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不同磷效率基因型小麦应对缺磷胁迫的表型及相关基因表达的研究

孟翔翔 李文凤 沈仁芳 兰平

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不同磷效率基因型小麦应对缺磷胁迫的表型及相关基因表达的研究

    作者简介: 孟翔翔E-mail: xiangmeng@issas.ac.cn;
    通讯作者: 兰平, E-mail:plan@issas.ac.cn
  • 基金项目: 国家重点研发计划项目(2016YFD0200308);南京土壤研究所“一三五”计划和领域前沿项目(ISSASIP1605);国家自然科学基金项目(32070279)。

Time-course response of phenotype and the expression of Pi-starvation responsive genes in high and low Pi-efficient wheat genotypes to Pi starvation

    Corresponding author: LAN Ping, E-mail:plan@issas.ac.cn
  • 摘要:   【目的】  小麦是磷肥需求量最大的作物之一。为了探索小麦磷的高效利用机制,本研究评价了不同磷效率基因型小麦在缺磷条件下的差异响应。  【方法】  本研究选取一个磷高效小麦基因型‘小偃54’和一个低效率型‘中国春’作为试验材料,设置正常供磷(+P)、缺磷(−P)和缺磷7天后恢复正常供磷(RP)3个处理进行小麦水培试验,调查分析了小麦幼苗的表型、生理以及缺磷响应基因的表达随缺磷时间延长的变化趋势,及它们在不同磷效率小麦基因型间的异同。  【结果】  缺磷胁迫明显增加了两个小麦基因型的根冠比,但无论缺磷与否,磷高效基因型‘小偃54’的根冠比均大于磷低效基因型‘中国春’。随着缺磷时间延长,小麦幼苗地上、地下部无机磷和总磷浓度逐渐降低,但不同基因型之间无明显差异。对缺磷的小麦幼苗恢复供磷后,磷耗竭的小麦幼苗体内无机磷含量迅速增加,‘小偃54’地上、地下部的无机磷含量均明显高于‘中国春’。缺磷响应信号基因TaIPS1TaSPX3在缺磷6 h即被诱导表达,随着缺磷时间的延长表达量逐渐升高,且恢复供磷后表达量显著降低;缺磷早期‘中国春’中TaIPS1TaSPX3的表达量比小偃54高,但在长期缺磷和缺磷后恢复供磷处理下又比‘小偃54’低,表明磷低效小麦基因型‘中国春’可能对体内磷稳态变化更为敏感。然而,两个根系特异表达的高亲和磷转运子TaPHT1.1/9TaPHT1.10均表现出缺磷早期表达受到抑制,而长期缺磷被诱导升高。未预料到的是,二者在复磷处理后的表达量明显高于缺磷处理。长期缺磷处理下,‘中国春’中TaPHT1.1/9的表达量明显低于‘小偃54’,但TaPHT1.10表达与‘小偃54’无显著差异,表明不同磷效率基因型小麦幼苗的缺磷诱导表达的磷吸收转运子可能存在差异。除此以外,缺磷胁迫显著增加了‘中国春’根系DCB-Fe含量,但对‘小偃54’无明显影响。  【结论】  磷高效基因型小麦幼苗(‘小偃54’)比磷低效型(‘中国春’)具有更大的根冠比和更强的磷吸收能力。对应地,‘小偃54’根系中的磷转运子基因TaPHT1.1/9的表达明显高于‘中国春’。然而,缺磷明显促进了磷低效基因型小麦根表铁的富集。今后将进一步研究小麦根表铁的富集对小麦幼苗磷高效吸收和利用的影响。
  • 图 1  缺磷对两个不同磷效率小麦基因型幼苗生物量的影响

    Figure 1.  Effect of the time-course response of Pi starvation on the biomass of two contrasting Pi-efficient wheat genotypes

    图 2  缺磷对两个不同磷效率小麦基因型幼苗无机磷和总磷浓度的影响

    Figure 2.  Effect of the time-course response to Pi starvation on the concentrations of Pi and total P in two contrasting Pi-efficient wheat genotypes

    图 3  缺磷 7d 后恢复供磷对两个不同磷效率小麦基因型无机磷浓度的影响

    Figure 3.  Effect of Pi resupply after the 7-day-Pi-deprivation on the concentrations of Pi in two contrasting Pi-efficient wheat genotypes

