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玉米不同层位叶片生理生化指标与SPAD值的关系

张银杰 王磊 白由路 卢艳丽 张静静 李格

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玉米不同层位叶片生理生化指标与SPAD值的关系

    作者简介: 张银杰 E-mail: zzhangyinjie@126.com;
    通讯作者: 王磊, E-mail:wanglei02@caas.cn
  • 基金项目: 国家自然科学基金项目(31000937,31572207)。

Relationship of physiological and biochemical indicators with SPAD values in maize leaves at different layers

    Corresponding author: WANG Lei, E-mail:wanglei02@caas.cn ;
  • 摘要:   【目的】  研究不同层位玉米叶片氮素指标的变化,以及不同生育时期进行营养诊断的最佳叶片,以便能够及时准确地进行氮素营养光谱诊断,实现高产和肥料的高效益。  【方法】  设置两年 (2017和2018) 的盆栽试验,共设6个施氮水平,分别在玉米的关键生育时期 (拔节期、大喇叭口期、开花吐丝期和灌浆期) 按叶片层位取样,分析叶片生理生化指标 (叶片氮含量、叶绿素含量、可溶性蛋白质含量、可溶性糖含量、叶片厚度和净光合速率) 的变化及其与SPAD值的关系,选取利用SPAD值对叶片氮含量进行估算的最佳叶片。  【结果】  1) 叶片氮含量、叶绿素含量、可溶性蛋白质含量、叶片厚度及净光合速率随着氮肥增施呈现先增加后平稳的趋势,与叶片SPAD值呈正相关关系;可溶性糖含量随着氮肥增施呈先减少后平稳的趋势,与SPAD值呈负相关关系。2) 叶片氮含量、叶绿素含量、可溶性蛋白质含量、叶片厚度、净光合速率及SPAD值垂直分布上均表现为上层叶片>下层叶片;可溶性糖含量表现为下层叶片>上层叶片。3)SPAD值与叶片氮含量之间建立的线性回归模型均达极显著水平,拔节期和灌浆期的上层叶片、大喇叭口期和开花吐丝期的中层叶片氮含量与SPAD值回归决定系数 (R2) 较高,分别为0.768、0.865、0.893、0.924。  【结论】  生育期、氮水平和叶片层位显著影响玉米叶片中与氮素营养相关的生理生化指标,呈现一定的空间异质性,在玉米的拔节期和灌浆期利用SPAD值进行叶片氮含量营养诊断时应考虑测定上层叶片 (顶两片、三片完全展开叶),而在大喇叭口期和开花吐丝期应测定中层叶片 (中两片完全展开叶、穗位叶及以下两片叶)。
  • 图 1  2017和2018年不同生育时期不同处理叶片氮含量的垂直分布

    Figure 1.  Vertical distribution of leaf nitrogen content at different growth stages and N application in 2017 and 2018

    图 2  2017和2018年不同生育期不同处理叶绿素含量的垂直分布

    Figure 2.  Vertical distribution of different layer leaves chlorophyll content at different growth stages under N treatments in 2017 and 2018

    图 3  2017和2018不同生育时期不同处理叶片SPAD值

    Figure 3.  SPAD values of different layer leaves at different growth stages under N treatments in 2017 and 2018

    图 5  2017年不同生育期不同处理叶片可溶性蛋白质含量、可溶性糖含量、叶片厚度和净光合速率 (Pn)

    Figure 5.  Soluble protein and soluble sugar content,leaf thickness and photosynthetic rate (Pn) of three leaf layers in maize leaves at four growth stages under different N treatments in 2017

    图 4  大喇叭口期上层叶片透射电子显微镜 (TEM) 和光学显微镜 (OM) 显微照片

    Figure 4.  Photomicrographs by transmission electron microscope (TEM) at 700X magnification and optical microscope (OM) photomicrograph at 40X magnification of the upper layer leaves at booting stage

    图 6  不同生育期叶片氮含量与SPAD值的回归分析

    Figure 6.  Linear regression relationships between leaf nitrogen content and SPAD values in maize leaves at four different growth stages

    表 1  供试土壤化学性状

    Table 1.  The chemical properties of the experimental soil

    年份
    Year
    pH有机质 (g/kg)
    Organic matter
    硝态氮 (mg/kg)
    NO3--N
    铵态氮 (mg/kg)
    NH4+-N
    有效磷 (mg/kg)
    Olsen-P
    速效钾 (mg/kg)
    Available-K
    20178.832.0414.653.394.3554.7
    20188.712.2313.963.644.6556.3
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    表 2  氮肥水平 (N) 和叶片层位 (L) 双因素方差分析 (F值)

    Table 2.  Two-way ANOVA analysis of two factors including N rate(N)and leaf layer(L) (F-value)

