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用宏基因组学方法研究绿肥对水稻根际微生物磷循环功能基因的影响

唐治喜 高菊生 宋阿琳 王恩召 司知远 易可可 黄晶 赵士诚 范分良

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用宏基因组学方法研究绿肥对水稻根际微生物磷循环功能基因的影响

    作者简介: 唐治喜E-mail:25280841@qq.com;;†高菊生为共同第一作者,E-mail:gaojusheng@caas.cn;
    通讯作者: 赵士诚, E-mail:zhaoshicheng@caas.cn ; 范分良, E-mail:fanfenliang@caas.cn
  • 基金项目: 国家重点研发计划项目(2016YFD0200109,2016YFD0800707);国家绿肥产业技术体系(CARS-22-G-07,CARS-22-Z09);国家自然科学基金项目(41571297)。

Impact of green manure on microbial phosphorus cycling genes in rice rhizosphere as investigated by metagenomics

    Corresponding author: ZHAO Shi-cheng, E-mail:zhaoshicheng@caas.cn ;FAN Fen-liang, E-mail:fanfenliang@caas.cn
  • 摘要:   【目的】  绿肥对土壤微生物磷循环的影响受到研究者们的广泛关注,但绿肥影响土壤磷循环的微生物机理尚不明确。利用宏基因组学方法剖析长期绿肥还田对土壤磷循环功能微生物的影响,旨在阐明绿肥对土壤磷循环影响的微生物机理,为绿肥的科学利用提供依据。  【方法】  以中国湖南祁阳绿肥及稻草还田定位试验的水稻根际土为材料,利用宏基因组学方法,对土壤微生物DNA进行PE150 (双端读长150 bp) 宏基因组测序,使用MetaWRAP软件中的read_qc模块进行质控,用assembly模块megahit方法进行组装;基于组装的较长序列 (> 1000 bp) 使用Diamond软件的BLASTX和UniProtKB/SWISS-PROT数据库进行序列比对,根据磷活化 (磷酸酯矿化、膦酸酯矿化、无机磷溶解)、磷吸收 (膦酸酯运输、磷酸酯运输和无机磷酸盐运输) 和缺磷诱导响应调控三大类主要磷循环功能相关基因 (重点关注的64个磷循环功能基因) 进行筛选;再利用R语言进一步分析水稻根际土壤中磷循环功能基因相对丰度及其与土壤理化指标之间的关系,阐述绿肥对土壤磷循环功能微生物的影响。  【结果】  土壤pH等9个常规指标在有、无绿肥处理之间均无显著差异。无稻草还田时,绿肥处理对64个磷循环功能基因中的11个相对丰度影响显著,这11个基因广泛分布在除磷酸酯运输及无机磷溶解外的5个功能组中,其中phnA、phnN、phnV等3个基因相对丰度上升,phnI、phnL、glpB、glpO、pitA、phoA、phoP、phoU等8个基因相对丰度下降。而在稻草还田时,绿肥处理仅phnPP基因相对丰度显著降低。相关性分析显示,土壤pH与磷酸酶活性、无机磷溶解基因pqqB、pqqC 、pqqCD、pqq E、pqqF相对丰度呈显著负相关 (P < 0.05);无机磷溶解pqqB、pqqC 、pqqCD、pqq E等4个基因相对丰度分别与有效磷含量、磷酸酶活性以及有机氮含量呈显著正相关 (P < 0.05)。冗余分析 (RDA) 结果表明,绿肥处理通过pH、AP以及磷酸酶活性影响磷循环功能基因。  【结论】  绿肥翻压下水稻根际微生物磷功能基因相对丰度深受稻草还田的影响。与单绿肥或单稻草还田相比,绿肥翻压基础上增加稻草还田对磷循环功能基因影响效果不明显,秸秆甚至减弱了绿肥对磷循环功能基因的影响,其原因可能是绿肥和稻草还田下不同微生物及不同磷循环功能基因之间存在激烈竞争。
  • 图 1  理化指标双因素方差分析

    Figure 1.  Two-way ANOVA of physical and chemical properties

    图 2  磷循环功能基因多样性指数及主成分分析

    Figure 2.  Contrastive analysis of diversity index and PCoA of P-cycle genes

    图 3  磷循环相关各功能基因相对丰度双因素方差分析

    Figure 3.  Two-way ANOVA of relative abundance of microbial phosphorus cycle related genes

    图 4  土壤基础理化指标与磷循环功能基因相对丰度的相关性分析

    Figure 4.  Correlation analysis between basic soil properties and microbial phosphorus cycle related genes

    图 5  土壤基础理化指标及微生物磷循环功能基因相对丰度的冗余分析 (RDA)

