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甘蔗宿根矮化病感病植株氮磷钾吸收量、根系生长与内生细菌群落的变化

杨尚东 任奎瑜 谭宏伟

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甘蔗宿根矮化病感病植株氮磷钾吸收量、根系生长与内生细菌群落的变化

    作者简介: 杨尚东 Tel:0771-3235612;E-mail:ysd706@gxu.edu.cn;
    通讯作者: 谭宏伟, E-mail:hongwei_tan@163.com
  • 基金项目: 国家自然科学基金项目(31760368);广西壮族自治区农业科学院广西甘蔗遗传改良重点实验室开放课题 (16-K-04-01);国家重点研发计划项目(2018YFD0201100,2018YFD0201103);国家糖料产业技术体系岗位(甘蔗宿根栽培) 2017—2020(CARS-170206);广西创新驱动发展专项(桂科AA17202042);广西甘蔗产业创新团队甘蔗栽培岗资助。

Changes of root growth, endophytic bacteria community and absorptivity of nitrogen, phosphorus, potassium in canes infected ratoon stunting disease

    Corresponding author: TAN Hong-wei, E-mail:hongwei_tan@163.com
  • 摘要:   【目的】  分析甘蔗宿根矮化病 (Ratoon Stunting Disease, RSD) 感病植株与非感病植株不同部位氮、磷、钾吸收量、根系生长和内生细菌群落结构特征,旨在探明甘蔗宿根矮化病的感染与危害机制,为构建生态防控RSD栽培管理技术体系,生态防控RSD提供理论依据。  【方法】  以甘蔗RSD感病植株为试材,非感病植株为对照,采集甘蔗RSD感病植株和非感病植株叶片、根系和茎部组织为样品,利用传统和现代高通量测序技术分析了甘蔗RSD感病植株和非感病植株叶片、茎中氮、磷、钾含量,根系生长以及内生细菌群落结构特征。  【结果】  甘蔗RSD感病植株不同部位氮、磷、钾吸收量显著低于RSD非感病植株;而且RSD感病植株根长、总根表面积、总根体积和根尖数等反映植株根系生长状况的指标,以及指示植株内生细菌多样性的Shannon指数显著低于RSD非感病植株;同时,Simpson指数显著高于相应的RSD非感病植株;基于门分类水平,RSD感病植株内生细菌的部分优势菌门,诸如绿弯菌门 (Chloroflexi) 和酸杆菌门 (Acidobacteria) 细菌的丰度占比急剧增加,而厚壁菌门 (Firmicutes) 和门分类水平中属于其它 (other) 菌门分类分类的细菌占比下降;属分类水平,RSD感病植株内生细菌部分优势菌属的丰度占比、排位顺序与对照相比,发生了显著变化,而且诸如Pseudarthrobacter、红游动菌属 (Rhodoplanes) 等部分优势菌属缺失。  【结论】  甘蔗罹患RSD病后,根长、总根表面积、总根体积和根尖数均显著下降,致使植株氮、磷、钾吸收量显著降低。氮、磷、钾吸收量的减少,尤其是钾元素吸收量的急剧下降,又会影响RSD感病植株的生长,最终导致甘蔗产量和品质下降。与非感病植株相比,RSD感病植株内生细菌多样性下降、特有内生细菌优势菌属和菌种数量减少是甘蔗植株抗性降低、罹患RSD的重要原因。与非感病植株相比,RSD感病植株内生细菌的部分优势菌门的丰度发生了显著变化,诸如绿弯菌门 (Chloroflexi) 和酸杆菌门 (Acidobacteria) 细菌的丰度占比急剧增加,而厚壁菌门 (Firmicutes) 和属于门分类水平中其它 (other) 分类水平的细菌占比下降。非感病植株相比,RSD感病植株内生细菌部分优势菌属的丰度占比、排位顺序也发生了显著变化,诸如Pseudarthrobacter、红游动菌属 (Rhodoplanes) 等部分非感病植株中丰度占比大于1%的优势菌属缺失。
  • 图 1  甘蔗植株样品的采集

    Figure 1.  Collection of sugarcane samples

    图 2  宿根矮化病感病植株 (A) 和非感病植株 (B) 内生细菌门分类水平细菌组成

    Figure 2.  Composition of Endophytic bacteria in RSD infected (A) and non-infected (B) sugarcane plants at the Phylum level

    图 3  宿根矮化病感病(A)和非感病植株(B)内生细菌属分类水平细菌组成

    Figure 3.  Composition of Endophytic bacteria in RSD infected (A) and non-infected (B) sugarcane roots at the Genus level

    图 4  宿根矮化病感病和非感病植株内生细菌属分类(A)水平和种分类(B)水平Venn图

    Figure 4.  Venn diagram of the endophytic bacteria at genus (A) and species levels (B) in RSD infected and non-infected sugarcane plants