    图 4  缺磷对不同磷效率小麦基因型缺磷响应基因表达的影响

    Figure 4.  Effect of the time-course response to Pistarvation on the expression levels of Pi-starvation responsive genes in two contrasting Pi-efficient wheat genotypes

    图 5  缺磷对不同磷效率小麦基因型根系DCB-Fe含量的影响

    Figure 5.  Effect of Pi starvation on the DCB-Fe content in the root of two contrasting Pi-efficient wheat genotypes

    表 1  qRT-PCR引物

    Table 1.  The primers of qRT-PCR

    引物名称引物序列目的
    Prime namePrimer sequence (5’-3’)Purpose
    TaIPS1-qRT-FGACACTGAAGACTCGCACCAqRT-PCR
    TaIPS1-qRT-RCGGCGACTTCTCACCTCTAC
    TaSPX3-qRT-FGTGGAAGGACGAGTTCCTGAGCqRT-PCR
    TaSPX3-qRT-RTCCCGGTGTGTGATGATGAAGAA
    TaPHT1.1/9-qRT-FGAGACCGGCTACTCACGGGqRT-PCR
    TaPHT1.1/9-qRT-RCTAAGCTTCGATGCCATCGTC
    TaPHT1.10-qRT-FGCGTTCGGGTTCCTGTATGCqRT-PCR
    TaPHT1.10-qRT-RCAGTCGGAGCAATGGTGTCGT
    TaAPT1-qRT-FCGAATCAGTATGAAACAAGTTGTGACTCTTqRT-PCR
    TaAPT1-qRT-RTCCCAAACAGTTCCAGAAGGACAAAT
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    [19] 王兰珍米国华陈范骏张福锁 . 不同品种冬小麦磷效率性状与农学性状关系的研究. 植物营养与肥料学报, doi: 10.11674/zwyf.2004.0404
    [20] 李绍长胡昌浩龚江杨管印 . 供磷水平对不同磷效率玉米氮、钾素吸收和分配的影响. 植物营养与肥料学报, doi: 10.11674/zwyf.2004.0303
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  • 收稿日期:  2021-04-02

不同磷效率基因型小麦应对缺磷胁迫的表型及相关基因表达的研究

    作者简介:孟翔翔E-mail: xiangmeng@issas.ac.cn
    通讯作者: 兰平, plan@issas.ac.cn
  • 1. 中国科学院南京土壤研究所土壤与农业可持续发展国家重点实验室, 江苏南京210008
  • 2. 中国科学院大学, 北京100049
  • 3. 南京林业大学南方现代林业协同创新中心, 江苏南京210037
  • 基金项目: 国家重点研发计划项目(2016YFD0200308);南京土壤研究所“一三五”计划和领域前沿项目(ISSASIP1605);国家自然科学基金项目(32070279)。
  • 摘要:   【目的】  小麦是磷肥需求量最大的作物之一。为了探索小麦磷的高效利用机制,本研究评价了不同磷效率基因型小麦在缺磷条件下的差异响应。  【方法】  本研究选取一个磷高效小麦基因型‘小偃54’和一个低效率型‘中国春’作为试验材料,设置正常供磷(+P)、缺磷(−P)和缺磷7天后恢复正常供磷(RP)3个处理进行小麦水培试验,调查分析了小麦幼苗的表型、生理以及缺磷响应基因的表达随缺磷时间延长的变化趋势,及它们在不同磷效率小麦基因型间的异同。  【结果】  缺磷胁迫明显增加了两个小麦基因型的根冠比,但无论缺磷与否,磷高效基因型‘小偃54’的根冠比均大于磷低效基因型‘中国春’。随着缺磷时间延长,小麦幼苗地上、地下部无机磷和总磷浓度逐渐降低,但不同基因型之间无明显差异。对缺磷的小麦幼苗恢复供磷后,磷耗竭的小麦幼苗体内无机磷含量迅速增加,‘小偃54’地上、地下部的无机磷含量均明显高于‘中国春’。缺磷响应信号基因TaIPS1TaSPX3在缺磷6 h即被诱导表达,随着缺磷时间的延长表达量逐渐升高,且恢复供磷后表达量显著降低;缺磷早期‘中国春’中TaIPS1TaSPX3的表达量比小偃54高,但在长期缺磷和缺磷后恢复供磷处理下又比‘小偃54’低,表明磷低效小麦基因型‘中国春’可能对体内磷稳态变化更为敏感。然而,两个根系特异表达的高亲和磷转运子TaPHT1.1/9TaPHT1.10均表现出缺磷早期表达受到抑制,而长期缺磷被诱导升高。未预料到的是,二者在复磷处理后的表达量明显高于缺磷处理。长期缺磷处理下,‘中国春’中TaPHT1.1/9的表达量明显低于‘小偃54’,但TaPHT1.10表达与‘小偃54’无显著差异,表明不同磷效率基因型小麦幼苗的缺磷诱导表达的磷吸收转运子可能存在差异。除此以外,缺磷胁迫显著增加了‘中国春’根系DCB-Fe含量,但对‘小偃54’无明显影响。  【结论】  磷高效基因型小麦幼苗(‘小偃54’)比磷低效型(‘中国春’)具有更大的根冠比和更强的磷吸收能力。对应地,‘小偃54’根系中的磷转运子基因TaPHT1.1/9的表达明显高于‘中国春’。然而,缺磷明显促进了磷低效基因型小麦根表铁的富集。今后将进一步研究小麦根表铁的富集对小麦幼苗磷高效吸收和利用的影响。