    Figure 5.  Redundancy analysis (RDA) between basic soil properties and microbial phosphorus cycle related genes

    表 1  微生物磷循环功能基因

    Table 1.  Microbial phosphorus cycle related genes

    功能分组及编码蛋白
    Functional groups and protein
    基因
    Gene
    KEGG编号KO酶编号
    EC
    参考文献
    References
    磷养分活化Phosphorus activation
    磷酸酯矿化Phosphate ester mineralization
    甘油磷酸酯磷酸二酯酶Glycerophosphoryl diester phosphodiesteraseugpQK011263.1.4.46[18]
    周质甘油磷酸酯磷酸二酯酶Periplasmic glycerophosphoryl diester phosphodiesteraseglpQK011263.1.4.46[19]
    磷酸三酯酶Phosphotriesterase-related protein/芳基二烷基磷酸酶AryldialkylphosphatasephpK070483.1.8.1[18]
    磷酸三酯酶Phosphotriesterase-related protein/对硫磷水解酶Parathion hydrolaseopd3.1.8.1[20]
    甘油-3-磷酸脱氢酶Glycerol-3-phosphate dehydrogenaseglpAK001111.1.5.3[21]
    甘油-3-磷酸脱氢酶亚单元B Glycerol-3-phosphate dehydrogenase subunit BglpBK00112[22]
    甘油-3-磷酸脱氢酶亚单元C Glycerol-3-phosphate dehydrogenase subunit CglpCK00113[22]
    甘油-3-磷酸脱氢酶Glycerol-3-phosphate dehydrogenaseglpDK00111[23]
    甘油激酶Glycerol kinaseglpKK00864[24]
    甘油吸收促进蛋白Glycerol uptake facilitator proteinglpFK02440[24]
    α-甘油磷酸氧化酶Alpha-glycerophosphate oxidaseglpOK001051.1.3.21[25]
    甘油-3-磷酸调控抑制子Glycerol-3-phosphate regulon repressorglpRK02444[26-27]
    酸性磷酸酶Acid phosphatase (Fungi)phoAK010783.1.3.2[18]
    酸性磷酸酶 (A) Acid phosphatase (class A)phoNK094743.1.3.2[18]
    酸性磷酸酶 (B) Acid phosphatase (class B)aphAK037883.1.3.2[18]
    碱性磷酸酶Alkaline phosphatasephoAK010773.1.3.1[18]
    碱性磷酸酶Alkaline phosphatasephoBK010773.1.3.1[18]
    碱性磷酸酶Alkaline phosphatase DphoDK011133.1.3.1[18]
    4-植酸酶/酸性磷酸酶4-phytase/acid phosphataseappAK010933.1.3.23.1.3.26[18]
    3-植酸酶3-phytasephyAK01083[18]
    膦酸酯矿化 Phosphonate mineralization
    烷基膦酸酯利用操纵子Alkylphosphonate utilization operon proteinphnAK061933.11.1.2[18]
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-02-08
  • 网络出版日期:  2020-10-19
  • 刊出日期:  2020-09-25