    生育期
    Stage
    因素
    Factors
    自由度
    df
    SPAD叶片氮含量
    LNC
    叶绿素含量
    Chl. content
    可溶性蛋白质
    Soluble protein
    可溶性糖
    Soluble sugar
    厚度
    Thickness
    净光合速率
    Pn
    拔节期
    Jointing
    L112.33**105.63**21.49**0.051233.17**102.81**7.76*
    N520.45**79.61**36.73**56.94**80.78**71.51**19.51**
    N × L50.364.45**1.824.37**2.68*0.651.11
    大喇叭口期
    Booting
    L268.52**18.97**71.84**147.29**107.94**1134.90**398.15**
    N498.78**175.91**47.93**341.62**375.90**218.71**21.97**
    N × L81.000.614.98**4.33**4.09**15.58**3.16*
    开花吐丝期
    Anthesis-silking
    L253.41**72.70**24.98**53.44**21.71**17.00**336.28**
    N434.16**87.46**6.22**135.82**84.41**100.08**21.12**
    N × L80.885.96**0.4859.53**10.43**0.871.62
    灌浆期
    Filing
    L129.24**69.48**7.29**32.61**0.1484.71*39.21**
    N5408.82**157.47**124.32**376.87**63.87**118.77**127.73**
    N × L51.45NS2.49*1.84NS3.65*1.4413.29**1.00
    注(Note):LNC—Leaf N content; 叶片氮含量、叶绿素含量和 SPAD 值数据为 2017 和 2018 年的数据,其他指标来源于 2017 年的数据 The data for LCN, Chl. and SPAD were from 2017 and 2018, and the others were from the pot experiments in 2017; *—P < 0.05; **—P < 0.01; NS—不显著 Not significant
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    表 3  不同生育期上层叶片与下层叶片生理生化指标的比值

    Table 3.  The ratio of physiological and biochemical indicator of upper and lower leaves at different growth stages under different N treatments

    生育期
    Stage
    处理
    Treatment
    叶片氮含量
    LNC
    叶绿素含量
    Chlorophyll content
    SPAD可溶性蛋白质
    Soluble Protein
    可溶性糖
    Soluble sugar
    叶片厚度
    Thickness
    净光合速率
    Pn
    拔节期
    Jointing
    N11.17 b0.99 b1.03 a0.94 b0.73 b1.05 a1.08 a
    N21.30 a1.15 a1.05 a0.93 b0.72 b1.03 a0.99 a
    N31.28 a1.08 a1.02 a0.98 ab0.69 b1.04 a1.11 a
    N41.20 ab1.08 a1.02 a1.05 ab0.68 b1.03 a1.03 a
    N51.06 c1.13 a1.06 a1.20 a0.82 b1.04 a1.08 a
    大喇叭口期
    Booting
    N11.20 a1.48 a1.23 a1.44 a0.93 a1.06 d1.65 a
    N21.19 a1.47 a1.17 ab1.39 a0.81 b1.15 a1.56 a
    N31.05 a1.08 b1.10 b1.13 a0.84 b1.14 b1.48 a
    N41.09 a1.16 b1.12 b1.14 a0.87 ab1.11 c1.46 a
    N51.15 a1.09 b1.13 b1.27 a0.91 a1.13 bc1.83 a
    开花吐丝期
    Anthesis-silking
    N11.59 a1.21 a1.15 ab1.06 ab0.92 a1.01 a1.53 a
    N21.47 a1.19 a1.12 ab1.19 a0.93 a1.00 a1.54 a
    N31.16 b1.26 a1.16 a0.89 b0.91 a1.01 a1.48 a
    N41.12 b1.16 a1.13 ab0.89 b0.87 a1.00 a1.43 a
    N51.05 b1.08 b1.10 ab1.15 a0.89 a0.99 a1.53 a
    F
    F value
    S13.14**32.54**42.45**14.81**54.03**296.35**44.25**
    N19.38**13.38**2.81*3.64*3.20*4.38**1.43
    S × N9.86**15.71**2.69*2.022.128.75**0.74
    注(Note):LNC—Leaf N content; S—生育期 Growing stage; N—施氮水平 N application; 叶片氮含量、叶绿素含量和 SPAD 值数据为 2017 和 2018 的平均值,其他指标来源于 2017 年的数据 The data for LNC,Chl. content and SPAD are the average of the 2017 and 2018, the data for the others were from the pot experiments 2017; 同列数据后不同小写字母表示处理间差异显著 (P < 0.05) Values followed by different small letters mean significant differences among treatments(P < 0.05); *—P < 0.05; **—P < 0.01.
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    表 4  不同生育时期不同层位叶片生理生化指标与SPAD值的相关系数 (r)

    Table 4.  Pearson correlation coefficients (r-values) between leaf physiological and biochemical indicators and SPAD values at growth stages of maize in different leaf layers

    生育期
    Growth stage
    叶片层位
    Leaf layer
    可溶性蛋白质
    Soluble protein
    可溶性糖
    Soluble sugar
    叶片厚度
    Thickness
    光合速率
    Pn
    拔节期Jointing上层Upper0.813**–0.798**0.672**0.561**
    下层Lower0.435–0.2540.3830.232
    大喇叭口期Booting上层Upper0.630**–0.879**0.817**0.954**
    中层Middle0.811**–0.844**0.978**0.958**
    下层 Lower0.581*–0.667**0.4580.650**
    开花吐丝期Anthesis-silking上层Upper0.549*–0.796**0.713**0.858**
    中层Middle0.445–0.853**0.828**0.950**
    下层 Lower0.355–0.547*0.4110.386
    灌浆期Filing上层Upper0.688**–0.881**0.741**0.909**
    中层Middle0.873**–0.901**0.943**0.944**
    注(Note):指标来源于 2017 年的数据 The indicators data were from 2017. *—P < 0.05; **—P < 0.01.
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-04-21

