmicutes和Bacteroidetes,在堆肥的高温期 (堆肥24天),堆体CK和MI中Firmicutes的相对丰富度分别为17.4%和59.8%;在堆肥的升温期、高温期和腐熟期,优势门水平细菌群落Proteobacteria、Firmicutes和Actinobacteria依次演替,且MI堆体中细菌群落的相对丰度均大于CK。属水平优势细菌为AcinetobacterLysinibacillusSolibacillusPseudomonasFlavobacterium,添加微生物菌剂可使Acinetobacter的丰度在堆肥第4天增加21.41%,此外,添加复合微生物可使堆肥第12天的Shannon和Observed species指数增加。相关性分析表明,温度、全N (TN)、TP、TK、TOC及GI与堆体中细菌组成具有显著相关性,而pH和细菌的相关性不显著。  【结论】  在堆体内接种微生物菌剂可显著提高并维持堆肥过程中优势门、属细菌群落的丰度,进而促进堆体升温并延长高温时期,缩短堆肥腐熟周期,加快总有机碳的分解,最终提高堆肥产品中有效磷的含量。复合微生物菌剂在堆肥升温期起主要作用的为Acinetobacter pittii,高温期为Bacillus subtilis subsp. StercorisBacillus altitudinis,我们建议筛选耐高温细菌时应集中在厚壁菌门的芽孢杆菌属。
  • 图 1  堆肥过程中温度 (a) 和发芽指数 (b) 的变化

    Figure 1.  Changes of temperature (a) and germination index (b) during composting process

    图 2  堆肥过程中细菌群落多样性 (a) 和丰富度 (b) 指数的变化

    Figure 2.  Changes of bacterial community diversity (a) and richness (b) indices during composting process

    图 3  细菌群落在门水平 (a) 和属水平 (b) 分布特征分析

    Figure 3.  Analysis of distribution characteristics of bacterial communities at phylum level (a) and genus level (b)

    图 4  理化指标与细菌相对丰富度在种水平上的相关性分析

    Figure 4.  Correlation between physical-chemical indices and bacterial relative abundances at the species level

    表 1  供试材料物理化学特征

    Table 1.  Physical and chemical characteristics of tested materials

    材料Material含水率Moisture (%)有机质Organic matter (%)全氮Total N (%)碳氮比C/N全钾Total K (%)全磷Total P (%)
    猪粪Pig manure46.20 ± 0.3172.65 ± 0.192.03 ± 0.0820.76 ± 1.020.56 ± 0.120.21 ± 0.03
    玉米秸秆Corn straw 8.75 ± 0.1480.74 ± 0.120.81 ± 0.2657.81 ± 1.621.56 ± 0.040.27 ± 0.18
    注(Note):表中数据为均值 ± 标准误差 (n=4) The data in the table are presented as mean ± Sd (n=4).
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    表 2  各堆肥样品的原始数据、过滤数据和有效率

    Table 2.  The raw data, clean data and effectiveness of each compost sample

    样品
    Sample
    原始数据
    Raw read
    过滤数据
    Clean read
    有效率 (%)
    Effectiveness
    样品
    Sample
    原始数据
    Raw read
    过滤数据
    Clean read
    有效率 (%)
    Effectiveness
    CK4-1866308156394.15MI4-1849678025394.45
    CK4-2821277735894.19MI4-2843727967294.43
    CK4-3845978011094.70 MI4-3928898427490.73
    CK12-1852848015693.99MI12-1761007148993.94
    CK12-2821648005797.44MI12-2845618010594.73
    CK12-3626786104897.40 MI12-3661456229194.17
    CK24-1818228014297.95MI24-1599625409590.22
    CK24-2746287076994.83MI24-2685876708797.81
    CK24-3695396288290.43MI24-3700446689695.51
    CK32-1623225884994.43MI32-1959438675590.42
    CK32-2524354118778.55MI32-2599395408490.23
    CK32-3832468101897.32MI32-3753597005292.96
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    表 3  堆肥过程中全氮、有机碳含量和pH的变化

    Table 3.  Changes of total N and organic C contents and pH during composting process

    堆肥时间 (d)
    Composting time
    全氮 Total N (%)有机碳 Total organic C (%)pH
    CKMICKMICKMI
    42.14 ± 0.02 cA1.87 ± 0.05 dB41.67 ± 0.31 aB46.67 ± 0.22 aA8.61 ± 1.05 dA8.40 ± 1.35 cB
    122.06 ± 0.01 cA1.93 ± 0.03 cB42.67 ± 0.18 aA42.51 ± 0.19 bA8.83 ± 0.34 bB8.94 ± 0.45 aA
    242.27 ± 0.01 bA2.09 ± 0.05 bB36.67 ± 0.21 bB43.25 ± 0.23 bA8.93 ± 0.10 aA8.95 ± 0.25 aA
    322.65 ± 0.03 aA2.63 ± 0.04 aA35.12 ± 0.51 bB41.67 ± 0.12 bA8.72 ± 0.32 cA8.78 ± 1.08 bA
    注(Note):同列数据后不同小写字母表示不同堆肥时间间差异显著,同行数据后不同字母表示两个处理间差异显著 (P < 0.05) Values followed by different lowercase letters in a column indicate significant difference among different composting time and values followed by different uppercase letters indicate significant difference between CK and MI treatments (P < 0.05).
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    表 4  堆肥过程中全磷、全钾含量和C/N的变化