    English Abstract

    • 磷(P)是作物生长和发育必需的大量元素之一。尽管土壤中磷的总量丰富,但土壤中的磷极易与其他矿质元素(如Ca、Al和Fe等)结合被固定,致使可以被植物直接吸收利用的无机磷(Pi)含量受到限制,严重影响了作物的产量和品质[1-4]。在过去的几十年,为了保证粮食作物的稳产增产,磷肥的施用迅速增长,预计到2030年磷肥的产量将达到峰值[5]。磷肥的过量施用不仅造成了不可再生资源磷矿石的耗竭,也带来了严重的环境问题[6-7]。因此,如何提高作物的磷利用效率,实现磷肥的减施增效是当前的研究热点。

      为了克服低磷环境,植物在形态、生理生化和分子等多个层面去加强磷的搜寻和吸收,如改变根系构型,促使植物根系向浅根系发展,诱导根毛的产生和伸长;分泌有机酸和紫色酸性磷酸酶等加强根际有效磷的活化;激活缺磷响应的分子调控网络,上调表达高亲和磷转运子,加强磷的吸收以及改变植物体内磷参与的代谢活动,加强磷的再利用[8-13]。大量的研究表明,植物响应缺磷的分子调控网络比较保守[14-17],主要分为依赖于体内磷稳态改变的系统响应和依赖于外界磷环境的局部响应。缺磷时,MYB家族转录因子PHR1 (PHOSPHATE STARVATION RESPONSE 1)作为植物缺磷系统响应的核心转录因子,直接或间接的调控大部分缺磷响应基因的表达,如参与无机磷活化和吸收,膜脂重塑以及根冠的生长比例等相关基因的表达。而转录因子PHR1的活性在转录后水平受到SPX蛋白的负调控,这个过程依赖于植物体内磷稳态的调控;许多研究表明,大部分编码SPXs蛋白基因的表达受到缺磷诱导[16,18-20]。在转录水平,长链非编码RNA基因IPSs (INDUCED BY PHOSPHATE STARVATION)已经被证明参与了miR399-PHO2(MicroRNA 399-PHOSPHATE 2)介导的缺磷响应的长距离信号通路,其表达明显受到植物体内磷稳态的调控[20-21]。因此,SPXsIPSs的表达常常被作为缺磷信号用来评价植物的缺磷响应;在小麦中,TaIPS1TaSPX3已经被报道明显受到缺磷诱导,且表达水平明显受体内磷稳态的调控[22-24]。当植物感受到缺磷胁迫,在转录因子PHR1的控制下,编码高亲和磷转运子PHT1s (PHOSPHATE TRANSPORTER 1)基因被诱导表达,以加强对无机磷的吸收[25]。在小麦中,根系特异表达的磷转运子TaPHT1.1/9TaPHT1.2TaPHT1.10被证明参与了小麦缺磷胁迫下无机磷的吸收[22,26]。另一方面,缺磷导致根系构型的改变以及诱导根毛的生长和伸长等局部响应明显受到的外界磷含量的影响,在这个过程中铁稳态发挥着重要的作用,并且这个调控过程发生在植物缺磷的早期[27-34]。在拟南芥缺磷早期,STOP1-ALMT1 (SENSITIVE TO PROTON RHIZOTOXICITY 1- ALUMINUM-ACTIVATED MALATE TRANSPORTER 1)和LPR1-PDR2 (LOW PHOSPHATE RESPONSE 1- PHOSPHATE DEFICIENCY RESPONSE 2)调控路径参与了铁在根尖的积累和重新分布,刺激了ROS的产生和胼胝质的堆积,引起了根尖细胞壁硬化以及分生组织生长停滞,最终导致主根伸长受到抑制[31-32, 35-37];水稻中,缺磷早期就明显刺激了根系铁膜的增加,而且不同基因型在缺磷胁迫下存在明显差异[38]。因此根表铁含量也是一个重要的缺磷响应信号,是否不同磷效率小麦基因型间在缺磷胁迫下存在差异,仍未见报道。