玉米不同层位叶片生理生化指标与SPAD值的关系

    作者简介:张银杰 E-mail: zzhangyinjie@126.com
    通讯作者: 王磊, wanglei02@caas.cn
  • 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所/农业农村部植物营养与肥料重点实验室,北京 100081
  • 基金项目: 国家自然科学基金项目(31000937,31572207)。
  • 摘要:   【目的】  研究不同层位玉米叶片氮素指标的变化,以及不同生育时期进行营养诊断的最佳叶片,以便能够及时准确地进行氮素营养光谱诊断,实现高产和肥料的高效益。  【方法】  设置两年 (2017和2018) 的盆栽试验,共设6个施氮水平,分别在玉米的关键生育时期 (拔节期、大喇叭口期、开花吐丝期和灌浆期) 按叶片层位取样,分析叶片生理生化指标 (叶片氮含量、叶绿素含量、可溶性蛋白质含量、可溶性糖含量、叶片厚度和净光合速率) 的变化及其与SPAD值的关系,选取利用SPAD值对叶片氮含量进行估算的最佳叶片。  【结果】  1) 叶片氮含量、叶绿素含量、可溶性蛋白质含量、叶片厚度及净光合速率随着氮肥增施呈现先增加后平稳的趋势,与叶片SPAD值呈正相关关系;可溶性糖含量随着氮肥增施呈先减少后平稳的趋势,与SPAD值呈负相关关系。2) 叶片氮含量、叶绿素含量、可溶性蛋白质含量、叶片厚度、净光合速率及SPAD值垂直分布上均表现为上层叶片>下层叶片;可溶性糖含量表现为下层叶片>上层叶片。3)SPAD值与叶片氮含量之间建立的线性回归模型均达极显著水平,拔节期和灌浆期的上层叶片、大喇叭口期和开花吐丝期的中层叶片氮含量与SPAD值回归决定系数 (R2) 较高,分别为0.768、0.865、0.893、0.924。  【结论】  生育期、氮水平和叶片层位显著影响玉米叶片中与氮素营养相关的生理生化指标,呈现一定的空间异质性,在玉米的拔节期和灌浆期利用SPAD值进行叶片氮含量营养诊断时应考虑测定上层叶片 (顶两片、三片完全展开叶),而在大喇叭口期和开花吐丝期应测定中层叶片 (中两片完全展开叶、穗位叶及以下两片叶)。

    English Abstract

    • 氮作为植物重要的必需营养元素,在植物的生长发育中起着关键作用,如光合作用、蛋白质合成等生理和生化过程,并影响植物体中参与这些过程的化学指标含量[1-2]。氮是叶绿体中的关键元素,叶绿素含量受叶片中有效氮的影响[3]。叶片厚度和光合色素含量是影响二氧化碳吸收速率的重要组成部分,较厚的玉米叶片每单位面积包含较多的叶绿体进行光合作用,因此叶片厚度也是产量的重要形态特征[4]。在农业生产中,普遍存在着氮肥施用过量,不合理地施氮导致环境风险增加,例如温室气体 (N2O) 排放以及地表水和地下水污染[5-6]。因此,实时地监测作物氮素营养,有助于管理者及时采取措施,既保证作物产量,又提高肥料效益、减少环境污染。

      近些年来,无损间接地诊断氮素的方法越来越受到重视[7-8],便携式叶绿素仪 (SPAD-502) 具有快速、简便、适时和无损的特点,被广泛用于快速评估农作物的叶绿素水平和氮素状况,不仅应用在大宗粮食作物小麦[9]、玉米[10-12]、水稻[13-14]上,还应用于棉花[15]、马铃薯[16]、油菜[17]和甜瓜[18]等经济作物上。叶片SPAD值受多种因素的影响,如测定叶位、叶片厚度、生育时期和施氮量等[4,7]。较多研究已开展关于施氮量、生育期、不同层位等对叶片氮含量和SPAD值影响的研究[6,8,11],但关于不同生育期、施氮量和叶片层位对玉米叶片生理生化指标影响的研究较少。氮在植物体内极易移动,可以从较老叶片转移到较新叶中,尤其是在缺氮情况下,叶片氮的空间异质性影响叶片生理生化特性,除此之外,不同层位叶片生理生化特征也会受到多种环境因素的影响 (例如太阳辐射、通气性等)[11],而关于不同层位玉米叶片生理生化指标 (与氮素相关) 差异的研究较少,这些因素也影响SPAD值与氮素相关指标的关系。因此,本文分析不同生育时期,玉米叶片氮含量及相关生理生化指标的空间变化及其与SPAD值的相关性,明确不同生育时期利用叶绿素仪进行玉米氮素营养诊断的最佳叶片层位。旨在进一步理解玉米叶片中的氮素状态,更准确地评估叶片氮素水平,指导合理施肥。

      • 盆栽试验于2017年和2018年的6—10月在中国农业科学院国际高新产业园区 (河北省廊坊市)(N39°35′47.03″、E116°35′16.24″) 进行。供试土壤取自园区内深层土壤,土壤类型为潮土,质地偏砂,供试土壤的基础理化性状见表1。供试作物为夏玉米‘郑单958’,供试氮肥为尿素 (含N 46%),磷肥为磷酸二铵 (含N 18%、P2O5 46%),过磷酸钙 (含P2O5 12%),钾肥为硫酸钾 (含K2O 52%)。