用宏基因组学方法研究绿肥对水稻根际微生物磷循环功能基因的影响

    作者简介:唐治喜E-mail:25280841@qq.com
    作者简介:;†高菊生为共同第一作者,E-mail:gaojusheng@caas.cn
    通讯作者: 赵士诚, zhaoshicheng@caas.cn
    通讯作者: 范分良, fanfenliang@caas.cn
  • 1. 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所/农业农村部植物营养与肥料重点实验室,北京 100081
  • 2. 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所/湖南祁阳农田生态系统国家野外科学观测研究站,湖南 426182
  • 3. 中国科学院植物研究所/植被与环境变化国家重点实验室,北京 100093
  • 基金项目: 国家重点研发计划项目(2016YFD0200109,2016YFD0800707);国家绿肥产业技术体系(CARS-22-G-07,CARS-22-Z09);国家自然科学基金项目(41571297)。
  • 摘要:   【目的】  绿肥对土壤微生物磷循环的影响受到研究者们的广泛关注,但绿肥影响土壤磷循环的微生物机理尚不明确。利用宏基因组学方法剖析长期绿肥还田对土壤磷循环功能微生物的影响,旨在阐明绿肥对土壤磷循环影响的微生物机理,为绿肥的科学利用提供依据。  【方法】  以中国湖南祁阳绿肥及稻草还田定位试验的水稻根际土为材料,利用宏基因组学方法,对土壤微生物DNA进行PE150 (双端读长150 bp) 宏基因组测序,使用MetaWRAP软件中的read_qc模块进行质控,用assembly模块megahit方法进行组装;基于组装的较长序列 (> 1000 bp) 使用Diamond软件的BLASTX和UniProtKB/SWISS-PROT数据库进行序列比对,根据磷活化 (磷酸酯矿化、膦酸酯矿化、无机磷溶解)、磷吸收 (膦酸酯运输、磷酸酯运输和无机磷酸盐运输) 和缺磷诱导响应调控三大类主要磷循环功能相关基因 (重点关注的64个磷循环功能基因) 进行筛选;再利用R语言进一步分析水稻根际土壤中磷循环功能基因相对丰度及其与土壤理化指标之间的关系,阐述绿肥对土壤磷循环功能微生物的影响。  【结果】  土壤pH等9个常规指标在有、无绿肥处理之间均无显著差异。无稻草还田时,绿肥处理对64个磷循环功能基因中的11个相对丰度影响显著,这11个基因广泛分布在除磷酸酯运输及无机磷溶解外的5个功能组中,其中phnA、phnN、phnV等3个基因相对丰度上升,phnI、phnL、glpB、glpO、pitA、phoA、phoP、phoU等8个基因相对丰度下降。而在稻草还田时,绿肥处理仅phnPP基因相对丰度显著降低。相关性分析显示,土壤pH与磷酸酶活性、无机磷溶解基因pqqB、pqqC 、pqqCD、pqq E、pqqF相对丰度呈显著负相关 (P < 0.05);无机磷溶解pqqB、pqqC 、pqqCD、pqq E等4个基因相对丰度分别与有效磷含量、磷酸酶活性以及有机氮含量呈显著正相关 (P < 0.05)。冗余分析 (RDA) 结果表明,绿肥处理通过pH、AP以及磷酸酶活性影响磷循环功能基因。  【结论】  绿肥翻压下水稻根际微生物磷功能基因相对丰度深受稻草还田的影响。与单绿肥或单稻草还田相比,绿肥翻压基础上增加稻草还田对磷循环功能基因影响效果不明显,秸秆甚至减弱了绿肥对磷循环功能基因的影响,其原因可能是绿肥和稻草还田下不同微生物及不同磷循环功能基因之间存在激烈竞争。

    English Abstract

    • 土壤中微生物数量巨大,种类繁多,它们不仅参与土壤养分循环,而且与作物健康关系密切,故良好的微生物区系被认为是土壤健康的重要标志[1-2]。近年来,绿肥和秸秆还田对微生物的影响受到国内外学者的重视。研究表明,绿肥及秸秆还田能提高微生物酶活性及土壤碳、氮、磷等养分含量[3-5],增加固氮、硝化及反硝化等氮转化功能微生物[6-7];还能丰富磷活化微生物,提高稻田土壤磷的有效性,促进水稻磷吸收[8]。然而,尽管研究发现绿肥和秸秆能影响磷循环,但绿肥和秸秆还田影响磷循环的微生物机理尚不明确。土壤中参与磷循环的功能微生物种类多,过程复杂,微生物在有机磷矿化、难溶性无机磷溶解以及磷吸收等过程中都有着重要作用[9-10]。已有的关于土壤溶磷微生物或有机磷矿化、无机磷溶解等研究,仅限于一些可培养微生物单个磷循环基因或某类磷循环功能微生物有限的几个功能基因,对实际生产环境中大量的不可培养微生物较少涉及,难以同时研究更大范围不同微生物的磷循环基因或不同微生物的磷循环功能。宏基因组学方法的出现及功能基因参考数据库的完善为磷循环基因方面的研究提供了良好的基础。相对于传统方法,宏基因组学方法避免了PCR扩增导致的错误,不受引物的局限,而且能够更全面地探索已知和未知微生物,尤其在对不可培养微生物的研究中有着绝对优势[11]。然而目前罕见有采用宏基因组学方法研究绿肥和秸秆还田对土壤微生物磷循环功能的影响。

      依托于2012年在中国农业科学院湖南祁阳农田生态系统国家野外科学观测研究站设立的绿肥及稻草还田定位试验,以我国南方典型的水稻土为材料,采用宏基因组学方法,全面分析了长期绿肥和秸秆还田对土壤磷循环功能微生物的影响,旨在阐明绿肥和秸秆还田对土壤磷循环影响的微生物机理,为绿肥和秸秆还田的合理利用提供科学依据。