      小麦(Triticumaestivum L.)是重要的粮食作物之一,对磷肥需求量明显大于水稻和玉米等作物。许多报道也指出,磷的利用效率在不同的物种和同一物种的不同基因型间存在着明显的差异。小麦六倍体的特性,致使其拥有庞大而复杂的基因组,而且小麦的遗传转化十分困难,严重限制了小麦缺磷响应的分子调控机制的探索[39],但庞大的小麦基因型资源为我们挖掘和探索小麦磷高效利用提供了重要的材料。DAVIES等[40]与李继云等[41]以产量为标准,分别对500份和2000份小麦基因型在低磷土中筛选出一系列的不同磷利用效率的小麦基因型,如磷高效小麦基因型‘小偃54’、‘Lovrin10’和‘81(85)-5-3-3-3’等;磷低效小麦基因型‘京411’和‘中国春’等。尽管产量是最直观有效的筛选标准,然而由于小麦生长周期长,需要花费较长时间进行检测,且易受环境影响。因此,不同磷利用效率小麦基因型对缺磷胁迫的差异响应对于探索小麦的磷高效利用的分子机制和挖掘与之相关的关键基因有着重要意义。尽管缺磷引起了小麦磷稳态、根系构型、酸性磷酸酶活性以及根系活力等生理指标的改变,然而这些生理和生化指标对于不同磷利用效率的基因型小麦在响应缺磷胁迫时的差异不明显或变化幅度较小,这对于准确预测小麦的磷利用效率明显不足。而且当前对小麦不同磷利用效率的探索主要集中在表型和生理生化指标之间[22, 42-45],分子层面的探索则较少。随着以‘中国春’为背景的小麦基因组序列的释放[39],为我们从分子层面探索小麦磷利用效率机制以及挖掘调控磷高效利用的关键基因提供了重要参考。

      在本研究中,我们选取磷高效小麦基因型‘小偃54’和磷低效小麦基因型‘中国春’作为试验材料,对两个小麦基因型幼苗的生物量、无机磷和总磷浓度、缺磷响应基因的表达在缺磷time-course响应中的变化趋势以及根表铁在缺磷胁迫下的差异累积进行了探讨。结果表明,磷高效小麦基因型‘小偃54’具有更大的根冠比和更强的磷吸收能力;而磷低效小麦基因型‘中国春’幼苗对体内磷稳态变化更为敏感,缺磷促使更多的铁在其根表富集。

      • 本研究选取小麦磷低效基因型品种‘中国春’(CS)和磷高效基因型品种‘小偃54’(XY)作为试验材料。小麦种子用10% H2O2浸泡30 min后用超纯水清洗3~5次,在超纯水中浸泡2小时后将种子移至带有湿润滤纸的培养皿中暗培养3天;然后移至1/4 Hoagland培养液中继续培养10天。长势一致的小麦幼苗去除胚乳后被移至正常培养液或缺磷培养液中进行处理。在缺磷处理6 h、12 h、24 h、3 d和7 d后开始取样。对于复磷处理,将缺磷7天后的小麦幼苗分成两部分,一部分继续缺磷处理,另一部分移至正常培养液中培养6 h、12 h和24 h后取样,如复磷6 h后,被标记为7 d + 6 h。培养液配方为:2 mmol/L Ca (NO3)2·4H2O、650 μmol/L MgSO4·7H2O、250 μmol/L KH2PO4、750 μmol/L K2SO4、10 μmol/L MnSO4·H2O、0.1 μmol/L CuSO4·5H2O、1 μmol/L ZnSO4·7H2O、1 μmol/L H3BO3、0.05 μmol/L (NH4)6MoO24·4H2O、100 μmol/L KCl、40 μmol/L Fe-EDTA,用NaOH调至pH 6.0。其中,缺磷培养液中KH2PO4(250 μmol/L)被KCl (250 μmol/L)替代[23]。小麦幼苗的培养条件为:温度26℃,光照强度200 μmol/(m2·s),每天16 h / 8 h的光/暗处理。