        表 1  供试土壤化学性状

        Table 1.  The chemical properties of the experimental soil

        年份
        Year
        pH有机质 (g/kg)
        Organic matter
        硝态氮 (mg/kg)
        NO3--N
        铵态氮 (mg/kg)
        NH4+-N
        有效磷 (mg/kg)
        Olsen-P
        速效钾 (mg/kg)
        Available-K
        20178.832.0414.653.394.3554.7
        20188.712.2313.963.644.6556.3

        供试土壤的常规推荐施肥量为N 180 kg/hm2、P2O5 90 kg/hm2、K2O 90 kg/hm2(ASI法),依据盆栽试验施肥量是大田的2—3倍,设置6个施氮水平:N0、N1、N2、N3、N4、N5,施氮量分别为0、180、360、540、720、900 kg/hm2,磷钾肥施用量均为270 kg/hm2。根据土壤容重 (1.13 g/cm3) 换算成每盆风干土的施氮量为:0、1.274、2.549、3.823、5.097、6.372 g/pot,施磷钾为1.912 g/pot。试验用盆直径 33 cm、高 40 cm,装风干土 (过 2 mm筛)16 kg,40%的氮肥和全部的磷钾肥与土壤混匀后装盆,剩余60%的氮肥于大喇叭口期取样后随水施入。每个处理12盆,播种3粒种子,苗期每盆留2株苗,在拔节期第一次取样后每盆留 1 株。分别在玉米的拔节期、大喇叭口期、开花吐丝期和灌浆期进行叶片分层测定和取样,在拔节期和大喇叭口期以第一片完全展开叶开始,每两片叶片作为一个层位,拔节期叶片分为两层,大喇叭口期叶片分为三层,后两个生育时期以穗位叶以上的三片叶作为上层,穗位叶及以下两片叶为中层,往下的三片叶为下层 (大喇叭口期与开花吐丝期下层叶片的N0处理和灌浆期的下层叶片有部分干枯未取样)。

      • 原位测定SPAD值和净光合速率,测定后立即剪取部分叶片放入固定液 (福尔马林-乙酸-乙醇-甘油混合物) 固定,剩余叶片分为两个子样本,一部分放入4℃冰箱中用于测定叶绿素含量和可溶性蛋白质含量,另一部分烘干磨碎测定叶片氮含量和可溶性糖含量。

        SPAD值的测定:用手持式SPAD-502(日本美能达公司产),每片叶子固定地选取中部较宽的部位测定5次,求平均值作为该叶片的SPAD值,将每层叶片SPAD值的平均值作为该层叶片SPAD值。

        叶片氮含量的测定:105℃下杀青30 min,60℃烘箱中烘干、称重、粉碎,采用H2SO4-H2O2法消化,用AA3流动注射分析仪 (德国SEAL公司产) 测定含氮量。

        叶绿素含量的测定[19]:将已分离的新鲜叶片表面擦拭干净、剪碎、混匀,称取0.25 g左右,用99%丙酮和95%乙醇1∶1混合液提取,采用紫外分光光度计 (UV-1800) 测定。

        可溶性蛋白质含量测定[19]:用考马斯亮蓝G-250染色法,紫外分光光度计 (UV-1800) 测定。

        可溶性糖测定[20]:用蒽酮-硫酸法,紫外分光光度计 (UV-1800) 测定。

        叶片净光合速率测定[21]:用LI-6400光合仪 (美国LI-COR公司产) 测定,红/蓝光源配合标准叶室,CO2缓冲系统,控制环境为:温度30℃,红/蓝光源光量子通量密度1500 μmol/(m2·s),流速500 μmol/s。每次测定选择晴朗无风的天气,上午9:00—11:00测定,每张叶片 (中部较宽部位) 测定3次。

        叶片厚度和显微结构:剪取与测定SPAD值和光合速率相同的叶片部位,FAA固定液 (福尔马林-乙酸-乙醇-甘油混合物) 固定,以叶片切面制作石蜡切片,利用光学显微镜 (OLYMPUS BX51)40倍物镜下用微尺测量叶片厚度,每个切片测量5次并拍照。利用透射电子显微镜 (TEM)(HITACHI-7500) 观察叶片的细胞结构。

      • 采用Excel 2016对试验数据进行整理;利用SPSS22.0(SPSS Inc. Chicago,IL) 软件进行方差分析和相关分析,单因素方差分析 (One-way ANOVE) 进行不同施氮处理以及不同层位叶片之间的显著性比较 (Duncan法,P < 0.05) 进行,双因素方差分析 (Two-way ANOVA) 研究氮水平和叶片层位对叶片生理生化指标的影响,Pearson’s分析叶片生理生化 (与氮素相关) 指标与SPAD值的相关性 (P < 0.05、P < 0.01);采用Origin 9.0做图。

      • 图1显示,两年数据呈现相似的规律,在整个生育期中,拔节期的叶片氮含量较高,随着玉米生长,呈现递减的趋势。生育期、氮水平及两者交互作用对上层和下层叶片氮含量的比值产生了显著的影响 (表3)。在玉米拔节期、开花吐丝期和灌浆期,氮水平、叶片层位及两者交互作用都对叶片氮含量影响显著,在大喇叭口期,氮水平和叶片层位对叶片氮含量影响显著 (表2)。与N0相比,施氮显著增加叶片氮含量,随着氮肥的增施,叶片氮含量呈现先增加后平稳的趋势。叶片氮含量呈现一定的空间异质性,从下层叶片到上层叶片,叶片氮含量有所增加,呈现的趋势为上层叶片 > 中层叶片 > 下层叶片。在两年的盆栽试验中,玉米拔节期叶片氮含量上下层间相差较大 (表3图1),上层叶片较下层叶片的增幅分别平均为20.55%、18.50%;大喇叭口期的上中下层叶片氮含量相差较小;开花吐丝期的上层和中层叶片氮含量相差较小,但高于下层叶片;在灌浆期,与中层叶片叶片氮含量相比,上层叶片氮含量的增幅分别平均为39.03%、15.80%。