    表 1  测序类型与引物序列名称

    Table 1.  Sequencing type and primer sequence

    测序类型
    Sequencing type
    引物名称
    Prime name
    引物序列
    Prime sequence
    长度
    Length
    测序平台
    Sequencing platform
    植物内生细菌799F5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′593 bpMiseqPE250
    Endophytic bacteria1392R5′-ACGGGCGGTGTGTRC-3′
    799F5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′394 bp
    1193R5′-ACGTCATCCCCACCTTCC-3′
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    表 2  甘蔗RSD感病和非感病植株茎叶氮、磷、钾含量 (g/kg)

    Table 2.  The contents of N,P and K in leaves and stems of RSD infected and non-infected sugarcanes

    植株样品
    Plant sample
    NPK
    叶Leaf茎Stem叶Leaf茎Stem叶Leaf茎Stem
    非感病株Non-infected13.44 ± 3.08 a8.48 ± 4.77 a1.68 ± 0.32 a1.06 ± 0.61 a13.85 ± 1.67 a10.84 ± 3.26 a
    感病株Infected7.76 ± 3.45 b4.15 ± 3.57 b1.09 ± 0.32 b0.70 ± 0.48 b4.28 ± 1.32 b3.57 ± 2.36 b
    注(Note):表中数据为平均值 ± 标准差 Data in the table are means ± SD; 数据后不同小写字母表示感病株和非感病株之间差异显著 (P < 0.05) Values followed by different small letters mean significant difference between the infected and non-infected plants at P < 0.05.
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    表 3  甘蔗RSD感病株和非感病株根系生长指标

    Table 3.  Root growth indexes of RSD infected and non-infected sugarcanes

    植株样品
    Plant sample
    根长 (cm)
    Root length
    总根表面积 (cm2)
    Root surf area
    总根体积 (cm3)
    Root volume
    根尖数
    Root tips
    非感病株Non-infected5.21 ± 0.245 a0.38 ± 0.015 a22.45 ± 0.96 a9.28 ± 1.96 a
    感病株Infected3.27 ± 0.407 b0.30 ± 0.007 b16.90 ± 1.01 b4.36 ± 0.60 b
    注(Note):表中数据为平均值 ± 标准差 Data in the table are means ± SD; 数据后不同小写字母表示感病株和非感病株之间差异显著 (P < 0.05) Values followed by different small letters mean significant difference between the infected and non-infected plants at P < 0.05.
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    表 4  甘蔗宿根矮化病感病植株和非感病植株内生细菌多样性指数

    Table 4.  Diversity index of bacteria in rhizosphere soils of RSD infected and non-infected sugarcanes

    植株样品Plant sampleOTUChao1ShannonSimpson
    非感病株non-infected455.4 ± 45.5 a600.6 ± 34.7 a5.16 ± 0.11 a0.01 ± 0.003 b
    感病株Infected504.0 ± 58.9 a644.2 ± 61.5 a4.90 ± 0.07 b0.02 ± 0.004 a
    注(Note):表中数据为平均值 ± 标准差 Data in the table are means ± SD; 数据后不同小写字母表示感病株和非感病株之间差异显著 (P < 0.05) Values followed by different small letters mean significant difference between the infected and non-infected plants at P < 0.05.
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    [15] 韦莉萍李杨瑞杨丽涛 . 钼对甘蔗体内固氮菌的固氮酶活性的影响. 植物营养与肥料学报, doi: 10.11674/zwyf.2007.0120
    [16] 郑青松杨文杰刘兆普刘玲王晓亮 . 外源氯处理对向日葵幼苗生长、养分吸收及植株硝态氮含量的影响. 植物营养与肥料学报, doi: 10.11674/zwyf.2007.0628
    [17] 王月章永松方萍林咸永都韶婷 . 不同供磷状况下CO2浓度升高对番茄根系生长及养分吸收的影响. 植物营养与肥料学报, doi: 10.11674/zwyf.2007.0517
    [18] 宋珍霞高明关博谦许安定代先强 . 硼对烤烟干物质积累和养分吸收的动态模拟. 植物营养与肥料学报, doi: 10.11674/zwyf.2006.0418
    [19] 周开兵郭文武夏仁学王贵元沈婷 . 不同砧木对脐橙幼树生长和叶片养分含量变化的影响. 植物营养与肥料学报, doi: 10.11674/zwyf.2004.0620
    [20] 宋世文曹享云耿明建刘武定皮美美 . 对缺硼反应不同的油菜品种根系生长特性研究. 植物营养与肥料学报, doi: 10.11674/zwyf.2000.0212
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  • 收稿日期:  2020-03-27