      • 生物量:将不同处理时间的小麦幼苗在超纯水中清洗2~3次后,地上、地下分别收获后置于普通烘箱中,70℃烘干至恒重,称取每株幼苗的地上、地下部干重作为小麦的生物量。

        无机磷浓度测定:参照Delhaize和Randall等[46]的方法,将不同处理时间的小麦幼苗用超纯水清洗2~3次后,地上、地下部分别称重后置于液氮中磨碎。加入0.25 mmol/L的稀H2SO4 (地上8.4 mL、地下4.2 mL)萃取1小时,5000 g × 10 min离心后取上清,使用钼锑抗显色法对无机磷浓度进行检测。

        总磷浓度测定:将多株烘干至恒重的小麦植株混匀后,称取约0.1 g样品使用浓H2SO4-H2O2法进行消煮,使用钼锑抗显色法对总磷浓度进行测定[47]

      • 小麦幼苗根系用超纯水清洗2~3次,在滤纸上吸干多余水分,迅速置于液氮中冷冻,然后在−80℃保存或直接用于RNA提取。总RNA的提取依据Trizol reagent (Invitrogen)说明书进行。1 μg的总RNA 被用于反转录,方法参照TaKaRa公司的反转录试剂盒说明书进行(TaKaRa,含gDNA Eraser,Cat#RP047A)。cDNA 被稀释10 倍后,用于实时荧光定量PCR检测(quantitative real-time RT-PCR,qRT-PCR)。qRT-PCR采用SYBR Green Perfect mix (TaKaRa,Cat#RR420A)在LightCycler 480 II (Roche) real-time 仪器上进行检测,运行程序为:95℃ 5 min,95℃ 5 s,60℃ 30 s,40个循环,内参基因TaAPT1 (Adenine phosphoribosyltransferase 1)和缺磷响应基因TaIPS1TaSPX3、TaPHT1.1/9TaPHT1.10的引物信息见表1

        表 1  qRT-PCR引物

        Table 1.  The primers of qRT-PCR

        引物名称引物序列目的
        Prime namePrimer sequence (5’-3’)Purpose
        TaIPS1-qRT-FGACACTGAAGACTCGCACCAqRT-PCR
        TaIPS1-qRT-RCGGCGACTTCTCACCTCTAC
        TaSPX3-qRT-FGTGGAAGGACGAGTTCCTGAGCqRT-PCR
        TaSPX3-qRT-RTCCCGGTGTGTGATGATGAAGAA
        TaPHT1.1/9-qRT-FGAGACCGGCTACTCACGGGqRT-PCR
        TaPHT1.1/9-qRT-RCTAAGCTTCGATGCCATCGTC
        TaPHT1.10-qRT-FGCGTTCGGGTTCCTGTATGCqRT-PCR
        TaPHT1.10-qRT-RCAGTCGGAGCAATGGTGTCGT
        TaAPT1-qRT-FCGAATCAGTATGAAACAAGTTGTGACTCTTqRT-PCR
        TaAPT1-qRT-RTCCCAAACAGTTCCAGAAGGACAAAT
      • DCB-Fe通常被用来评价根表铁的富集情况。DCB-Fe的提取方法如下:缺磷处理7天的小麦幼苗根系在自来水中浸泡过夜后,在超纯水中清洗3~4次后置于DCB萃取液(萃取液包含40 mL 0.3 mol/L Na3C6H5O7·2H2O,5.0 mL 1.0 mol/L NaHCO3和3.0 g Na2S2O4)中,常温下浸泡3小时;浸提后的根系使用超纯水清洗2~3次后置于普通烘箱中70℃烘干至恒重后称重;上清液及清洗液收集后定容至100 mL,过滤后在ICP(Inductive Coupled Plasma Emission Spectrometer)上测定DCB-Fe含量[48]