    Table 4.  Changes of total P and K contents and C/N during composting process

    堆肥时间 (d)
    Composting time
    全磷 Total P (%)全钾 Total K (%)C/N
    CKMICKMICKMI
    42.15 ± 0.03 cA1.22 ± 0.05 cB1.18 ± 0.02 dA1.26 ± 0.03 dA19.16 ± 1.15 bB24.56 ± 1.05 aA
    121.95 ± 0.04 dA1.93 ± 0.03 bA1.36 ± 0.01 cA1.46 ± 0.03 cA20.51 ± 0.54 aA 18.55 ± 0.05 bAB
    242.62 ± 0.03 aA2.09 ± 0.05 bB1.47 ± 0.01 bA1.53 ± 0.01 bA16.85 ± 0.10 cA17.27 ± 0.25 bA
    322.28 ± 0.02 bB2.63 ± 0.04 aA1.81 ± 0.02 aA1.86 ± 0.02 aA13.28 ± 0.32 dB15.26 ± 1.00 cA
    注(Note):同列数据后不同小写字母表示不同堆肥时间间差异显著,同行数据后不同字母表示两个处理间差异显著 ( P < 0.05) Values followed by different lowercase letters in a column indicate significant difference among different composting time and values followed by different uppercase letters indicate significant difference between CK and MI treatments ( P < 0.05).
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    [20] 孙晓华罗安程仇丹 . 微生物接种对猪粪堆肥发酵过程的影响. 植物营养与肥料学报, 2004, 10(5): 557-560. doi: 10.11674/zwyf.2004.0521
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-02-08
  • 网络出版日期:  2020-10-19
  • 刊出日期:  2020-09-25

微生物菌剂对猪粪堆肥过程中堆肥理化性质和优势细菌群落的影响

    作者简介:李昌宁E-mail:1640432649@qq.com
    通讯作者: 姚拓, yaotuo@gsau.edu.cn
  • 1. 甘肃农业大学草业学院/草业生态系统教育部重点实验室,甘肃兰州 730070
  • 2. 南开大学数学科学学院,天津 300071
  • 3. 甘肃农业大学动物科学技术学院,甘肃兰州 730070
  • 基金项目: 甘肃省畜禽粪便资源化利用(GARS-ZJ-6);甘肃省高等学校产业支撑计划项目基于畜禽废弃物的肥料化生产及示范(2020C-16);新型农用促生、防病菌剂关键技术及新产品开发(2019-1-76)。
  • 摘要:   【目的】  掌握猪粪堆肥过程中微生物群落的演替规律与理化指标的相互关系,对提高猪粪堆肥营养品质和加速堆肥进程具有重要的意义。  【方法】  以猪粪和玉米秸秆 (质量比6∶1) 混合物为堆肥原料,耐高温菌剂主要含Acinetobacter pittii、Bacillus subtilis subsp. StercorisBacillus altitudinis。堆体设接种菌剂 (MI) 和未接种 (对照,CK) 两个处理。常规监测堆肥温度和理化指标值,于堆肥开始后第4、12、24和32天采集样品,以16S rRNA高通量测序技术研究堆肥细菌群落的变化。用堆肥第4、12、24和32天采集的新鲜样品制备浸提液,进行紫花苜蓿种子发芽试验。堆肥结束时,测定全氮、全磷和全钾含量,并探讨微生物菌剂对堆肥理化指标和细菌群落演替的影响。  【结果】  接种微生物菌剂可使堆肥高温期提前2天出现,并且能延长高温期2天。堆肥浸提液的促生试验发现,在堆肥24天后紫花苜蓿种子发芽指数 (GI) 大于80%,且MI对幼苗主根的促生能力大于CK (P < 0.05)。随着发酵过程的进行,堆体体积不断缩小,CK和MI中全钾 (TK) 和全磷 (TP) 含量一直呈增加趋势,在堆肥第32天,CK和MI的全磷含量分别为2.28%和2.63%,处理间差异显著 (P < 0.05),而全钾含量分别为1.81%和1.86%,全氮含量分别为2.65%和2.63%,pH分别为8.72和8.78,处理间差异均不显著。在整个堆肥过程中,MI和CK的pH变化范围分别为8.40~8.95和8.61~8.93;CK和MI中总有机碳 (TOC) 的降解速率在堆肥的4~12和24~32天均表现为MI大于CK,CK和MI的碳氮比 (C/N) 分别为13.28和15.26,差异显著 (P < 0.05)。堆肥过程中在门水平上占据主导地位的细菌群落主要包括 Proteobacteria、Actinobacteria、Firmicutes和Bacteroidetes,在堆肥的高温期 (堆肥24天),堆体CK和MI中Firmicutes的相对丰富度分别为17.4%和59.8%;在堆肥的升温期、高温期和腐熟期,优势门水平细菌群落Proteobacteria、Firmicutes和Actinobacteria依次演替,且MI堆体中细菌群落的相对丰度均大于CK。属水平优势细菌为AcinetobacterLysinibacillusSolibacillusPseudomonasFlavobacterium,添加微生物菌剂可使Acinetobacter的丰度在堆肥第4天增加21.41%,此外,添加复合微生物可使堆肥第12天的Shannon和Observed species指数增加。相关性分析表明,温度、全N (TN)、TP、TK、TOC及GI与堆体中细菌组成具有显著相关性,而pH和细菌的相关性不显著。  【结论】  在堆体内接种微生物菌剂可显著提高并维持堆肥过程中优势门、属细菌群落的丰度,进而促进堆体升温并延长高温时期,缩短堆肥腐熟周期,加快总有机碳的分解,最终提高堆肥产品中有效磷的含量。复合微生物菌剂在堆肥升温期起主要作用的为Acinetobacter pittii,高温期为Bacillus subtilis subsp. StercorisBacillus altitudinis,我们建议筛选耐高温细菌时应集中在厚壁菌门的芽孢杆菌属。