甘蔗宿根矮化病感病植株氮磷钾吸收量、根系生长与内生细菌群落的变化

    作者简介:杨尚东 Tel:0771-3235612;E-mail:ysd706@gxu.edu.cn
    通讯作者: 谭宏伟, hongwei_tan@163.com
  • 1. 广西大学农学院,广西南宁 530004
  • 2. 广西农业科学院,广西甘蔗遗传改良重点实验室,广西南宁 530007
  • 基金项目: 国家自然科学基金项目(31760368);广西壮族自治区农业科学院广西甘蔗遗传改良重点实验室开放课题 (16-K-04-01);国家重点研发计划项目(2018YFD0201100,2018YFD0201103);国家糖料产业技术体系岗位(甘蔗宿根栽培) 2017—2020(CARS-170206);广西创新驱动发展专项(桂科AA17202042);广西甘蔗产业创新团队甘蔗栽培岗资助。
  • 摘要:   【目的】  分析甘蔗宿根矮化病 (Ratoon Stunting Disease, RSD) 感病植株与非感病植株不同部位氮、磷、钾吸收量、根系生长和内生细菌群落结构特征,旨在探明甘蔗宿根矮化病的感染与危害机制,为构建生态防控RSD栽培管理技术体系,生态防控RSD提供理论依据。  【方法】  以甘蔗RSD感病植株为试材,非感病植株为对照,采集甘蔗RSD感病植株和非感病植株叶片、根系和茎部组织为样品,利用传统和现代高通量测序技术分析了甘蔗RSD感病植株和非感病植株叶片、茎中氮、磷、钾含量,根系生长以及内生细菌群落结构特征。  【结果】  甘蔗RSD感病植株不同部位氮、磷、钾吸收量显著低于RSD非感病植株;而且RSD感病植株根长、总根表面积、总根体积和根尖数等反映植株根系生长状况的指标,以及指示植株内生细菌多样性的Shannon指数显著低于RSD非感病植株;同时,Simpson指数显著高于相应的RSD非感病植株;基于门分类水平,RSD感病植株内生细菌的部分优势菌门,诸如绿弯菌门 (Chloroflexi) 和酸杆菌门 (Acidobacteria) 细菌的丰度占比急剧增加,而厚壁菌门 (Firmicutes) 和门分类水平中属于其它 (other) 菌门分类分类的细菌占比下降;属分类水平,RSD感病植株内生细菌部分优势菌属的丰度占比、排位顺序与对照相比,发生了显著变化,而且诸如Pseudarthrobacter、红游动菌属 (Rhodoplanes) 等部分优势菌属缺失。  【结论】  甘蔗罹患RSD病后,根长、总根表面积、总根体积和根尖数均显著下降,致使植株氮、磷、钾吸收量显著降低。氮、磷、钾吸收量的减少,尤其是钾元素吸收量的急剧下降,又会影响RSD感病植株的生长,最终导致甘蔗产量和品质下降。与非感病植株相比,RSD感病植株内生细菌多样性下降、特有内生细菌优势菌属和菌种数量减少是甘蔗植株抗性降低、罹患RSD的重要原因。与非感病植株相比,RSD感病植株内生细菌的部分优势菌门的丰度发生了显著变化,诸如绿弯菌门 (Chloroflexi) 和酸杆菌门 (Acidobacteria) 细菌的丰度占比急剧增加,而厚壁菌门 (Firmicutes) 和属于门分类水平中其它 (other) 分类水平的细菌占比下降。非感病植株相比,RSD感病植株内生细菌部分优势菌属的丰度占比、排位顺序也发生了显著变化,诸如Pseudarthrobacter、红游动菌属 (Rhodoplanes) 等部分非感病植株中丰度占比大于1%的优势菌属缺失。

    English Abstract

    • 甘蔗宿根栽培是甘蔗生产中一项重要的技术措施,其不仅可节省大量劳力成本,而且还能节约蔗种,很受生产者欢迎。但是,随着宿根种植年限的延长极易发生甘蔗宿根矮化病[1]。据调查,2018—2019年榨季广西甘蔗栽培面积达44.9万hm2中,占比近40%的主栽品种新台糖22 (ROC22) 宿根矮化病 (ratoon stunting disease,RSD) 发生严重,检出率达80.8%。甘蔗感染RSD后,植株矮化、蔗茎变细、生长缓慢、分蘖少、生长迟滞,一般可导致感病品种新植蔗减产10%~15%,宿根蔗减产20%~25%,尤其干旱条件下感病品种的宿根蔗产量损失可达60%以上[2-4],严重威胁着蔗糖产业的可持续发展。