      • 每个试验至少有3次独立的生物学重复,数据均用SPSS20.0进行分析,ANOVA分析采用Duncan’s multiple range test进行检测。

      • 根据先前的报道,将植物缺磷分为早期(1天内)、中期(3天内)和长期(7天后)3个阶段,本研究小组前期的试验结果显示,缺磷7天后小麦幼苗体内无机磷浓度降至最低[23, 49]。因此,我们对磷高效小麦基因型‘小偃54’和磷低效小麦基因型‘中国春’幼苗的缺磷time-course响应进行了探索。如图1所示,随着生长时间的延长,小麦幼苗的生物量逐渐增加;当缺磷3天后,缺磷处理的小麦幼苗生物量与正常培养相比明显减小。不同基因型之间,无论正常培养还是缺磷处理,‘中国春’小麦幼苗地上部的生物量均高于‘小偃54’(图1A),然而地下部生物量无明显差异(图1B)。在缺磷7天后,缺磷处理的小麦幼苗的根冠比与正常培养的相比有增大的趋势;无论缺磷处理与否,‘小偃54’的根冠比明显高于‘中国春’(图1C)。

        图  1  缺磷对两个不同磷效率小麦基因型幼苗生物量的影响

        Figure 1.  Effect of the time-course response of Pi starvation on the biomass of two contrasting Pi-efficient wheat genotypes

      • 缺磷明显影响了小麦幼苗的生物量,因此,我们进一步调查了两个小麦基因型体内无机磷和总磷浓度响应缺磷的变化。如图2A图2B所示,在缺磷6 h后,两个小麦幼苗地上部、地下部的无机磷浓度开始有降低的趋势,缺磷12 h后,地上、地下部无机磷浓度显著低于正常培养;且随着缺磷时间的延长,小麦幼苗体内的无机磷浓度逐渐降低;缺磷7天后,地上、地下部的无机磷浓度降至最低。但对于不同品种之间,无论正常培养还是缺磷处理后,无机磷浓度之间无明显差异。两个小麦基因型地上、地下部的总磷含量的变化趋势与无机磷浓度变化趋势相同。缺磷6 h后,小麦幼苗地下部总磷浓度开始降低,地上部无明显差异;至缺磷1天后,缺磷后的小麦幼苗地上、地下部总磷浓度显著低于正常培养,至7天时,总磷浓度降至最低,但两个基因型之间无明显差异(图2 C,D)。

        图  2  缺磷对两个不同磷效率小麦基因型幼苗无机磷和总磷浓度的影响

        Figure 2.  Effect of the time-course response to Pi starvation on the concentrations of Pi and total P in two contrasting Pi-efficient wheat genotypes

      • 上述试验表明,‘中国春’和‘小偃54’幼苗在缺磷条件下的无机磷和总磷浓度变化趋势基本相同。为了进一步探索两个基因型幼苗在响应缺磷的异同,因此,我们对缺磷7天后的小麦幼苗进行了恢复供磷实验。结果显示,随着恢复供磷时间的延长,小麦幼苗地上、地下部的无机磷浓度迅速增加,但直至复磷24 h后,无论地上还是地下,小麦幼苗体内的无机磷浓度都显著小于正常培养的小麦幼苗(图3)。而对于两个基因型来说,在恢复供磷6 h (7 d+6 h)后,‘小偃54’地上部的无机磷浓度明显高于‘中国春’,地下部则无明显差异;而在恢复供磷12 h后,‘小偃54’幼苗地上和地下部的无机磷浓度均显著高于‘中国春’。由此表明,‘小偃54’幼苗的磷吸收和转运能力明显比‘中国春’强,这可能是‘小偃54’耐低磷的重要原因。

        图  3  缺磷 7d 后恢复供磷对两个不同磷效率小麦基因型无机磷浓度的影响

        Figure 3.  Effect of Pi resupply after the 7-day-Pi-deprivation on the concentrations of Pi in two contrasting Pi-efficient wheat genotypes