        图  1  2017和2018年不同生育时期不同处理叶片氮含量的垂直分布

        Figure 1.  Vertical distribution of leaf nitrogen content at different growth stages and N application in 2017 and 2018

        表 2  氮肥水平 (N) 和叶片层位 (L) 双因素方差分析 (F值)

        Table 2.  Two-way ANOVA analysis of two factors including N rate(N)and leaf layer(L) (F-value)

        生育期
        Stage
        因素
        Factors
        自由度
        df
        SPAD叶片氮含量
        LNC
        叶绿素含量
        Chl. content
        可溶性蛋白质
        Soluble protein
        可溶性糖
        Soluble sugar
        厚度
        Thickness
        净光合速率
        Pn
        拔节期
        Jointing
        L112.33**105.63**21.49**0.051233.17**102.81**7.76*
        N520.45**79.61**36.73**56.94**80.78**71.51**19.51**
        N × L50.364.45**1.824.37**2.68*0.651.11
        大喇叭口期
        Booting
        L268.52**18.97**71.84**147.29**107.94**1134.90**398.15**
        N498.78**175.91**47.93**341.62**375.90**218.71**21.97**
        N × L81.000.614.98**4.33**4.09**15.58**3.16*
        开花吐丝期
        Anthesis-silking
        L253.41**72.70**24.98**53.44**21.71**17.00**336.28**
        N434.16**87.46**6.22**135.82**84.41**100.08**21.12**
        N × L80.885.96**0.4859.53**10.43**0.871.62
        灌浆期
        Filing
        L129.24**69.48**7.29**32.61**0.1484.71*39.21**
        N5408.82**157.47**124.32**376.87**63.87**118.77**127.73**
        N × L51.45NS2.49*1.84NS3.65*1.4413.29**1.00
        注(Note):LNC—Leaf N content; 叶片氮含量、叶绿素含量和 SPAD 值数据为 2017 和 2018 年的数据,其他指标来源于 2017 年的数据 The data for LCN, Chl. and SPAD were from 2017 and 2018, and the others were from the pot experiments in 2017; *—P < 0.05; **—P < 0.01; NS—不显著 Not significant

        表 3  不同生育期上层叶片与下层叶片生理生化指标的比值

        Table 3.  The ratio of physiological and biochemical indicator of upper and lower leaves at different growth stages under different N treatments

        生育期
        Stage
        处理
        Treatment
        叶片氮含量
        LNC
        叶绿素含量
        Chlorophyll content
        SPAD可溶性蛋白质
        Soluble Protein
        可溶性糖
        Soluble sugar
        叶片厚度
        Thickness
        净光合速率
        Pn
        拔节期
        Jointing
        N11.17 b0.99 b1.03 a0.94 b0.73 b1.05 a1.08 a
        N21.30 a1.15 a1.05 a0.93 b0.72 b1.03 a0.99 a
        N31.28 a1.08 a1.02 a0.98 ab0.69 b1.04 a1.11 a
        N41.20 ab1.08 a1.02 a1.05 ab0.68 b1.03 a1.03 a
        N51.06 c1.13 a1.06 a1.20 a0.82 b1.04 a1.08 a
        大喇叭口期
        Booting
        N11.20 a1.48 a1.23 a1.44 a0.93 a1.06 d1.65 a
        N21.19 a1.47 a1.17 ab1.39 a0.81 b1.15 a1.56 a
        N31.05 a1.08 b1.10 b1.13 a0.84 b1.14 b1.48 a
        N41.09 a1.16 b1.12 b1.14 a0.87 ab1.11 c1.46 a
        N51.15 a1.09 b1.13 b1.27 a0.91 a1.13 bc1.83 a
        开花吐丝期
        Anthesis-silking
        N11.59 a1.21 a1.15 ab1.06 ab0.92 a1.01 a1.53 a
        N21.47 a1.19 a1.12 ab1.19 a0.93 a1.00 a1.54 a
        N31.16 b1.26 a1.16 a0.89 b0.91 a1.01 a1.48 a
        N41.12 b1.16 a1.13 ab0.89 b0.87 a1.00 a1.43 a
        N51.05 b1.08 b1.10 ab1.15 a0.89 a0.99 a1.53 a
        F
        F value
        S13.14**32.54**42.45**14.81**54.03**296.35**44.25**
        N19.38**13.38**2.81*3.64*3.20*4.38**1.43
        S × N9.86**15.71**2.69*2.022.128.75**0.74
        注(Note):LNC—Leaf N content; S—生育期 Growing stage; N—施氮水平 N application; 叶片氮含量、叶绿素含量和 SPAD 值数据为 2017 和 2018 的平均值,其他指标来源于 2017 年的数据 The data for LNC,Chl. content and SPAD are the average of the 2017 and 2018, the data for the others were from the pot experiments 2017; 同列数据后不同小写字母表示处理间差异显著 (P < 0.05) Values followed by different small letters mean significant differences among treatments(P < 0.05); *—P < 0.05; **—P < 0.01.
      • 表2可知,在玉米的拔节期、开花吐丝期和灌浆期,氮水平和叶片层位对叶绿素含量产生了显著的影响,在大喇叭口期,氮水平、叶片层位及两者交互作用对叶绿素含量产生了显著的影响。生育期、氮水平及两者的交互作用对上下层叶片叶绿素含量比值影响显著 (表3)。与N0相比,施氮显著提高叶片的叶绿素含量,随着氮肥的增施叶绿素含量呈先增加后平稳的趋势 (开花吐丝期和灌浆期的上层叶片除外)。玉米叶片叶绿素含量呈现一定的空间异质性,上层和中层叶片均高于下层叶片。拔节期,在低氮条件下,上下层叶片叶绿素含量相差较小;大喇叭口期,叶片叶绿素含量大体上呈现上层叶片 > 中层叶片 > 下层叶片;开花吐丝期和灌浆期叶片叶绿素含量存在差异,在2017年的盆栽试验中呈现为中层叶片 > 上层叶片。