      近年来,有关甘蔗与RSD病原菌的互作,以及病原菌侵染机制研究方兴未艾。研究已发现:蔗茎维管组织中的韧皮部和木质部的损坏、Lxx菌量由蔗茎基层至尾层呈现递减的趋势[5];甘蔗茎和叶片中防御性酶,如过氧化氢酶 (CAT)、超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化物酶 (POD)、抗坏血酸过氧化物酶 (APX)、谷胱甘肽还原酶 (GR) 活性均有所提高[6];油菜素内酯合成蛋白、NBS-LRR (Nucleotide Binding Site,NBS;Leucine-Rich Repeats,LRR) 类抗性蛋白、茉莉酸诱导蛋白、α-微管蛋白、脱落酸 (ABA) 胁迫成熟蛋白、富含脯氨酸蛋白、翻译起始因子eif-2b α亚族等可能参与了甘蔗RSD病原菌的互作[7],以及RSD感病植株根际土壤肥力降低、细菌多样性下降以及优势细菌门属占比发生剧变是甘蔗RSD感病植株根际环境的重要特征[8]等。这些研究分别从甘蔗的组织形态变化、保护性酶活性、功能基因以及根际土壤肥力和微生物多样性角度揭示了甘蔗植株与RSD病原菌的互作机制,以及甘蔗RSD发病条件与环境特征等。但甘蔗罹患RSD后,出现植株矮化、蔗茎变细、生长缓慢、分蘖少等危害症状的形成机制鲜见报道。

      根系是作物吸收养分的主要器官,评价根系生长,包括诸如侧根的数量、长度等根系形态、分布以及生长角度等均是指示根系生长的重要指标[9-10]。生长良好的根系不仅可以提高根系对土壤养分和水分利用的效率,而且在抗病性[11-12]方面也发挥着重要的作用。另一方面,植物内生微生物与植株抗性 (抗病、非生物胁迫等) 等方面不仅联系紧密,而且研究具有重要的科学意义,但相关的研究至今仍相对薄弱[13-14]

      因此,本文通过分析甘蔗RSD感病植株的根系生长状况、植株内生细菌群落以及氮磷钾吸收量的变化,探究甘蔗感染RSD后危害症状的形成机制,旨在为改良甘蔗产区土壤环境、改进栽培管理技术措施、减轻RSD危害和生态防控RSD提供理论依据和技术支撑。

      • 甘蔗植株及根系样品采集于本课题组长期定位试验区,广西柳州市柳江区农场 (E109°27′06″ N24°43′40″),甘蔗品种为‘桂糖42号’ (GT42)。甘蔗植株采集样品为长期定位试验区内已连续栽培三年的宿根蔗栽培区,常规相同栽培管理。2018年10月于三年宿根蔗栽培区随机采集甘蔗植株样品共36株。采集植株样品时,先用75%乙醇消毒液喷洒铁铲进行消毒。然后以蔗茎为中心 (直径约60 cm) 挖深度约40 cm,形成疏松、环形的根区圈。然后用手紧握蔗茎基部,用力将蔗茎连根带土拔起 (图1),装入事先准备好的无菌塑料袋中带回实验室进行RSD鉴定。RSD鉴定完成后,获得21株甘蔗感染RSD,15株没有感染RSD植株样品。随机选取RSD感病植株和非感病植株5株分别进行不同植株部位氮、磷、钾含量,以及根系生长和植株内生细菌多样性的测定。

        图  1  甘蔗植株样品的采集

        Figure 1.  Collection of sugarcane samples

      • 随机选取RSD感病植株和非感病植株相同部位茎端和叶片,清洗擦干后放入烘箱于105℃杀青30 min,65℃烘干72 h后用微型粉碎机粉碎相应样品,过筛后装入封口袋中备用。甘蔗茎和叶片样品的消煮,以及样品中氮、磷、钾含量的测定均分别按照鲍士旦的方法[15],即,植物常量元素测定中的凯氏定氮法、钼蓝比色法和火焰光度计法进行测定。

      • 随机选取RSD感病植株和非感病植株各5株,用流水缓慢冲洗根系,在根系下面放置0.15 mm的筛子,收集被水流冲掉的根系。用根系扫描仪 (Founder Z2400) 获取根系图像,以WinRHIZO Pro 2009c分析根长、根表面积、根体积、根尖数等形态指标[16],取5个数据的平均值进行方差和显著性分析。

      • 根系样品总DNA的提取、PCR扩增和序列测定由上海美吉生物医药科技有限公司完成,测序具体类型与引物序列[17-18]表1所示。

        表 1  测序类型与引物序列名称

        Table 1.  Sequencing type and primer sequence

        测序类型
        Sequencing type
        引物名称
        Prime name
        引物序列
        Prime sequence
        长度
        Length
        测序平台
        Sequencing platform
        植物内生细菌799F5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′593 bpMiseqPE250
        Endophytic bacteria1392R5′-ACGGGCGGTGTGTRC-3′
        799F5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′394 bp
        1193R5′-ACGTCATCCCCACCTTCC-3′