      • 供试土壤取自祁阳绿肥定位试验点。该试验开始于2012年[12],地点位于湖南省祁阳县文富市镇官山坪中国农业科学院湖南祁阳农田生态系统国家野外科学观测研究站 (26°45′42″N、111°52′32″E),属亚热带气候,年平均气温17.8℃,年平均降水1290 mm。定位试验土壤属于第四纪红色粘土发育的水稻土,0—20 cm土壤初始理化性质:土壤有机质 (SOM) 14.9 g/kg、全氮 1.48 g/kg、有效氮82.4 mg/kg、有效磷12.6 mg/kg。试验田小区面积21 m2 (3 m$\times $7 m),小区之间用水泥埂隔离,试验小区周围种植1 m宽以上的水稻隔离带。所有处理每季在水稻移栽前施用复合肥 (N–P2O5–K2O,18–12–10) 作为基肥,所施用N、P2O5、K2O量分别为135 、90、75 kg/hm2,水稻移栽后6~10天追肥尿素 (N 30 kg/hm2) 和氯化钾 (K2O 15 kg/hm2)。每季水稻总施肥量 (基肥 + 追肥) 为N 165 kg/hm2、P2O5 90 kg/hm2、K2O 90 kg/hm2,绿肥 (紫云英) 种子在晚稻收割前10~15天以37.5 kg/hm2的密度撒播。本研究采样时间为2018早稻灌浆期,选取化肥对照、化肥加紫云英绿肥、化肥加稻草还田和化肥加紫云英加稻草还田4处理,每个处理3次重复。4个处理化肥施用一致,稻草还田为早稻秸秆全部还田,化肥加紫云英和稻草还田处理为在施用基肥和追肥基础上进行早稻秸秆全部还田和冬种紫云英翻压处理,冬种紫云英在早稻插秧前翻压处理;早稻草还田的处理在水稻收割当日进行全部稻草还田。化肥对照和化肥加早稻草还田的两个处理轮作模式为早稻—晚稻—冬闲;化肥加紫云英和化肥加紫云英加早稻草还田的两个处理轮作模式为早稻—晚稻—紫云英。

        水稻根际土取样:在每个3 m$\times $7 m小区边界1 m以内随机选取均匀分布的3株水稻,将整株水稻根系及泥土整体挖出,去除根部以上部分,去除根外围泥土,仅保留根上的附泥。所取到的样品放入干冰盒带回实验室,随后参考Edwards等[13]的方法收集水稻根际土。每个样品取等量的根系放入灭菌三角瓶中,加入50 mL灭菌去离子水,震荡25 min,将土壤混浊液置于50 mL灭菌离心管中,在3000 r/min转速下离心5 min,保留下方沉淀的泥土作为根际土,放入–20℃冰箱保存待用。

      • 土壤pH采用电位法测定,水土比为2.5∶1;土壤有机质采用重铬酸钾外加热法测定;土壤全氮采用开氏消煮法测定;土壤硝态氮 (NO3-N)、铵态氮 (NH4+-N) 采用CaCl2浸提 (水土比为5∶1),其中硝态氮采用双波长比色法,铵态氮采用靛酚蓝比色法测定;土壤有效磷用NaHCO3溶液浸提—钼锑抗比色法进行测定;土壤速效钾采用NH4OAc溶液浸提—火焰光度法进行测定[14]。土壤磷酸酶活性测定的底物为4-甲基伞形酮磷酸酯,用酶标仪测定发光板荧光值[15]

      • 土壤微生物DNA采用FastDNA Spin kit for soil试剂盒提取,每个土壤样品称取0.5 g,提取步骤按照试剂盒说明书进行。提取完成后测定DNA浓度,取2 μg DNA样品备送测序公司进行宏基因组测序,采用Illumina NovaSeq PE150高通量测序平台测序,测序深度为每样品10 GB。

      • 宏基因组序列分析选取软件MetaWRAP1.2[16];先将raw序列数据使用read_qc模块进行质控,默认参数设置Q20,去除得分低于20的低质量序列;再使用Assemble模块megahit方法进行序列的组装得到相对较长的序列数据,默认参数设置 (最低序列长度1000 bp);所得到的较长序列再使用Diamond[17]程序BLASTX将核酸序列与蛋白序列库 (SWISS-PROT) 进行比对,使用序列比对参数为-more-sensitive,e-value 1.0e-20。

      • 本研究关注的基因主要包括磷酸酯矿化、膦酸酯矿化、无机磷溶解等与磷活化相关的基因,还包括膦酸酯运输、磷酸酯运输及无机磷酸盐运输等与磷吸收相关的基因,以及与土壤中无机磷酸盐水平直接相关的缺磷诱导响应调控基因,详细功能分类及参考文献见表1