      • 尽管缺磷处理后的两个基因型小麦幼苗无机磷和总磷浓度无明显差别,但‘小偃54’在缺磷后复磷过程中具有明显更快的磷吸收能力。基于此,我们进一步评价了缺磷响应基因表达在缺磷time-course响应中的表达情况。如图4A图4B所示,在缺磷6 h时,缺磷响应的信号基因TaIPS1TaSPX3在小麦幼苗根系中即被诱导上调表达,且随着缺磷时间的延长,它们的表达量迅速升高;而当对缺磷的小麦幼苗恢复供磷后,二者的表达量明显下降。不同基因型之间,‘中国春’TaIPS1TaSPX3的表达量在缺磷6 h就明显被诱导升高;而‘小偃54’中TaIPS1在缺磷12 h后才表现出被上调表达的趋势;且直到缺磷3天时,两个基因在‘中国春’幼苗中的表达量均明显高于‘小偃54’。但在缺磷7天后以及缺磷后恢复供磷处理,两个基因在‘小偃54’幼苗中的表达量仍明显高于‘中国春’。鉴于两个小麦基因型明显不同的磷吸收能力,因此我们也分析了在小麦根系特异表达的磷转运子的表达情况。在缺磷响应中,两个磷转运子TaPHT1.1/9TaPHT1.10表现出相同的表达趋势,即在缺磷早期表达被抑制,随着缺磷时间的延长,表达量被诱导升高;未预料到的是,它们在缺磷后恢复供磷时被剧烈诱导表达,明显高于缺磷8天的表达量(图4 C和D)。尽管如此,它们在两个小麦基因型间也表现出明显的差异。‘小偃54’中,TaPHT1.1/9TaPHT1.10在缺磷24 h后即被显著诱导升高,但在‘中国春’中,缺磷7天后才诱导表达升高。而从生长13天(正常培养13天或缺磷处理3天后)开始,TaPHT1.1/9在‘小偃54’中的表达量明显高于’中国春’;TaPHT1.10在二者之间无明显差异。复磷24 h后,‘中国春’TaPHT1.10的表达量高于‘小偃54’。

        图  4  缺磷对不同磷效率小麦基因型缺磷响应基因表达的影响

        Figure 4.  Effect of the time-course response to Pistarvation on the expression levels of Pi-starvation responsive genes in two contrasting Pi-efficient wheat genotypes

      • 最近的报道表明,拟南芥在缺磷2 h内即引起了根表铁(DCB-Fe)的过量积累和重新分布,致使细胞壁硬化和根尖分生组织生长停滞;尽管铁的过量累积对水稻根系重塑的影响较小,但缺磷早期,水稻根表铁即被明显富集。因此,根表铁可能是一个重要的信号参与了植物的缺磷响应[32-33,36,38]。那么,根表铁在不同磷效率小麦基因型之间是否有差异仍未见报道。因此,正常生长10天的小麦幼苗缺磷处理7天后,根表Fe含量被测定。与正常培养相比,缺磷7天后的‘中国春’小麦幼苗根系的DCB-Fe含量显著升高,增加了约58.0%,而‘小偃54’幼苗根系DCB-Fe含量在正常培养和缺磷处理间无明显差异(图5)。

        图  5  缺磷对不同磷效率小麦基因型根系DCB-Fe含量的影响

        Figure 5.  Effect of Pi starvation on the DCB-Fe content in the root of two contrasting Pi-efficient wheat genotypes

      • 磷是植物生长的必需元素,而小麦是磷肥需求量最多的作物。因此探索小麦磷的高效利用对磷肥的合理施用和环境保护具有重要意义。本研究中选取了两个不同磷效率小麦基因型‘中国春’和‘小偃54’。其中,‘中国春’是小麦中的模式植物,有着生长快、适应性强、易转化等特点,随着以‘中国春’为背景的基因组序列的释放,为在分子层面探索小麦缺磷响应提供了便利[50,51]。‘小偃54’已经被报道是磷高效基因型,在低磷土中仍然保持着良好的生长状态和较高的产量,是探索小麦磷高效利用的优良材料[40]。尽管如此,这两个小麦基因型在苗期的生理和分子层面的比较仍未见报道。而且探索不同磷效率小麦基因型缺磷响应的差异,对于挖掘磷高效利用基因,提前预测小麦缺磷和提高小麦磷利用效率具有重要意义。

        本研究发现,磷高效小麦基因型‘小偃54’幼苗地上部生物量明显小于磷低效小麦基因型‘中国春’,但‘小偃54’具有明显更大的根冠比(图1)。通过对两个基因型幼苗在缺磷time-course响应比较发现,缺磷胁迫明显降低了小麦幼苗地上部的生物量,而增加了小麦幼苗的根冠比(图1 C)。Yan等[52]通过盆栽实验发现,相同磷水平下,‘小偃54’的根系生物量和根冠比明显高于磷低效小麦基因型京411,且具有更高的磷利用效率;另一个报道也指出缺磷胁迫下‘小偃54’具有明显更发达的根系和更强的根系活力[53]。尽管缺磷胁迫下两个小麦基因型幼苗体内的无机磷和总磷浓度差异不明显(图2),但在缺磷7天后恢复供磷时,‘小偃54’地上、地下部的无机磷浓度显著高于‘中国春’(图3),表明‘小偃54’具有更强的磷吸收和转运能力,这可能也是‘小偃54’在低磷土中仍保持良好的生长和产量的重要原因。Teng等基于‘小偃54’基因组的BCA文库鉴定到21个TaPHT1磷转运子[26],且大部分在酵母磷转运突变体MB192中表现出Pi转运活性,明显多于‘中国春’,这可能也是‘小偃54’具有明显高的磷吸收和转运能力的重要原因。