        测序具体流程:首先将甘蔗根系样品流水下冲洗,除去表面泥沙,室内晾干;然后用70%乙醇溶液表面消毒2 min,无菌水清洗1次;再放入3.25活性次氯酸钠中浸泡15 min,用70%乙醇溶液表面消毒1 min,用无菌水清洗3~5次,备用。根系总DNA提取、测定试剂及测定方法按照E.Z.N.A.®soil试剂盒 (OmegaBio-tek,Norcross,GA,U.S.) 说明书进行。DNA浓度和纯度利用NanoDrop2000进行检测。即,DNA提取质量利用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测,并以提取的植物内生微生物DNA为模板,选择用799F和1192R引物对V5—V7可变区进行第一轮PCR扩增,选择用799F和1193R引物对V5—V7可变区进行第二轮PCR扩增。PCR扩增在ABIGeneAmp®9700上进行。

        PCR产物使用2%琼脂糖凝胶进行回收,并利用Axy Prep DNA Gel Extraction Kit (Axy gen Biosciences,Union City,CA,USA) 进行纯化。利用Quanti Fluor™-ST (Promega,USA) 进行检测定量。基于IlluminaMiSeq平台 (Illumina,SanDiego,USA) 标准操作规程,将纯化后的扩增片段构建文库。利用Illumina公司的MiseqPE250平台进行测序 (上海美吉生物医药科技有限公司)。原始测序序列使用Trimmomatic软件质控和FLASH软件进行拼接:设置50 bp的窗口,去除质控后长度低于50 bp的序列;根据重叠碱基overlap将两端序列进行拼接;根据序列首尾两端的barcode和引物将序列拆分至每个样本;使用UPARSE软件 (version 7.1 http://drive5.com/uparse/) 根据97%的相似度对序列进行OTU聚类,并在聚类的过程中去除单序列和嵌合体,利用RDP classifier (http://rdp.cme.msu.edu/) 对每条序列进行物种分类注释,比对Silva数据库 (SSU123),获得分类学信息和各个样本在各分类水平上的群落组成,用图形进行可视化表示。使用软件进行OTU丰度和Alpha多样性计算,得到样品物种信息。本文用Chao1指数[19]、Simpson指数[20]和Shannon指数[21]分析甘蔗RSD感病和非感病植株内生细菌多样性。Chao1指数来表示物种丰富度;Shannon指数和Simpson指数用于估算样本中微生物多样性。

      • 试验数据采用Excel 2010进行计算,采用SPSS 19.0软件进行方差分析,采用邓肯 (Duncan) 法进行显著性检验 (P < 0.05)。使用R语言工具进行微生物多样性数据统计及绘制样品各分类水平下的群落结构柱形图和维恩图。

      • 甘蔗RSD感病植株叶片、茎中的氮、磷、钾含量均显著低于非感病植株,其中叶片和茎中氮含量较非感病株分别减少了42.3%和51.1%,磷含量分别减少了35.1%和34.0%,钾含量分别减少了69.1%和67.1% (表2)。表明甘蔗植株罹患RSD后,植株吸收氮、磷、钾的能力显著下降,三种元素中以钾的吸收量下降程度最大,叶片和茎对钾的吸收量均不足非感病株相应部位的50%。

        表 2  甘蔗RSD感病和非感病植株茎叶氮、磷、钾含量 (g/kg)

        Table 2.  The contents of N,P and K in leaves and stems of RSD infected and non-infected sugarcanes

        植株样品
        Plant sample
        NPK
        叶Leaf茎Stem叶Leaf茎Stem叶Leaf茎Stem
        非感病株Non-infected13.44 ± 3.08 a8.48 ± 4.77 a1.68 ± 0.32 a1.06 ± 0.61 a13.85 ± 1.67 a10.84 ± 3.26 a
        感病株Infected7.76 ± 3.45 b4.15 ± 3.57 b1.09 ± 0.32 b0.70 ± 0.48 b4.28 ± 1.32 b3.57 ± 2.36 b
        注(Note):表中数据为平均值 ± 标准差 Data in the table are means ± SD; 数据后不同小写字母表示感病株和非感病株之间差异显著 (P < 0.05) Values followed by different small letters mean significant difference between the infected and non-infected plants at P < 0.05.
      • 甘蔗RSD感病植株的根系生长显著低于非感病植株 (表3),根长减少了37.2%,总根表面积减少了21.1%,总根体积减少了24.7%,根尖数减少了53.0% (表3)。这一结果表明甘蔗罹患RSD后植株根系生长受到严重抑制。

        表 3  甘蔗RSD感病株和非感病株根系生长指标

        Table 3.  Root growth indexes of RSD infected and non-infected sugarcanes

        植株样品
        Plant sample
        根长 (cm)
        Root length
        总根表面积 (cm2)
        Root surf area
        总根体积 (cm3)
        Root volume
        根尖数
        Root tips
        非感病株Non-infected5.21 ± 0.245 a0.38 ± 0.015 a22.45 ± 0.96 a9.28 ± 1.96 a
        感病株Infected3.27 ± 0.407 b0.30 ± 0.007 b16.90 ± 1.01 b4.36 ± 0.60 b
        注(Note):表中数据为平均值 ± 标准差 Data in the table are means ± SD; 数据后不同小写字母表示感病株和非感病株之间差异显著 (P < 0.05) Values followed by different small letters mean significant difference between the infected and non-infected plants at P < 0.05.
      • 利用云分析平台,计算各个样品的丰富度和多样性指数。丰富度Chao1和多样性Shannon 指数越大,Simpson指数越小,说明样品的物种丰富度和多样性越高[21]。由表4可见,感病植株Chao1和OTU指数与非感病植株无显著差异,但Shannon指数显著低于非感病植株,而Simpson指数显著高于RSD非感病植株 (P < 0.05)。表明甘蔗植株感染RSD后,虽然内生细菌丰度没有受到显著影响,但多样性受到显著影响。