        图  2  2017和2018年不同生育期不同处理叶绿素含量的垂直分布

        Figure 2.  Vertical distribution of different layer leaves chlorophyll content at different growth stages under N treatments in 2017 and 2018

      • 在玉米的四个关键生育时期,氮水平和叶片层位对SPAD值产生了显著的影响 (表2)。生育期、氮水平及两者的交互作用显著影响上下层叶片SPAD值的比值 (表3)。图3可知,在2017年的试验中,随着氮肥的增施SPAD值大体上呈现先增加后有所减少的趋势,而2018年的试验中,随着氮肥的增施SPAD值呈现先增加后平稳的趋势。玉米叶片SPAD值呈现一定的空间异质性,上层和中层叶片SPAD值均高于下层叶片。在两年试验中,拔节期上下层叶片SPAD值相差较小 (表3图3);大喇叭口期叶片SPAD值大体上呈现上层叶片 > 中层叶片 > 下层叶片;而在开花吐丝期大体上呈现中层叶片 > 上层叶片 > 下层叶片;灌浆期上层和中层叶片SPAD值相差较小。

        图  3  2017和2018不同生育时期不同处理叶片SPAD值

        Figure 3.  SPAD values of different layer leaves at different growth stages under N treatments in 2017 and 2018

      • 可溶性蛋白质含量:在玉米拔节期,氮水平、氮水平和叶片层位的交互作用对叶片可溶性蛋白质含量产生了显著的影响,大喇叭口期、开花吐丝期和灌浆期,氮水平、叶片层位及两者交互作用显著影响叶片可溶性蛋白质含量 (表2)。生育期和氮素水平对上下层叶片可溶性蛋白质含量比值的影响显著 (表3)。除了拔节期的下层叶片和开花吐丝期的中层和下层叶片,叶片可溶性蛋白质含量与SPAD值呈显著正相关关系 (表4)。由图5可知,拔节期叶片可溶性蛋白质含量大体上呈现先增加后减少的趋势,后期呈先增加后平稳的趋势。叶片可溶性蛋白质含量呈现一定的空间异质性,拔节期上层和下层叶片的可溶性蛋白质含量相差不大,后期大体上呈现上层叶片 > 中层叶片 > 下层叶片 (除了开花吐丝期的N3、N4处理)。

        表 4  不同生育时期不同层位叶片生理生化指标与SPAD值的相关系数 (r)

        Table 4.  Pearson correlation coefficients (r-values) between leaf physiological and biochemical indicators and SPAD values at growth stages of maize in different leaf layers

        生育期
        Growth stage
        叶片层位
        Leaf layer
        可溶性蛋白质
        Soluble protein
        可溶性糖
        Soluble sugar
        叶片厚度
        Thickness
        光合速率
        Pn
        拔节期Jointing上层Upper0.813**–0.798**0.672**0.561**
        下层Lower0.435–0.2540.3830.232
        大喇叭口期Booting上层Upper0.630**–0.879**0.817**0.954**
        中层Middle0.811**–0.844**0.978**0.958**
        下层 Lower0.581*–0.667**0.4580.650**
        开花吐丝期Anthesis-silking上层Upper0.549*–0.796**0.713**0.858**
        中层Middle0.445–0.853**0.828**0.950**
        下层 Lower0.355–0.547*0.4110.386
        灌浆期Filing上层Upper0.688**–0.881**0.741**0.909**
        中层Middle0.873**–0.901**0.943**0.944**
        注(Note):指标来源于 2017 年的数据 The indicators data were from 2017. *—P < 0.05; **—P < 0.01.