        表 1  微生物磷循环功能基因

        Table 1.  Microbial phosphorus cycle related genes

        功能分组及编码蛋白
        Functional groups and protein
        基因
        Gene
        KEGG编号KO酶编号
        EC
        参考文献
        References
        磷养分活化Phosphorus activation
        磷酸酯矿化Phosphate ester mineralization
        甘油磷酸酯磷酸二酯酶Glycerophosphoryl diester phosphodiesteraseugpQK011263.1.4.46[18]
        周质甘油磷酸酯磷酸二酯酶Periplasmic glycerophosphoryl diester phosphodiesteraseglpQK011263.1.4.46[19]
        磷酸三酯酶Phosphotriesterase-related protein/芳基二烷基磷酸酶AryldialkylphosphatasephpK070483.1.8.1[18]
        磷酸三酯酶Phosphotriesterase-related protein/对硫磷水解酶Parathion hydrolaseopd3.1.8.1[20]
        甘油-3-磷酸脱氢酶Glycerol-3-phosphate dehydrogenaseglpAK001111.1.5.3[21]
        甘油-3-磷酸脱氢酶亚单元B Glycerol-3-phosphate dehydrogenase subunit BglpBK00112[22]
        甘油-3-磷酸脱氢酶亚单元C Glycerol-3-phosphate dehydrogenase subunit CglpCK00113[22]
        甘油-3-磷酸脱氢酶Glycerol-3-phosphate dehydrogenaseglpDK00111[23]
        甘油激酶Glycerol kinaseglpKK00864[24]
        甘油吸收促进蛋白Glycerol uptake facilitator proteinglpFK02440[24]
        α-甘油磷酸氧化酶Alpha-glycerophosphate oxidaseglpOK001051.1.3.21[25]
        甘油-3-磷酸调控抑制子Glycerol-3-phosphate regulon repressorglpRK02444[26-27]
        酸性磷酸酶Acid phosphatase (Fungi)phoAK010783.1.3.2[18]
        酸性磷酸酶 (A) Acid phosphatase (class A)phoNK094743.1.3.2[18]
        酸性磷酸酶 (B) Acid phosphatase (class B)aphAK037883.1.3.2[18]
        碱性磷酸酶Alkaline phosphatasephoAK010773.1.3.1[18]
        碱性磷酸酶Alkaline phosphatasephoBK010773.1.3.1[18]
        碱性磷酸酶Alkaline phosphatase DphoDK011133.1.3.1[18]
        4-植酸酶/酸性磷酸酶4-phytase/acid phosphataseappAK010933.1.3.23.1.3.26[18]
        3-植酸酶3-phytasephyAK01083[18]
        膦酸酯矿化 Phosphonate mineralization
        烷基膦酸酯利用操纵子Alkylphosphonate utilization operon proteinphnAK061933.11.1.2[18]

        磷酸酯矿化基因主要包括编码甘油磷酸酯二酯酶的ugpQ、glpQ基因,编码磷酸三酯酶的phpopd基因,编码甘油-3-磷酸脱氢酶的glpABCD基因,编码甘油激酶的glpK基因,编码α-甘油磷酸氧化酶的glpO基因,编码膦酸酯转运系统调控蛋白的phnF基因,编码磷酸酯抑制子蛋白的glpR基因,编码酸性磷酸酶的phoA、phoN、aphA基因,编码碱性磷酸酶的phoA、phoB、phoD基因,编码3-植酸酶的phyA基因和在不同环境下编码产物具有4-植酸酶活性或酸性磷酸酶活性的appA双功能基因。

        膦酸酯矿化基因主要包括编码碳-磷键裂解复合蛋白膦酸酯酶的phnA、phnF、phnG、phnH、phnI、phnJ、phnL、phnM、phnN、phnO、phnP 、phnPP、phn W、phnX基因。

        无机磷溶解基因主要包括编码参与土壤中无机多聚磷酸盐溶解的吡咯喹啉醌合成或转运蛋白的pqqA、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE、pqqF基因,以及分别编码无机焦磷酸酶、多聚磷酸盐激酶、外切多聚磷酸酶的ppappkppx基因。