        表 4  甘蔗宿根矮化病感病植株和非感病植株内生细菌多样性指数

        Table 4.  Diversity index of bacteria in rhizosphere soils of RSD infected and non-infected sugarcanes

        植株样品Plant sampleOTUChao1ShannonSimpson
        非感病株non-infected455.4 ± 45.5 a600.6 ± 34.7 a5.16 ± 0.11 a0.01 ± 0.003 b
        感病株Infected504.0 ± 58.9 a644.2 ± 61.5 a4.90 ± 0.07 b0.02 ± 0.004 a
        注(Note):表中数据为平均值 ± 标准差 Data in the table are means ± SD; 数据后不同小写字母表示感病株和非感病株之间差异显著 (P < 0.05) Values followed by different small letters mean significant difference between the infected and non-infected plants at P < 0.05.
      • 在门类水平,甘蔗RSD感病植株和非感病植株中优势内生细菌门均为7个 (图2),但RSD感病植株和非感病植株内生细菌的优势细菌门类组成占比存在一定的差异。其中,甘蔗RSD感病植株内生细菌优势门占比大小顺序分别为:放线菌门 (Actinobacteria) 52.77%、变形杆菌门 (Proteobacteria) 21.35%、绿弯菌门 (Chloroflexi) 15.57%、芽单胞菌门 (Gemmatimonadetes) 3.39%、酸杆菌门 (Acidobacteria) 2.66%、厚壁菌门 (Firmicutes) 2.05%、硝化螺旋菌门 (Nitrospirae) 1.35%、其它占0.85%;与之相比,甘蔗RSD非感病植株内生细菌优势菌门组成占比大小和排序均发生了变化,分别为:放线菌门 (Actinobacteria) 57.86%、变形杆菌门 (Proteobacteria) 27.85%、绿弯菌门 (Chloroflexi) 4.72%、芽单胞菌门 (Gemmatimonadetes) 2.93%、厚壁菌门 (Firmicutes) 2.13%、酸杆菌门 (Acidobacteria)1.51%、硝化螺旋菌门 (Nitrospirae) 1.50%、其它占1.94%。由上述结果可知,甘蔗感染RSD后,植株内生细菌的优势菌群在门分类水平数量上没有改变,但绿弯菌门 (Chloroflexi) 细菌占比急剧增加,占比由非感病植株的4.72%急剧升至15.57%,增加了三倍以上;同时,酸杆菌门 (Acidobacteria) 细菌占比亦由非感病植株中的占比1.51%上升至2.66,排序由非感病植株的第六位升至第五位,超过了非感病植株中排在第五位的厚壁菌门 (Firmicutes) 细菌,同时厚壁菌门 (Firmicutes) 细菌亦由非感病植株占比的2.13%下降至2.05%;另一方面,门分类水平下其它 (other) 分类的细菌占比亦由1.94%下降至0.85%。甘蔗RSD感病植株内生细菌优势门分类水平占比以及排序上的变化,可能使甘蔗植株内生细菌相互间存在的拮抗平衡遭到破坏,导致甘蔗植株免疫力降低、抗性减弱。

        图  2  宿根矮化病感病植株 (A) 和非感病植株 (B) 内生细菌门分类水平细菌组成

        Figure 2.  Composition of Endophytic bacteria in RSD infected (A) and non-infected (B) sugarcane plants at the Phylum level

      • 属分类水平,甘蔗RSD感病植株内生细菌优势菌属主要有:JG30-KF-AS9 (13.05%)、嗜酸栖热菌属 (Acidothermus,7.62%)、norank_o_Gaiellales (7.47%)、放线菌属 (norank_c_Actinobacteria,4.70%)、Gaiella (2.98%)、芽单胞菌属 (norank_f_Gemmatimonadaceae,2.90%)、小单孢菌属 (unclassified_f_Micromonosporaceae,2.50%)、norank_f_YNPFFP1 (2.36%)、链霉菌属 (Streptomyces,2.28%)、黄色杆菌属 (norank_f_Xanthobacteraceae,2.02%)、间孢囊菌属 (unclassified_f_Intrasporangiaceae,1.89%)、类诺卡氏菌属 (Nocardioides,1.85%)、Solirubrobacter (1.78%)、norank_f_Elev-16S-1332 (1.72%) 及其它 (others) 占比为26.88% (图3A)。