    English Abstract

    • 随着我国居民生活水平的提高,人们对肉类产品需求日益增长,促使生猪养殖业快速发展。据统计,在2018年中国生猪养殖量达0.48亿头[1],但多数养殖场尚无完善的粪尿处理设施,机体排泄物不仅污染土壤,而且大量的寄生虫和病原菌还可以通过空气传播从而引起人畜共患疾病,对畜禽和人类生命健康造成严重的威胁[2]。国务院办公厅印发的《关于加快推进畜禽养殖废弃物资源化利用的意见》明确提出目标,到2020年将建立起科学规范、权责清晰、约束有力的畜禽养殖废弃物资源化利用制度,全国畜禽粪污综合利用率达到75%以上,规模养殖场粪污处理设施装备配套率达到95%以上,这就需要探寻一种从根源上处理畜禽废物污染的途径。

      在我国畜禽粪便的处理方式主要有直接还田、生产沼气、生产饲料和肥料化技术。畜禽粪便直接还田时由于养殖场周围缺少可承载畜禽粪便的土地,导致畜禽粪便的资源化利用率不足20%,并且容易造成环境污染[3];生产沼气投资大,效益低,并且产生的沼气不完全燃烧存在二次污染;此外,饲料化首先需要将畜禽粪便中有毒害的物质去除,生产成本高;以堆肥为主的肥料化是固体废物资源化、无害化和减量化的有效手段,通过微生物的生理代谢作用,将农业废弃物矿质化、腐殖化,在高温发酵过程中杀死致病菌,促进有机废弃物腐熟[4-5]。然而,自然堆肥发酵时土著微生物数量不足,导致分解能力弱,发酵周期长,堆肥产品营养成分含量低,因此,为了加速高温堆肥进程和提高产品质量,施入添加剂是有效的技术措施,常见的添加剂包括泥炭和沸石等天然吸附剂[2-3, 6-7],富含钙、镁等金属盐类和有机碳的秸秆[8-11]、外源微生物[12]等。微生物接种剂不仅能够加速农业废弃物的降解,还具有成本低、操作简单和无二次污染等优点。Huang等[8]研究表明,堆肥过程微生物群落的演替直接受理化指标 (如全氮、全磷、全钾、温度、碳氮比、有机质和pH等) 的影响,并且在堆肥的不同阶段堆体中微生物群落组成受温度影响较大。Mao等[6] 在猪粪堆肥中发现,在门水平占优势的菌群主要有Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria和Acteroidetes,但相对丰富度在堆肥的不同时期各异。

      本研究进行了两组猪粪堆肥试验,处理组中添加微生物菌剂,根据堆肥过程中温度的变化情况,将堆肥分为升温期、高温期、降温期和腐熟期,通过测定堆肥理化指标以评价堆肥腐熟度和肥效,并运用16S rDNA高通量测序技术对猪粪堆肥过程中细菌群落演替开展研究,用相关性热图分析了猪粪堆肥主要理化指标和细菌群落 (种水平) 之间的相互关系,并从不同分类角度 (门、属水平) 掌握细菌群落的变化,以期为微生物菌剂对堆肥品质的提升和后期研究中筛选更加优良的功能菌株提供理论支撑。

      • 供试材料为新鲜猪粪和玉米秸秆 (品种为中农甜488)。猪粪取自甘肃省皋兰县正大种猪养殖场 (103°32′ E、36°35′ N),将收集的猪粪统一混匀后待用。玉米秸秆取自周边农村,将玉米秸秆粉碎至粒径约3~5 cm左右,理化特性见表1

        表 1  供试材料物理化学特征

        Table 1.  Physical and chemical characteristics of tested materials

        材料Material含水率Moisture (%)有机质Organic matter (%)全氮Total N (%)碳氮比C/N全钾Total K (%)全磷Total P (%)
        猪粪Pig manure46.20 ± 0.3172.65 ± 0.192.03 ± 0.0820.76 ± 1.020.56 ± 0.120.21 ± 0.03
        玉米秸秆Corn straw 8.75 ± 0.1480.74 ± 0.120.81 ± 0.2657.81 ± 1.621.56 ± 0.040.27 ± 0.18
        注(Note):表中数据为均值 ± 标准误差 (n=4) The data in the table are presented as mean ± Sd (n=4).

        微生物接种剂筛选于高温猪粪堆肥,由甘肃农业大学草业学院提供 (由Acinetobacter pittiiBacillus subtilis subsp. StercorisBacillus altitudinis按照体积比2∶1∶1复合而成),各菌株之间无拮抗[5]。培养基配方为:酵母膏5 g,蛋白胨5 g,纤维素 (双圈牌滤纸) 5 g,NaCl 5 g,CaCO3 2 g,K2HPO4 1 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,FeSO4·7H2O 0.5 mg,MnSO4·H2O 0.16 mg,ZnSO4·7H2O 0.16 mg,CoCl2 0.2 mg 与 1000 mL蒸馏水混合,pH为7.0,121℃下灭菌30 min。

      • 堆肥试验于2018年8—9月在皋兰县正大养猪场粪便无害化处理基地进行,共计32天,将猪粪和玉米秸秆按照6∶1(质量比)混合均匀,此时猪粪和玉米秸秆堆体的C/N = 25~30,调节猪粪和玉米秸秆混合物初始含水率为60%~65%后,建成长 × 宽 × 高 = 3.0 m × 1.5 m × 1.4 m 的条垛式堆体。处理组中按照复合菌剂体积和堆体质量比接种微生物菌剂1.0% (MI),以不接种微生物菌剂为对照 (CK)[5],为了使物料混合的更加均匀,采用人工翻堆的方式进行翻堆 (确保堆料获得充足的氧气),在堆肥的升温期 (堆肥第0~3天) 翻堆一次,高温期 (堆肥第3~20天) 翻堆两次,降温期 (堆肥第20~25天) 翻堆一次,腐熟期 (堆肥第25~35天) 翻堆一次[13]。即堆肥第3、10、15、25、30天分别翻堆,堆肥过程中保持含水率为60%~65%,直至堆体温度下降至环境温度结束堆肥发酵。在整个堆肥过程中,于堆肥第4、12、24和32 天进行样品的采集,采取剖面多高度等量取样法,将每个堆体分成4段,在每段多个高度 (上层0~40 cm、中层40~80 cm、下层80~120 cm) 随机采集等量样品[5],混合均匀后,为保证取样的代表性,采用四分法多次分取样品500 g (鲜重) 左右。样品分成2份,其中1份于-20℃保存 (测定堆肥细菌群落),另一份自然风干、粉碎后待用 (测定理化性质)。