        膦酸酯运输基因主要包括编码膦酸酯运输系统蛋白的phnC、phpD、phpE基因,以及分别编码膦酸酯运输系统ATP结合蛋白和渗透蛋白的phnK、phnV基因。

        磷酸酯运输基因主要包括编码甘油-3-磷酸酯等有机磷酸酯转运系统蛋白的ugpB、ugpA、ugpE、ugpC[36]基因和glpP、glpT基因。

        无机磷酸盐运输基因主要包括编码低亲和度无机磷酸盐运输蛋白的pitA、pitB基因和高亲和力无机磷酸盐运输系统的pstS、pstC、pstA、pstB基因。

        缺磷诱导响应调控基因主要包括编码磷缺乏诱导调控蛋白的phoB、phoR、phoP、phoU基因。

        这些功能基因部分会共同作用或相互抑制,并在缺磷或富磷条件下作用于相应过程功能蛋白,且在不同微生物中相互作用的基因也不一样。如phoB、phoR及phoP、phoR编码蛋白PhoB、PhoR及PhoP、PhoR是典型两组分调控系统,分别存在于革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌中[37],在磷缺乏时参与多个相关基因的过程控制,phoP/Q编码蛋白PhoPQ也是受土壤离子浓度控制的两基因调控系统[38-39];另外glpP、glpR基因编码蛋白在不同条件下分别对相应磷酸酯矿化功能过程起着调控作用[40]

        表1中功能名称、功能基因名称以及相关酶EC编号从SWISS-PROT数据库 (现UniProt reviewed部分) 中进行搜索和整理,对KO (KEGG Orthology) 编号与KEGG数据库进行再次对应确认,按基因编码的蛋白酶功能及EC编号进行功能分组,对应的功能基因蛋白序列数据及蛋白序列记录名称整理成fasta格式,再转换成Diamond版本0.9.24[17]工具所需的数据库格式。所收集的磷循环功能基因数据库作为功能基因序列比对和比对结果筛选的依据 (基因名称、KO、EC、功能描述保持一致)。

      • 直接统计序列比对中所有功能基因的频率之和。再从序列比对结果中提取与表1中名称、蛋白、KO及EC编码相同的磷循环功能基因,分别统计各个基因出现频率;将各磷循环功能基因频率与样品中所有功能基因频率之和的比值作为单个功能基因在样品中的相对丰度。统计结果用于进一步的统计分析。

        采用R语言 (R-3.5.2) 进行数据分析,土壤理化性质采用stats包的aov命令进行双因素方差分析,采用agricolae包的LSD test命令进行多重比较分析,采用vegan包的diversity命令进行多样性指数计算,采用vegan包的rda命令进行PCoA和RDA分析;采用R语言ggplot2包作图。

      • 图1显示,各处理之间理化指标无显著性差异,单绿肥处理土壤中有效磷含量和磷酸酶活性平均值最高[41-42],由于变异大,总体上也未达到显著差异水平。单因素方差分析结果仅发现土壤有机氮含量在单化肥处理与化肥 + 紫云英 + 稻草复合处理之间的差异显著;其他指标在各单因素处理之间均未发现显著性差异。

        图  1  理化指标双因素方差分析

        Figure 1.  Two-way ANOVA of physical and chemical properties

      • 基于功能基因的相对丰度进一步分析了各处理磷循环相关功能基因的多样性指数 (图2),其结果显示,在无稻草还田条件下,绿肥处理对磷循环功能基因的多样性指数—香农指数 (图2A) 和辛普森指数 (图2B) 影响不明显;而在稻草还田条件下,有无绿肥处理间磷循环功能基因的多样性指数香农指数差异不显著,而辛普森指数呈显著性差异。

        图  2  磷循环功能基因多样性指数及主成分分析

        Figure 2.  Contrastive analysis of diversity index and PCoA of P-cycle genes

        从PCoA分析 (图2C) 来看,在有、无稻草还田的条件下,有无绿肥处理之间距离均分布较近,分布区叠加明显。绿肥处理组间差异不显著。

      • 对各基因进行方差分析 (图3),无稻草还田条件下,绿肥处理对磷循环基因的相对丰度具有显著影响,绿肥处理与无绿肥处理之间有11个基因相对丰度差异显著,其中phnA、phnN、phnV等3个基因相对丰度上升,glpB、glpO、phnI、phnL、pitA、phoA、phoP、phoU等8个基因相对丰度下降;在稻草还田条件下,绿肥与无绿肥处理间仅phnPP的相对丰度差异显著。

        图  3  磷循环相关各功能基因相对丰度双因素方差分析

        Figure 3.  Two-way ANOVA of relative abundance of microbial phosphorus cycle related genes