        图  5  2017年不同生育期不同处理叶片可溶性蛋白质含量、可溶性糖含量、叶片厚度和净光合速率 (Pn)

        Figure 5.  Soluble protein and soluble sugar content,leaf thickness and photosynthetic rate (Pn) of three leaf layers in maize leaves at four growth stages under different N treatments in 2017

        可溶性糖含量:拔节期、大喇叭口期和开花吐丝期,氮水平、叶片层位及两者交互作用显著影响叶片可溶性糖含量;灌浆期,氮水平对叶片可溶性糖含量产生了显著的影响 (表2)。生育期和氮水平对上下层叶片可溶性糖含量比值的影响显著 (表3)。除了拔节期的下层叶片,叶片可溶性糖含量与SPAD值均呈显著负相关关系 (表4)。由图5可知,施氮肥降低了叶片可溶性糖含量,随着氮肥的增施,叶片可溶性糖含量呈先减少后平稳的趋势。拔节期上层叶片和下层叶片的可溶性糖含量相差较大,与下层叶片相比,上层叶片可溶性糖的降幅为17.77%~31.72%。叶片可溶性糖含量空间上大体呈下层叶片 > 中层叶片 > 上层叶片。

        叶片显微结构:不同施氮水平下玉米叶片的微观结构明显不同 (图4)。在缺氮条件下 (N0),叶片细胞中的叶绿体小且数量少。在正常施氮条件下 (N3),叶片组织中维管束鞘细胞体积较大,松散地排列,且分布较多体积较大的叶绿体,这些叶绿体密集地堆积在细胞中。

        图  4  大喇叭口期上层叶片透射电子显微镜 (TEM) 和光学显微镜 (OM) 显微照片

        Figure 4.  Photomicrographs by transmission electron microscope (TEM) at 700X magnification and optical microscope (OM) photomicrograph at 40X magnification of the upper layer leaves at booting stage

        叶片厚度:拔节期和开花吐丝期,氮水平和叶片层位显著影响叶片厚度,大喇叭口期和灌浆期,氮水平、叶片层位及两者交互作用都对叶片厚度产生了显著的影响 (表2)。生育期、氮水平及两者的交互作用显著影响上下层叶片厚度的比值 (表3)。不同生育时期的上层和中层叶片厚度与SPAD值均呈正相关关系 (表4)。由图5可知,生育前期,与下层叶片相比,上层叶片和中层叶片厚度明显增加,拔节期上层叶片的增幅为2.78%~4.86%,大喇叭口期,上层和中层叶片厚度的增幅分别为6.40%~15.37%、9.95%~15.81%。生育后期 (开花吐丝期和灌浆期) 不同层位叶片厚度相差不大。

        净光合速率:拔节期、开花吐丝期和灌浆期,氮水平和叶片层位显著影响叶片的净光合速率,大喇叭口期,氮水平、叶片层位及两者交互作用对叶片净光合速率产生了显著的影响 (表2)。生育期显著影响上下层叶片净光合速率的比值 (表3)。除了拔节期和开花吐丝期的下层叶片,叶片净光合速率与SPAD值呈显著正相关关系 (表4)。由图5可知,在灌浆期,叶片净光合速率随着氮肥的增施呈增加趋势,N4处理达最大值,再增加氮肥用量 (N5) 会有所降低。随着氮肥的增施,其他时期各层位叶片净光合速率大体上呈先增加后平稳的趋势。叶片层位显著影响叶片的净光合速率,总体上呈现上层叶片 > 中层叶片 > 下层叶片。相较于下层叶片,拔节期上层叶片净光合速率的增幅为1.99%~11.19%,大喇叭口期上层和中层叶片的增幅分别为45.95%~77.42%、32.65%~51.85%,开花吐丝期上层和中层叶片的增幅分别为42.63%~53.71%、27.37%~49.49%。

      • 利用两年的盆栽试验数据,以SPAD值为自变量,以叶片氮含量为因变量建立线性回归。由图6可知,在玉米的四个生育时期,各层位叶片氮含量与SPAD值均呈正相关关系,叶片氮含量和SPAD值之间的线性回归关系均达极显著水平 (P < 0.01)。而在同一生育时期,不同层位叶片回归方程的拟合度 (R2)、系数和截距存在差异。在各生育期,相比于下层叶片,上层和中层叶片回归方程的决定系数较大。拔节期和灌浆期,上层叶片的拟合度大于下层和中层叶片,R2分别为0.768和0.865。大喇叭口期和开花吐丝期,中层叶片的拟合度大于上层和下层,R2分别为0.893和0.924。因此,利用SPAD值诊断玉米叶片氮含量时,可以考虑利用上层叶片估算拔节期和灌浆期的叶片氮含量,中层叶片可用于估算大喇叭口期和开花吐丝期的叶片氮含量。

        图  6  不同生育期叶片氮含量与SPAD值的回归分析

        Figure 6.  Linear regression relationships between leaf nitrogen content and SPAD values in maize leaves at four different growth stages