      • 运用不锈钢金属探杆温度计 (品牌KT,型号BJ8A,生产商为上海星辰仪表) 测定堆肥温度和环境温度的变化[14],分别于每天9:00、12:00及15:00测定堆肥样品上层 (0~40 cm)、中层 (40~80 cm)、下层 (80~120 cm) 温度,每个位置两次测温所得平均值为该点温度,堆肥同一深度5个位置温度的平均值作为堆肥该深度的温度,最后将堆体上层、中层和下层的温度取平均值作为堆肥的温度。同时记录当天环境温度求平均值作为当天的环境温度。

      • 利用堆肥第4、12、24和32天的浸提液检测堆肥的植物毒性,通过供试种子的发芽指数间接评价堆肥腐熟程度,将堆肥样品 (5.0 g) 和蒸馏水按照1∶10 (质量/体积,W/V) 的比例于摇床上振荡浸提,在直径为9 cm的培养皿中平铺两张定性滤纸,挑选大小一致的紫花苜蓿种子20粒,在培养皿中摆放均匀,添加不同时期堆肥样品浸提液5 mL于培养皿中,以去离子水为对照,共计3次重复,在28℃条件下培养3天,每天统计发芽率,在培养结束时测量紫花苜蓿种子根长。最后分别计算相对发芽率、相对根长和发芽指数[6]。计算公式如下:

        相对发芽率 (relative germination percentage,RGP):

        $ {\rm{RGP}}\left( \% \right) = \frac{{\text{处理平均发芽率}}}{{\text{空白平均发芽率}}} \times 100 $

        相对根长 (relative root elongation,RRE):

        $ {\rm{RRE}}\left( \% \right) = \frac{{\text{处理平均根长}}}{{\text{空白平均根长}}} \times 100 $

        发芽指数 (germination index,GI):

        $ {\rm{GI}}\left( \% \right) = \frac{{{\rm{RGP}} \times {\rm{RRE}}}}{{100}} $

      • 堆肥全氮采用硫酸–水杨酸–催化剂消化法 (全自动凯氏定氮仪) 测定,全磷采用硫酸–硝酸消煮—钒钼黄比色法 (UV2800A紫外分光光度计,UNIC,中国) 测定,全钾采用硫酸–硝酸消煮—火焰光度法 (FP6431火焰光度计,YD有限公司) [14] 测定;有机质采用高温灰化法测定;根据公式TOC = OM/1.724计算有机碳含量[2],其中TOC为总有机碳含量,OM为有机质含量。

      • 运用DNA快速提取试剂盒 (MP Biomedicals,OH,USA),称取0.1 g堆肥样品进行基因组DNA提取,PCR产物使用2%琼脂糖凝胶进行电泳,检测DNA的纯度和浓度,取适量的样本DNA于离心管中,使用无菌水稀释样本至1 ng/μL,以稀释后的基因组DNA为模板,New England Biolabs 公司的 Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶进行PCR,引物为515F (5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAAT-3') 和 806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')。根据测序区域的选择,选择区域为16S V4区域[15],测序公司为天津诺和志源生物信息科技有限公司,每个堆肥样品设3个生物学重复。

      • 为研究各样本的物种组成,对所有样本的Effective Tags以97%的一致性 (Identity) 进行OTUs (Operational Taxonomic Units) 聚类,然后对OTUs的代表序列进行物种注释。根据物种注释结果,选取每个样本或分组在门和属分类水平 (Phylum and Genus level) 上最大丰度排名前10的物种生成柱状图,以便直观查看各样本在门和属水平上相对丰度较高的物种及其优势细菌群落。

      • 基于IonS5TMXL测序平台,利用单端测序 (Single-End) 的方法,构建小片段文库进行单端测序[15]。对Reads剪切过滤,每个样品的序列数和质控有效率如表2所示,将序列聚类成为OTUs,然后对OTUs序列与Silva132数据库进行物种注释。根据物种注释情况,进一步计算物种丰富度 (Observed species) 与多样性 (Shannon),以及进行组间差异的比较,揭示堆肥样品中群落结构的差异特征,其中Observed species与Shannon具体算法参考 http://www.mothur.org/wiki (version v.1.30.1)。

        表 2  各堆肥样品的原始数据、过滤数据和有效率

        Table 2.  The raw data, clean data and effectiveness of each compost sample

        样品
        Sample
        原始数据
        Raw read
        过滤数据
        Clean read
        有效率 (%)
        Effectiveness
        样品
        Sample
        原始数据
        Raw read
        过滤数据
        Clean read
        有效率 (%)
        Effectiveness
        CK4-1866308156394.15MI4-1849678025394.45
        CK4-2821277735894.19MI4-2843727967294.43
        CK4-3845978011094.70 MI4-3928898427490.73
        CK12-1852848015693.99MI12-1761007148993.94
        CK12-2821648005797.44MI12-2845618010594.73
        CK12-3626786104897.40 MI12-3661456229194.17
        CK24-1818228014297.95MI24-1599625409590.22
        CK24-2746287076994.83MI24-2685876708797.81
        CK24-3695396288290.43MI24-3700446689695.51
        CK32-1623225884994.43MI32-1959438675590.42
        CK32-2524354118778.55MI32-2599395408490.23
        CK32-3832468101897.32MI32-3753597005292.96
      • 采用SPSS 20.0 对组内样品采用单因素方差 (ANOVA) 分析,同一时期组间差异采用Student test;用Rstudio中psych包的corr.test函数计算物种和堆肥技术指标的Spearman相关系数值并检验其显著性,然后用pheatmap包中的pheatmap函数进行可视化。利用beeswarm函数绘制Shannon和Observed species指数的蜜蜂群图。