        图  3  宿根矮化病感病(A)和非感病植株(B)内生细菌属分类水平细菌组成

        Figure 3.  Composition of Endophytic bacteria in RSD infected (A) and non-infected (B) sugarcane roots at the Genus level

        与之相比,同样属分类水平下,甘蔗RSD非感病植株内生细菌优势菌属主要有:类诺卡氏菌属 (Nocardioides,6.61%)、norank_o_Gaiellales (5.78%)、放线菌属 (norank_c_Actinobacteria,5.35%)、Gaiella (4.58%)、Solirubrobacter (3.21%)、小单孢菌属 (unclassified_f_Micromonosporaceae,3.03%)、norank_o_JG30-KF-AS9 (2.80%)、间孢囊菌属 (unclassified_f_Intrasporangiaceae,2.68%)、芽单胞菌属 (norank_f_Gemmatimonadaceae,2.54%)、嗜酸栖热菌属 (Acidothermus,2.38%)、亚硝化单胞菌属 (norank_f_Nitrosomonadaceae,2.05%)、norank_f_YNPFFP1 (1.86%)、Pseudarthrobacter (1.79%)、红游动菌属 (Rhodoplanes,1.71%)、酸微菌属 (norank_o_Acidimicrobiales,1.64%)、norank_f_0319-6M6 (1.60%)、黄色杆菌属 (norank_f_Xanthobacteraceae,1.53%) 及其它 (others) 占比为32.88% (图3B)。

        此外,由属分类水平 (图4A) 以及种分类水平 (图4B) Venn图可知,RSD感病植株和非感病植株内生细菌属分类水平上共有的菌属为235个,感病植株特有的内生细菌属有36个,而非感病植株特有的菌属有49个;另一方面,种分类水平,在RSD感病植株和非感病植株内生细菌共有的菌种为371个,感病植株特有的内生细菌种有66个,而非感病植株特有的内生细菌种达80个,更为丰富的内生细菌种、属分类水平,可能是甘蔗RSD非感病植株没有感染RSD的重要原因。

        图  4  宿根矮化病感病和非感病植株内生细菌属分类(A)水平和种分类(B)水平Venn图

        Figure 4.  Venn diagram of the endophytic bacteria at genus (A) and species levels (B) in RSD infected and non-infected sugarcane plants

        由上述结果可知,与甘蔗RSD非感病植株相比,甘蔗感染RSD后,植株内生细菌优势细菌属的组成占比发生显著变化,如,RSD感病植株中内生细菌优势菌属丰度占比第一的JG30-KF-AS9在非感病植株中占比仅排第七,排在类诺卡氏菌属 (Nocardioides) 等菌属之后,而在甘蔗RSD非感病株中排在第一位的类诺卡氏菌属 (Nocardioides),在感病植株中占比仅有1.85%;另一方面,植株内生细菌部分优势菌属缺失,如Pseudarthrobacter、红游动菌属 (Rhodoplanes) 等,以及其它内生细菌占比下降,内生细菌优势菌属和菌种减少,可能是甘蔗RSD感病植株罹患RSD的重要原因。

      • 甘蔗是一种生物产量高、养分需求大的经济作物,整个生长过程中对钾的需求量最高[22]。缺钾不仅导致甘蔗产量降低,而且蔗糖分含量、蔗汁锤度等反映甘蔗品质的指标下降[23-24]。已有的研究发现,RSD可致甘蔗产量下降5%~30%,严重时可达60%[25];同时,感染RSD的甘蔗植株比健康植株株高下降28.85 cm、茎径减少0.28 cm、节间长度缩短3.50 cm,蔗糖分下降0.9个百分点 (绝对值)[26]。本试验结果亦发现,甘蔗感染RSD后,无论是叶片或茎中的氮、磷、钾含量均显著低于RSD非感病植株的相应部位,而整个植株中氮、磷、钾含量仅分别为健康植株的53.3%、65.5%和31.9%。由此可知,甘蔗感染RSD后对植株钾含量影响最大。同时推断,甘蔗感染RSD后氮、磷、钾吸收量的下降是其产量下降、品质降低的主要诱因。

        另一方面,根系是植物重要的功能器官,植物主要通过根系摄取土壤中的养分和水分满足其生长需求。根系特征是根系在土壤中的空间分布特征,可以反映其对土壤中物质与能量吸收利用的程度及其转化率[27]。根系生长不仅能提高植物对养分的吸收,而且有助于改善植物对逆境的适应能力[28]。本试验中,甘蔗感染RSD后,其根长、总根表面积、总根体积和根尖数仅分别为健康植株的62.8%、78.9%、75.3%和47.0%。由此推测,甘蔗RSD感病植株根系生长形态指标劣化是感病植株其对氮、磷、钾吸收量下降的重要原因。