      • 图4显示,土壤理化性质分别与aphA等35个不同基因相对丰度呈显著或极显著相关;土壤pH与磷酸酶活性呈显著负相关,与无机磷溶解基因pqqC、pqqE、pqqF及有机膦酸酯矿化基因phnI呈显著负相关,与无机磷溶解基因pqqB 、pqqCD (pqqCD为具pqqC及pqqD基因的双功能基因[43]) 呈极显著负相关,与有机磷酸脂UgpBAEC转运系统膜内嵌蛋白编码基因ugpA呈显著正相关;土壤有效磷与有机磷酸脂矿化调控基因glpR和有机磷酸脂UgpBAEC转运系统内嵌蛋白编码基因ugpE呈显著负相关,与有机磷酸酯矿化基因glpD、有机膦酸酯矿化基因phnI以及无机磷溶解基因pqqB、pqqC、pqq CD、pqq E呈显著正相关;土壤铵态氮 (NH4+-N) 与有机磷酸脂矿化调控基因glpR、编码碱性磷酸酶的磷酸酯矿化基因phoA呈显著负相关;土壤硝态氮 (NO3-N) 与有机膦酸酯矿化基因phnP呈显著正相关,与有机磷酸酯矿化基因glpC、glpQ、缺磷响应调控基因phoQ、phoP、phoR呈显著负相关;土壤有机氮 (SON) 与无机磷溶解基因pqqB、pqqF呈显著正相关,与有机磷酸脂UgpBAEC转运系统膜内嵌蛋白编码基因ugpA、ugpE呈显著负相关;土壤有机碳 (SOC) 与磷缺乏响应调控基因phoR、低亲和力无机磷运输基因pitA呈极显著负相关,与编码转录调节蛋白PhoP基因phoP、磷酸酯矿化基因glpA、phoA、膦酸酯矿化基因phnC、无机磷运输系统PstSBAC内膜蛋白基因pstB以及有机磷酸酯运输基因glpF、ugpA、ugpC呈显著负相关;土壤磷酸酶活性 (Phosphatase activity) 与膦酸酯转运功能基因phnF呈显著负相关,与有机磷酸酯矿化基因aphA、glpD、glpK、glpX、编码无机焦磷酸酶的无机磷酸盐溶解基因ppa、多聚磷酸激酶基因ppk、外切焦磷酸酶/鸟苷-5'-三磷酸酶ppx、无机磷酸盐溶解基因pqqB、pqqF、无机磷运输基因pstC、pstS呈显著正相关,与无机磷酸盐溶解基因pqqC、pqqCD、pqqE呈极显著正相关。另外,相同鲜样所提取到的土壤微生物DNA浓度在一定程度上体现了土壤样品中微生物丰度,但DNA浓度仅与膦酸酯矿化基因phnX及无机磷溶解基因pqqF呈极显著正相关。

        图  4  土壤基础理化指标与磷循环功能基因相对丰度的相关性分析

        Figure 4.  Correlation analysis between basic soil properties and microbial phosphorus cycle related genes

        土壤样品理化指标与磷功能基因相对丰度的相关冗余分析 (RDA)结果 (图5) 显示,RDA1和RDA2总解释率分别为31.69%和13.95%。土壤pH、有效磷 (AP)、磷酸酶活性对功能基因相对丰度影响显著,显著性P值分别为0.014、0.040、0.031;土壤有机氮SON对基因相对丰度影响较为显著P = 0.053。

        图  5  土壤基础理化指标及微生物磷循环功能基因相对丰度的冗余分析 (RDA)

        Figure 5.  Redundancy analysis (RDA) between basic soil properties and microbial phosphorus cycle related genes

      • 本研究采用宏基因组学方法研究了绿肥和稻草还田对水稻根际微生物磷循环功能基因相对丰度的影响,重点关注了磷循环功能基因64个,涵盖磷活化 (磷酸酯矿化、膦酸酯矿化、无机磷溶解)、磷吸收 (膦酸酯运输、磷酸酯运输、无机磷酸盐运输) 和磷缺乏诱导响应调控等三大类7个功能组。以往研究主要关注磷动态或磷酸酶活性,目前仅印度学者采用宏基因组学方法研究了有机肥和绿肥对水稻土壤微生物碳氮代谢的影响[44],最近发表的绿肥相关文章也仅关注了12个土壤微生物磷循环相关基因 (phoA、pqqC和EC 3.1.3.8等12个基因)[45]。因此,本研究对象和研究方法两方面均具有较强的新意,且关注的微生物磷循环功能基因比以往研究更全面。

        以往研究表明,磷循环功能基因相对丰度与土壤性质存在紧密的相关性,如洛桑试验站不同土地利用方式土壤碱性磷酸酶基因和半胱氨酸植酸酶基因相对丰度随土壤有机质增加而增加[46],增加土壤氮含量可提高植酸酶基因相对丰度,但降低碱性磷酸酶基因的相对丰度[47],而增加土壤磷含量显著降低了核酸酶、磷脂酶和植酸酶基因相对丰度[48]。而本研究结果中磷循环功能基因的多样性和群落结构 (PCoA结果各处理组间差异不显著) 受绿肥处理影响较小,可能与绿肥处理间土壤理化性质无显著性差异有关;但从单基因水平上还是能检测到11个基因相对丰度在绿肥处理间的显著性差异,以及35个基因与不同土壤理化指标间的显著相关,这得益于我们比以往研究关注了更多的基因,说明用宏基因组学方法同时研究更多相关功能基因更容易,推动更多规律的发现,宏基因组学方法是研究土壤微生物功能基因的有效方法。