      • 堆肥第1天环境温度为23℃(图1a),但堆温上升很快。MI在第2天可达到50℃,而CK在第4天堆体温度才达到50℃,此外,MI和CK的高温期 (> 50℃) 分别持续25、23天,但在高温期伴随着翻堆的进行,堆体MI的温度变化幅度较CK大,主要在堆肥的2~10天表现为堆体MI的温度大于CK。随着堆肥过程的持续,在第28天时,堆体温度开始降低 (< 50℃) 并逐渐接近环境温度,对于降温和腐熟阶段,堆体MI的温度下降速度较CK快,表明添加微生物菌剂有助于堆肥快速腐熟。在堆肥前12天,GI一直小于80%,在24天之后,随着堆肥过程的进行,GI均大于80%,并且表现为MI大于CK (P < 0.05),这一现象充分证明添加微生物菌剂后堆肥浸提液的促生能力提高。

        图  1  堆肥过程中温度 (a) 和发芽指数 (b) 的变化

        Figure 1.  Changes of temperature (a) and germination index (b) during composting process

      • 在堆肥第4天 (表 3),总氮含量在CK和MI中分别为2.14%和1.87%(P < 0.05)。当堆肥反应进行到第12天时,MI中总氮含量较第4天增加 (P < 0.05),而CK基本保持不变 (P > 0.05),在第32天 (腐熟期) 时,CK和MI中总氮含量分别为2.65%和2.63% (P > 0.05),表明在堆肥腐熟时堆体中总氮的含量均有所增加,但较CK而言,添加微生物菌剂不能有效地提高堆肥产品的总氮含量。MI中总有机碳含量在堆肥4~12 天从46.67%下降到42.51% (P < 0.05),CK中总有机碳含量从41.67%上升到42.67% (P > 0.05),这一结果表明微生物菌剂在堆肥4~12天可使总有机碳含量减少。此外,堆肥过程中总有机碳的降解速率在堆肥的4~12和24~32天均表现为MI大于CK,这也说明添加微生物菌剂有助于总有机碳的降解。MI和CK的pH在堆肥第4天分别为8.40和8.61,第12天 时CK和MI的pH分别为8.83和8.94,MI和CK的最终pH分别为8.78和8.72 (P > 0.05),表明接种微生物菌剂对堆肥pH没有明显影响。

        表 3  堆肥过程中全氮、有机碳含量和pH的变化

        Table 3.  Changes of total N and organic C contents and pH during composting process

        堆肥时间 (d)
        Composting time
        全氮 Total N (%)有机碳 Total organic C (%)pH
        CKMICKMICKMI
        42.14 ± 0.02 cA1.87 ± 0.05 dB41.67 ± 0.31 aB46.67 ± 0.22 aA8.61 ± 1.05 dA8.40 ± 1.35 cB
        122.06 ± 0.01 cA1.93 ± 0.03 cB42.67 ± 0.18 aA42.51 ± 0.19 bA8.83 ± 0.34 bB8.94 ± 0.45 aA
        242.27 ± 0.01 bA2.09 ± 0.05 bB36.67 ± 0.21 bB43.25 ± 0.23 bA8.93 ± 0.10 aA8.95 ± 0.25 aA
        322.65 ± 0.03 aA2.63 ± 0.04 aA35.12 ± 0.51 bB41.67 ± 0.12 bA8.72 ± 0.32 cA8.78 ± 1.08 bA
        注(Note):同列数据后不同小写字母表示不同堆肥时间间差异显著,同行数据后不同字母表示两个处理间差异显著 (P < 0.05) Values followed by different lowercase letters in a column indicate significant difference among different composting time and values followed by different uppercase letters indicate significant difference between CK and MI treatments (P < 0.05).

        全钾和全磷的总量保持不变,但随着堆体原料被微生物不断分解,使MI和CK的体积不断减小,堆体中全磷和全钾的相对含量在增加,至堆肥腐熟时堆体的体积维持恒定,堆体MI、CK中全磷和全钾的相对含量保持稳定并达到最大值。在堆肥过程中,CK和MI的全磷含量分别为1.95%~2.62%和1.22%~2.63% (表4),在堆肥第32天时,CK和MI的全磷含量分别为2.28%和2.63% (P < 0.05),在堆肥结束时添加微生物菌剂可有效地提高全磷含量;全钾含量一直呈增加趋势,在堆肥过程中,全钾间在CK和MI中的变化范围分别为1.18%~1.81%和1.26%~1.86%,但在堆肥的升温期、高温期、降温期和腐熟期堆肥全钾在CK和MI中的含量均差异不显著,说明添加微生物菌剂对堆肥全钾含量没有明显影响。适宜的C/N有助于堆体中微生物的繁殖 (表4),在堆肥第4天,堆体CK和MI的C/N分别为19.16和24.56(P < 0.05),表明添加微生物菌剂有助于增加堆体C/N。在堆肥第12到24天,堆体CK和MI的C/N均减小 (P > 0.05)。当堆肥反应进行到第32天时,堆体CK和MI的C/N分别为13.28和15.26 (P < 0.05)。