        微生物是生态系统中最丰富、功能活跃的生物资源库[29]。研究发现,番茄植株根际土壤中芽单胞菌门 (Gemmatimonadetes)、Chlamydiae和厚壁菌门 (Firmicutes) 细菌对病原菌侵染具有快速响应的特性[30],而芽单胞菌门 (Gemmatimonadetes)、Chlamydiae和厚壁菌门 (Firmicutes) 细菌是植物根际中常见的细菌类群[31]。其中,Chlamydiae细菌是专性细胞细菌并且是原生生物的共生者[32],由于其难以通过传统培养方法分析,对其功能作用的认知至今仍十分匮乏;通过施用生物有机肥提高Gemmatimonadetes类群丰度具有抑制香蕉枯萎病的效果[33];麦类连作诱导的土壤抑病性与厚壁菌门 (Firmicutes) 细菌富集有关[34]。本文亦发现甘蔗植株感染宿根矮化病导致植株内生细菌芽单胞菌门 (Gemmatimonadetes) 细菌丰度占比提高,厚壁菌门 (Firmicutes) 细菌丰度占比下降。

        当微生物群落结构丰富、物种越均匀、多样性越高时,对抗病原菌的综合能力就越强[35-36]。本试验基于高通量测序技术,分析RSD感病植株与非感病植株内生细菌群落结构,发现RSD感病植株中,反映内生细菌丰富度的Chao1指数虽然与非感病植株之间无显著差异,但反映细菌多样性的香农 (shannon) 指数显著低于RSD非感病植株,而与香农指数指示作用相反的辛普森 (Simpson) 指数显著高于RSD非感病植株。由此推论,甘蔗植株中内生细菌多样性的下降可能是甘蔗罹患RSD的重要原因。

        此外,植物内生细菌除了有效防治病害[37-38]的发生外,还具有促进植物生长[39-40]的作用。本试验结果发现,甘蔗感染RSD后,感病植株内生细菌的部分优势菌门,诸如绿弯菌门 (Chloroflexi) 和酸杆菌门 (Acidobacteria) 细菌的丰度占比急剧增加,而厚壁菌门 (Firmicutes) 和属于门分类水平其它 (other) 的细菌占比下降,内生细菌门分类水平丰度占比及其排序上的变化,可能使原先在甘蔗健康植株中相互平衡的内生细菌群落受到破坏,导致甘蔗植株免疫力降低、抵御RSD病原菌的能力减弱,从而感染了RSD。

        甘蔗植株感染RSD后,基于属分类水平发现,其内生细菌优势菌属丰度变化比细菌的门分类水平更为显著。与甘蔗RSD非感病植株相比,甘蔗RSD感病植株内生细菌不仅部分优势菌属的丰度占比、排位顺序上发生了显著变化,而且诸如Pseudarthrobacter、红游动菌属 (Rhodoplanes) 等部分在RSD非感病植株中丰度占比大于1%的优势菌属缺失。其中,红游动菌属 (Rhodoplanes) 细菌具有在黑暗厌氧条件下完成反硝化过程进行脱氮的功能[41],而Pseudarthrobacte可从沙漠中分离出来[42],说明其可能具有较强的耐旱、耐紫外线照射等的抗逆能力。

        综上分析,甘蔗RSD感病植株中内生细菌多样性下降、部分优势菌属缺失,导致植株抗性降低;而植株感染RSD后,根长、总根表面积、总根体积和根尖数等指示根系生长的指标劣化,降低了植株对养分的吸收,使RSD罹患植株出现生长迟滞、蔗茎变细、矮化、分蘖少的症状,进而导致产量下降、品质降低。

      • 甘蔗罹患RSD病后,根长、总根表面积、总根体积和根尖数均显著下降,致使植株氮、磷、钾吸收量显著降低。氮、磷、钾吸收量的减少,尤其是钾元素吸收量的急剧下降,又会影响RSD感病植株的生长,最终导致甘蔗产量和品质下降。

        与非感病植株相比,RSD感病植株内生细菌多样性下降,特有内生细菌优势菌属和菌种数量减少植株抗性降低;植株内生细菌的部分优势菌门的丰度发生了显著变化,诸如绿弯菌门 (Chloroflexi) 和酸杆菌门 (Acidobacteria) 细菌的丰度占比急剧增加,而厚壁菌门 (Firmicutes) 和属于门分类水平中其它 (other) 分类水平的细菌占比下降;植株内生细菌部分优势菌属的丰度占比、排位顺序也发生了显著变化,诸如Pseudarthrobacter、红游动菌属 (Rhodoplanes) 等部分非感病植株中丰度占比大于1%的优势菌属缺失。

        致谢:作者感谢广西壮族自治区农业科学院甘蔗研究所覃振强博士,张小秋博士在样品采集以及甘蔗植株宿根矮化病鉴定给予的帮助。

    参考文献 (42)
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