        有研究[45]发现,在苹果园种植9年绿肥后,土壤pqqC (编码具有无机磷溶解作用的吡咯喹啉醌生物合成蛋白的基因) 及磷酸酯矿化基因phoA的相对丰度得到了显著提高;而本研究中phoA相对丰度在绿肥处理中显著下降,可能与作物种类 (水稻和苹果树)、绿肥种类 (小寇花和紫云英) 或土壤环境 (旱地和水田) 的不同有关。

        无稻草还田条件下,受绿肥处理影响的11个基因分布在膦酸酯矿化、磷酸酯矿化、膦酸酯运输、无机磷酸盐运输和缺磷响应调控等5个功能组中;其中与膦酸酯矿化相关的phnA、phnN、phnV等3个基因相对丰度上升、phnI、phnL两个基因相对丰度下降,而与磷酸盐矿化相关的glpB、glpO和phoA、与低亲和力无机磷酸盐运输相关的pitA、与磷酸盐浓度水平响应调控相关的phoP、phoU等6个基因相对丰度下降。本研究中受影响基因在除磷酸酯运输及无机磷溶解以外的各类功能组中都有分布,说明绿肥对水稻根际微生物磷循环功能基因影响广泛;不同基因相对丰度上升和下降趋势不一,其结果表明绿肥处理对不同基因的影响不同;本研究中相对丰度差异显著的磷循环功能基因以有机磷矿化为主,说明绿肥主要影响了土壤微生物对膦酸酯和磷酸酯等有机磷的利用。

        与无稻草还田相比,在稻草还田条件下绿肥处理对磷循环功能基因相对丰度影响相对较小,仅phnPP基因达到显著差异,其它11个在无稻草还田条件下受绿肥显著影响的基因,在稻草还田条件下绿肥的影响不显著,说明稻草还田可能减弱了绿肥处理对微生物磷循环相关功能基因的作用。另外,稻草还田条件下绿肥处理提高了磷循环功能基因多样性指数—辛普森指数 (图2B),但是土壤中有效磷等养分含量并无显著增加,反而有下降趋势。其原因可能是有机质输入量或有机质来源种类的增加使磷循环功能基因之间或磷循环与碳氮循环等其他功能微生物以及基因之间的相互作用更加复杂[45, 49];相关研究表明,稻草高碳而低氮磷的输入降低了固氮微生物及相关功能基因的丰度[50],本研究稻草还田减弱绿肥处理对磷循环功能基因影响的原因之一可能也是稻草的高碳而低氮磷的输入。

        已有研究发现土壤pH以5.5左右为临界点,低于5.5时与磷酸酶活性正相关,而高于5.5时与磷酸酶活性负相关[51]。本研究中土壤pH所处范围为5.80~6.43,pH与磷酸酶活性呈显著负相关,与红壤茶园施用生物炭的研究[52]结果一致。本研究结果还显示pH与无机磷溶解功能基因pqqB、pqqC 、pqqCD、pqq E、pqqF等5个基因相对丰度呈显著负相关,土壤有效磷 (AP) 则与pqqB、pqqC 、pqqCD、pqq E等4个基因相对丰度呈正相关,说明土壤pH的降低可能有利于土壤中无机磷的溶解,但也可能会降低土壤磷酸酶活性,因此绿肥处理下磷循环功能基因最终作用效果与土壤pH变化密切相关,绿肥的实际应用中要同时注意土壤pH的变化。

      • 本研究采用宏基因组学方法,分析了绿肥对土壤微生物磷循环相关的主要功能基因的影响,关注的64个磷循环功能基因涵盖了磷活化 (磷酸酯矿化、膦酸酯矿化、无机磷溶解)、磷吸收 (膦酸酯运输、磷酸酯运输、无机磷酸盐运输基因) 和缺磷诱导响应调控三大类7个功能组,其中11个基因相对丰度受绿肥的影响显著,35个基因相对丰度与土壤不同理化性质显著或极显著相关。与单绿肥处理或单稻草还田处理相比,绿肥翻压基础上增加稻草还田对磷循环功能基因影响效果不明显,秸秆甚至减弱了绿肥处理对磷循环功能基因的影响,其原因可能是由于绿肥和稻草还田不同微生物及不同磷循环功能基因之间存在激烈地竞争。

    参考文献 (52)

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