        表 4  堆肥过程中全磷、全钾含量和C/N的变化

        Table 4.  Changes of total P and K contents and C/N during composting process

        堆肥时间 (d)
        Composting time
        全磷 Total P (%)全钾 Total K (%)C/N
        CKMICKMICKMI
        42.15 ± 0.03 cA1.22 ± 0.05 cB1.18 ± 0.02 dA1.26 ± 0.03 dA19.16 ± 1.15 bB24.56 ± 1.05 aA
        121.95 ± 0.04 dA1.93 ± 0.03 bA1.36 ± 0.01 cA1.46 ± 0.03 cA20.51 ± 0.54 aA 18.55 ± 0.05 bAB
        242.62 ± 0.03 aA2.09 ± 0.05 bB1.47 ± 0.01 bA1.53 ± 0.01 bA16.85 ± 0.10 cA17.27 ± 0.25 bA
        322.28 ± 0.02 bB2.63 ± 0.04 aA1.81 ± 0.02 aA1.86 ± 0.02 aA13.28 ± 0.32 dB15.26 ± 1.00 cA
        注(Note):同列数据后不同小写字母表示不同堆肥时间间差异显著,同行数据后不同字母表示两个处理间差异显著 ( P < 0.05) Values followed by different lowercase letters in a column indicate significant difference among different composting time and values followed by different uppercase letters indicate significant difference between CK and MI treatments ( P < 0.05).
      • 在堆肥的第4天 (图2a),Shannon指数表现为CK大于MI (P < 0.05),随着堆肥过程的进行,在堆肥的第12天,堆体MI的Shannon指数大于CK(P < 0.05),而在堆肥的第24天,堆体MI和CK的Shannon指数差异不显著 (P > 0.05)。在堆肥的第32天,Shannon指数表现为CK大于MI (P < 0.05),这可能是由于在堆肥的第32天,堆体MI中大量营养物质已被微生物分解利用,故在MI中细菌的Shannon指数小于CK。

        图  2  堆肥过程中细菌群落多样性 (a) 和丰富度 (b) 指数的变化

        Figure 2.  Changes of bacterial community diversity (a) and richness (b) indices during composting process

        Observed species 指物种的丰富度 (图2b),在堆肥第4天时,CK为700,而MI为350,说明添加复合微生物在堆肥第4天可有效降低物种的丰富度,在第12天堆体CK和MI的Observed species指数分别为539和672 (P < 0.05),这表明微生物菌剂可显著增加细菌群落的丰富度。在堆肥的第24和32天,Observed species一直呈现CK大于MI,变化范围为分别为683~702和583~634,表明在堆肥的降温期和腐熟期,MI中细菌群落的含量较低,但在堆肥第24天时,Observed species在CK和MI之间差异不显著。

      • 为了寻找细菌在门水平 (Phylum) 和属水平 (Genus) 各组样本之间优势物种的差异,选取在Phylum和Genus分类水平上平均丰富度排名前10的物种生成柱状图。细菌在Phylum上占据主导地位的主要包括Proteobacteria、Actinobacteria、Firmicutes和Bacteroidetes,随着堆肥过程的进行,微生物群落组成发生了明显变化,在堆肥的第4~12天,堆体CK中 (图3a) 细菌群落Proteobacteria相对丰富度为34.9%~32.9%,基本保持稳定,而堆体MI中Proteobacteria的含量分别为74.5%~48.2%,随着堆肥反应的进行,Proteobacteria的相对丰富度有所减少,但呈现堆体MI的相对丰富度大于CK,说明添加微生物菌剂促进了Proteobacteria的繁殖;在堆肥的第24天时MI中以Firmicutes (59.8%) 的丰富度最高,而CK中的丰富度为17.4%;在堆肥的第24~32天,堆体CK和MI中Actinobacteria相对丰富度的变化范围分别为5.6%~31.0%、20.5~49.0%,表明添加复合微生物有助于堆体中Actinobacteria的繁殖;至堆肥结束时,堆体Bacteroidetes的含量在CK和MI中分别为4.4%和5.8%,Bacteroidetes 群落丰富度基本保持不变。

        图  3  细菌群落在门水平 (a) 和属水平 (b) 分布特征分析

        Figure 3.  Analysis of distribution characteristics of bacterial communities at phylum level (a) and genus level (b)

        堆体CK和MI中 (图3b) 占优势的细菌群落在属水平为AcinetobacterLysinibacillusSolibacillusPseudomonasFlavobacterium,较堆体CK而言,添加复合微生物菌剂在堆肥的第4天可使Acinetobacter的丰度剧烈增加,变化范围为2.2%~48.7%;在堆肥的第12天,Lysinibacillus的相对丰富度在堆体CK和MI中分别为14.9%、3.3%,而AcinetobacterFlavobacterium的相对丰富度基本保持不变,其丰富度在堆体CK和MI中的变化范围分别为24.1%~22.2%和22.7%~21.7%;当堆肥反应进行到第24天时,Pseudomonas的丰富度降低,在堆体CK和MI中分别为7.2%和0.8%,Solibacillus的丰富度增加,其丰富度在堆体CK和MI中分别为1.3%和10.3%;在堆肥第32天时,堆体CK和MI中优势细菌群落AcinetobacterLysinibacillusSolibacillusPseudomonasFlavobacterium的相对丰度均较低。

      • 相关性分析 (图4) 表明,堆肥温度 (T) 与Stenotrophomonas koreensis 呈极显著正相关 (P < 0.01),与Novibacillus thermophiluBacillaceae bacterium NS1.3Ammoniibacillus agariperforans 呈显著负相关 (P < 0.05),表明堆肥温度可以促进细菌Stenotrophomonas koreensis的增长,而抑制Novibacillus thermophilu、Bacillaceae bacterium NS1.3的繁殖,对提高堆肥升温效率和分离筛选耐高温菌株具有重要意义。GI 与Thermomonospora curvata (P < 0.01)、Ammoniibacillus agariperforans (P < 0.05) 和Bacillus thermolactis (P < 0.05) 呈正相关,与 Brevundimonas terrae (P < 0.05) 呈负相关,这也充分表明Thermomonospora curvata、Ammoniibacillus agariperforansBacillus thermolactis可以促进种子的发芽。