      • 叶片的氮素水平是衡量作物生长、产量形成和植物生产力的重要指标[22-23]。有研究表明,叶片氮含量随生育期的推移而变化[24]。本试验条件下,叶片氮含量随着生育期的推移呈减少趋势,空间上呈上层叶片 > 中层叶片 > 下层叶片,这符合前人研究的规律[25-26],随着玉米的生长,叶片氮含量的减少也与氮的空间异质性有关,这是由于下层叶片 (叶片氮含量低) 的比例的增加,而上层叶 (叶片氮含量高) 比例的降低[27-28]。叶片氮素的变化规律可能导致生理生化指标的变化,氮的垂直分布极大地促进了作物叶片内生化和生物物理过程的空间异质性[29-30]。叶片的叶绿素含量、可溶性蛋白质含量、可溶性糖含量、叶片厚度和净光合速率不仅受施氮水平的影响,叶片层位对其也有显著影响。叶绿素是叶片组织中的主要色素,在光化学合成碳水化合物的过程中起着至关重要的作用[31]。叶绿素含量也呈现空间异质性,上层叶片叶绿素含量大于下层叶片,结果与Huang等[32]的发现一致,这是由于氮元素是构成叶绿素分子结构的主要元素之一,氮素的盈亏势必影响叶绿素含量。由图4可知,氮胁迫条件下,细胞内叶绿体体积变小,数量较少,这表明缺氮影响叶片的细胞结构而使得叶绿素含量降低,这与前人的研究发现一致[33],而施用氮肥能够显著提高叶绿素含量[34]。本试验条件下,玉米叶片的可溶性蛋白质含量、叶片厚度和净光合速率规律相似,表现为上层叶片 > 下层叶片,随氮肥的增施呈先增加后平稳的趋势。而Li等[34]研究表明,随着氮肥的增施,水稻叶片的厚度变薄,而本试验的结果与其结论相反。这是由于作物种类、被测部位和测量方法的差异所致,玉米和水稻的生长环境差异较大,其叶片的含水量、结构等均可能使叶片厚度产生差异,这一特征有待进一步验证。众所周知,光合作用过程取决于光合作用色素,本研究发现,在缺氮条件下,叶细胞中的叶绿体较小且少,这表明氮胁迫影响细胞内叶绿体结构,并降低叶绿素浓度,光合速率也较低,这些结果与前人研究结果一致[31,35]。而上层叶片的净光合速率较大,这不仅与叶绿素的含量相关,还与叶片所处的光环境相关。许多研究表明,叶片可溶性糖含量与植物的抗逆性有关[36]。本试验条件下,随着施氮量的增加,叶片可溶性糖含量的规律与其他指标相反,为下层叶片 > 上层叶片。这是由于氮胁迫下,植物叶片将维持高水平的可溶性糖含量,以确保作物的正常生长。这些结果可为了解玉米叶片氮素指标的分布规律提供理论和试验基础,有助于提高氮素估算的准确性。

      • 作物的上下层叶片氮素指标的差异能够准确地表征作物的氮素状况[11,37]。本试验结果表明,生育期显著影响玉米上下层叶片生理生化指标 (与氮素相关) 的比值 (表3),也就是影响叶片的氮素状况,不同生育时期叶片SPAD值与其生理生化指标的相关性也存在差异 (表4图6),这是由于玉米在不同生育时期,其生长特性存在差异[38]。此外,不同生育时期的环境差异也会影响其氮素施用效果,例如光辐射的影响,结构组织 (茎) 比例增加使得玉米生长到更高,上层叶片捕获的光辐射高于下层叶片,对下层的遮挡增加[39]

        SPAD-502便携式叶绿素仪,作为简单、快速的工具[40],广泛用于诊断氮素状况并指导施肥[41-42]。有研究报道,叶片厚度与SPAD值具有相关关系[4],本试验的结果与前人研究结果一致,上层和中层的叶片厚度与SPAD值均呈正相关关系。通常,在不同的生长阶段,植物的特性各不相同[38],其诊断结果也会不同,而本试验也验证了这一结论,即,不同生育时期线性回归方程的决定系数不同 (图6)。氮在作物体内空间分布的差异影响植物叶片生理生化过程,不同层位叶片的氮素指标与SPAD读数之间的相关性存在差异,这与前人研究结果一致[11]。胡国智等[18]研究发现,在测定甜瓜叶片SPAD值时,顶3叶的SPAD值与叶片、植株含氮量的相关性高于其它叶位,是较适宜的测定叶位。Li等 [43]研究表明,第四复合叶的顶部小叶可以作为进行评估马铃薯氮素状况的叶片。在玉米的研究上,鱼欢等[44]研究表明,测定玉米穗位叶的SPAD值可以用来诊断叶片的氮素营养状况,党蕊娟等[45]也分析了全生育期各层位叶片的SPAD值与叶片氮含量的相关性,发现上层叶片SPAD值与叶片氮含量关系最为密切,揭示夏玉米氮素诊断的最佳叶片是上层叶片。本试验的结果与上述结论相似,玉米的上层和中层叶片氮素指标和SPAD相关性较强,这可能与本试验定义的上层和中层叶片是功能叶有关。在不同生育时期选取合适的叶片建立估算模型有助于准确评估夏玉米的氮素状况,从而精准管理氮肥施用。这些结果可为建立高效、准确的诊断模型以估算玉米氮素状况提供理论依据,有助于提高氮肥利用效率。该结果有待进一步在不同品种、不同地区、不同气候等条件下验证。

      • 生育期、氮水平和叶片层位显著影响玉米叶片氮含量及其相关的生理生化指标,叶片氮含量、叶绿素含量、可溶性蛋白质含量、叶片厚度和净光合速率随氮肥的增施呈先增加后平稳的趋势,垂直分布上均呈现上层叶片 > 下层叶片,与SPAD值呈正相关关系;可溶性糖含量随氮肥的增施呈先减少后平稳的趋势,其含量呈下层叶片 > 上层叶片。不同层位叶片生理生化指标与SPAD值的相关性存在差异,利用SPAD值估算玉米叶片氮含量时,拔节期和灌浆期的上层叶片较敏感,而大喇叭口期和开花吐丝期的中层叶片较敏感。

    参考文献 (45)
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