        图  4  理化指标与细菌相对丰富度在种水平上的相关性分析

        Figure 4.  Correlation between physical-chemical indices and bacterial relative abundances at the species level

        总氮与Thermomonospora curvataBacillaceae bacterium NS1.3显著相关 (P < 0.05),与Ammoniibacillus agariperforansNovibacillus thermophilus 极显著相关 (P < 0.01),表明这4个细菌的丰度有助于增加堆肥总氮的含量;总有机碳与Rummeliibacillus pycnusClostridium butyricumClostridium perfringensSolibacillus silvestris呈显著正相关 (P < 0.05),与Clostridium disporicum呈极显著正相关 (P < 0.01),与Sphingobacterium mizutaii呈显著负相关 (P < 0.05),表明这6种细菌在堆肥过程中对有机碳的分解可能起重要作用。在堆肥过程中,与全钾含量呈正相关的细菌主要有Thermomonospora curvata (P < 0.01)、Bacillus thermolactis (P < 0.05)、Ammoniibacillus agariperforans(P < 0.01) 和Novibacillus thermophilus (P < 0.05);全磷含量与Ammoniibacillus agariperforans呈正相关 (P < 0.05),而与Rummeliibacillus pycnus (P < 0.01)、Vagococcus fluvialis (P < 0.05) 和 Acinetobacter schindleri (P < 0.05) 呈负相关,这也为猪粪和玉米秸秆堆肥过程中筛选优良溶磷解钾细菌提供了依据。

      • 堆肥过程中温度的变化反映了堆体内微生物群落的变化,同时又是使堆肥达到无害化和稳定化的重要条件[4]。本研究表明添加复合微生物可以促使堆肥高温期提前2天出现,并能延长高温期。Liu等[4]研究发现添加复合微生物可加速堆肥中有机质降解,导致微生物产生的热量增加,从而促进了堆体温度增加,并且翻堆不但调整了适宜微生物代谢的孔隙度、增加氧气含量,还使物料混合的更加均匀。堆肥过程中产生的高温不仅可以杀死堆肥中的病原菌、杂草种子、虫卵等,还决定着堆肥过程中起主导作用的微生物群落[16]。发芽指数 (GI) 是通过测定植物毒性来判定堆肥是否腐熟的一种方法,GI大于80%表示对植物生长无毒性,也是堆肥腐熟和达到无害化的基本要求之一[6]。在堆肥高温期 (堆肥第4~12天),GI一直小于80%,随着堆肥发酵的进行 (堆肥第24~32天),GI大于80%,并且GI表现为MI大于CK,产生这种现象的原因可能是堆肥过程中有机物经降解产生很多中间产物,未腐熟堆肥富含低分子量的有机酸、多酚等抑制紫花苜蓿的生长,而这些物质随着堆肥的进程逐渐被转化或消失,同时也说明接种复合微生物不但能够加速堆体中有机物的降解和无害化[17],也有助于促进苜蓿种子的萌发生长。因此,本研究表明添加微生物菌剂可以使堆肥提前进入高温期,并且腐熟堆肥对紫花苜蓿种子的促生效果显著高于对照。

        试验发现在堆肥腐熟时堆体中总氮的含量均有所增加,但较CK而言,添加微生物菌剂不能有效地提高堆肥产品的总氮含量。究其原因可能是微生物接种剂可加速堆肥温度的升高,导致在升温期总氮以氨气的形式挥发掉较多[18],此外,也有可能与氮素在各种形态 (NO3-N、NO2-N、NO和N2) 间的转换有关[19]。MI中总有机碳含量在堆肥第4~12天从46.67%下降到42.51% (P < 0.05),CK中总有机碳含量差异不显著,究其原因可能是堆体MI中耐高温菌株的含量较高,这个过程中总有机碳被好氧微生物生化降解及同化吸收,生成相对稳定的腐殖质[20],并且MI中在堆肥12天后总有机碳的含量基本稳定。在堆肥结束时,MI和CK的最终pH分别为8.78和8.72 (P > 0.05),而有机肥国家标准NY 525-2012中规定堆肥pH为5.0~8.5,虽然这一数值略高于国家标准NY 525-2012,但较堆肥之初均有所增加,这主要是由于堆肥初期,堆中有较多的有机质,微生物代谢较快,小分子有机酸随堆肥温度的升高挥发所致,如乙酸、丁酸、乙二酸等[21-22];同时,微生物分解含氮有机物产生的氨气会导致堆肥pH升高[6]。此外,在堆肥过程中CK和MI的C/N一直呈降低趋势,就堆肥的第32天而言,堆体MI的C/N大于CK (P < 0.05)。有研究表明,在堆肥过程中C/N受堆体中总氮的影响最大,除去微生物代谢活动消耗的氮素外,部分氮素会以挥发性气体的形式释放出去,致使堆体的C/N值较大[8, 23-24];至堆肥结束时,CK和MI的C/N分别为13.28和15.26,通常C/N是评价堆肥是否腐熟和稳定的重要参考指标,理论上在堆肥腐熟时,堆体的C/N大约在15左右[20]

      • Shannon指数代表了细菌群落多样性程度,Shannon 指数越大,说明群落多样性越高[6]。在堆肥的4~12 天,CK中Shannon指数下降,而MI中Shannon指数增加,Sun等[25]研究表明堆肥过程中细菌群落多样性越高,越有助于细菌群落对堆体的分解,同时多样性高的细菌群落也是筛选堆肥耐高温菌株的理想材料。Observed species在堆肥第12天 (高温期) 时呈现MI大于CK (P < 0.05),这主要是此刻堆体处于高温期,堆体MI中添加的复合微生物Bacillus subtilis sub sp. StercorisBacillus altitudinisBacillus属。Zhao等[18]研究指出,Bacillus属的细菌在高温期通常能够以堆体中难分解的纤维素和果胶等有机物为营养物质进行新陈代谢,促进堆体腐熟和稳定化,这可能是堆体MI中添加复合微生物所致。门水平上,添加复合微生物可使Proteobacteria在堆肥的4~12天含量增加,并且MI中占优势的细菌在堆肥的第4 天为Proteobacteria,通常Proteobacteria的细菌与碳氮代谢有关,可加速堆肥过程中有机物的降解[26-27],究其原因,堆体MI中Acinetobacter pittii属于Proteobacteria门,添加复合微生物促进了Proteobacteria门的大量繁殖。在堆肥的第24天时MI中以Firmicutes (59.8%) 的丰富度最高,而CK中丰富度为17.4%,添加的复合微生物中Bacillus subtilis sub sp. StercorisBacillus altitudinis 两者均为Firmicutes门,表明接种复合微生物可使堆体中Firmicutes大量繁殖,前人[9, 22]研究发现Firmicutes为堆体中的优势菌群,通常在堆肥的高温期Firmicutes可形成耐高温的孢子,具有降解堆肥过程中的半纤维素和木质素的功能,本研究中Firmicutes在堆肥的第24天丰富度最高,说明Firmicutes对堆体MI中难降解的纤维素和木质素大量降解,有助于促进堆体腐熟。此外,虽然复合微生物中没有Actinobacteria门的细菌,但接种微生物菌剂后在堆肥的第24~32天堆体MI中Actinobacteria相对丰富度的变化范围为20.5%~49.0%,而CK为5.6%~31.0%,说明添加复合微生物有助于土著Actinobacteria大量繁殖,Jurado等研究表明Actinobacteria可耐受高温和极端环境,在堆肥的高温期不会被杀死[28]。也有研究表明在堆肥的不同阶段接种Actinobacteria可以加速有机质的降解和堆肥产品的快速腐熟和稳定,同时也是降解纤维素和缩短堆肥进程的一种途径[18]

        在属水平上研究表明,在堆肥第4天,堆体MI中Acinetobacter的丰富度剧烈增加,变化范围为2.2%~48.7%,这是由于微生物接种剂中的Acinetobacter pittiiAcinetobacter属,Acinetobacter pittii的繁殖促使堆体MI中Acinetobacter属的相对丰富度增加,Sanchez等研究表明Acinetobacter能在高温、干旱等恶劣环境中形成孢子,因此Acinetobacter在堆肥过程中对有机基质的分解有很好的作用[29];堆体CK和MI中Flavobacterium的相对丰富度在堆肥的第12天分别为22.7%和21.7%,其含量基本不变,虽然添加微生物接种剂对堆体中Flavobacterium的相对丰富度没有影响,但Xi等[30]研究表明Flavobacterium 可加速堆体中难降解的纤维素、半纤维素和木质素的分解,有助于加速堆肥的腐熟,并且Flavobacterium 可耐受堆肥过程中产生的高温,故Flavobacterium属的细菌在堆肥过程中所起的作用不可忽视。

      • 相关性分析表明总氮与菌株 Thermomonospora curvataBacillaceae bacterium NS1.3Ammoniibacillus agariperforansNovibacillus thermophilus 呈显著正相关,这也为猪粪堆肥定向筛选固氮菌株提供了一定的参考。与总有机碳呈正相关的细菌主要有Rummeliibacillus pycnusClostridium butyricumClostridium perfringensSolibacillus silvestrisClostridium disporicum,且与总有机碳呈正相关的菌株均为Firmicutes (厚壁菌门),Firmicutes门的细菌在堆肥过程中具有很强的有机质降解能力[5,31]。此外,试验发现菌株Thermomonospora curvataBacillus thermolactisAmmoniibacillus agariperforansNovibacillus thermophilus均与堆肥的全钾含量显著正相关,而菌株Rummeliibacillus pycnusVagococcus fluvialisAcinetobacter schindleri与全磷的含量显著正相关,这也为筛选优良溶磷解钾菌株提供了理论依据。有研究表明,堆肥过程中堆体的原料不断被微生物分解利用,使堆肥的体积不断减小,堆体中全磷和全钾的相对含量不断增加并达到稳定值,在堆肥腐熟后,全钾和全磷的含量也是评价堆肥质量的重要指标[32]。与种子发芽指数显著正相关的菌株Ammoniibacillus agariperforansBacillus thermolactis,均为Firmicutes门,Li等[5]发现Firmicutes门的菌株可将堆肥中的含氮有机物分解成可供植物吸收利用的氮源,氮源促进了紫花苜蓿的生长。

      • 在本试验条件下,接种微生物菌剂增加并维持堆肥过程中优势门 (Proteobacteria和Firmicutes)、属 (AcinetobacterBacillus) 水平细菌群落的丰度,进而促进了堆肥升温,延长高温期,缩短堆肥周期,增加GI和全磷含量。优势细菌群落Proteobacteria、Firmicutes和Actinobacteria在堆肥的升温期、高温期和腐熟期依次演替。复合微生物菌剂在堆肥的升温期发挥主要作用的为Acinetobacter pittii,高温期为Bacillus subtilis subsp. StercorisBacillus altitudinis,我们建议筛选耐高温细菌时应集中在厚壁菌门 (Firmicutes) 的芽孢杆菌属 (Bacillus)。

    参考文献 (32)

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