        尽管小麦缺磷响应的转录组数据表明,小麦的缺磷响应具有与拟南芥和水稻相似的调控网络[14],但小麦的磷转运子TaPHT1s在转录水平的缺磷time-course响应表现出明显的特异性。缺磷早期,小麦根系磷转运子TaPHT1.1/9TaPHT1.10的表达量明显受到抑制,在长期缺磷恢复供磷后,磷转运子的TaPHT1.1/9TaPHT1.10表达量明显被诱导上调表达(图4 C,D),这个结果与前期报道一致,小麦缺磷后恢复供磷,转运子TaPHT1.2也表现出更强的诱导[24],由此推测,小麦可能存在独特的磷吸收调控机制,需要进一步去挖掘。而在‘中国春’和‘小偃54’之间,磷转运子的TaPHT1.1/9TaPHT1.10的表达也不尽相同。‘小偃54’中TaPHT1.1/9表达量明显较高,而TaPHT1.10的表达在二者之间无明显差异(图4C, D)。已有报道表明,以‘中国春’基因组序列作为参考,‘小偃54’中TaPHT1.1/9在起始密码子下游810bp处发生了提前终止突变,而TaPHT1.10在起始密码子下游368bp处出现了单核苷酸缺失[26],这可能也导致了小麦不同基因型根系磷转运子在缺磷胁迫下的差异响应,进而影响了两个小麦幼苗的磷吸收速率。

        在植物缺磷响应的分子调控网络中,IPSsSPXs是植物体内指示磷稳态重要的信号基因,水稻和小麦中IPSsSPXs的同源基因的表达明显受到体内磷稳态的调控,因此,IPSsSPXs的上调表达也反映了植物对体内磷稳态的感受和缺磷响应的调控[24,49]。我们的试验结果表明,TaIPS1TaSPX3的表达在缺磷早期即被明显诱导,而缺磷后复磷时表达量被显著下调(图4 A和B)。尽管如此,两个基因型小麦在缺磷响应的不同时期也有着明显的差异。在缺磷早期,‘小偃54’的TaIPS1TaSPX3的表达量明显低于‘中国春’;然而,当缺磷后恢复供磷时,‘中国春’中TaIPS1TaSPX3的表达量的又低于‘小偃54’。表明缺磷条件下,‘中国春’幼苗对体内无机磷变化可能更为敏感。前期的报道也证明了我们的结果,Karim等[23]通过对不同铝耐性基因型小麦幼苗的缺磷响应比较发现,铝敏感基因型小麦Scout 66在缺磷条件下比铝耐性基因型小麦Atlas 66表现的更好;缺磷早期,TaIPS1TaSPX3的表达量在耐低磷小麦Scout 66中明显低于Atlas 66,而且长期缺磷后,TaIPS1TaSPX3在Scout 66中的表达量明显高于Atlas 66。以上结果表明,磷低效小麦基因型可能对体内磷稳态变化更为敏感。

        根表铁的富集是植物缺磷感受的重要指示因子。在拟南芥和水稻缺磷的早期即引起了根表铁的累积和重新分布。本研究中,我们发现缺磷明显诱导了‘中国春’小麦幼苗根表铁含量的增加,然而对‘小偃54’影响较小(图5)。最近的报道表明,缺磷差异响应的水稻基因型之间根表铁富集也存在着明显差异,且根表铁的富集程度主要受到多铜氧化酶OsLPR1的影响[38]。电化学分析表明,根表铁膜的富集导致水稻根尖受损,抑制了对磷营养的吸收[54]。这可能也是缺磷后复磷‘中国春’小麦幼苗磷吸收速率明显低于‘小偃54’的重要原因。因此,缺磷条件下,根表铁的累积可能对小麦幼苗磷的高效吸收和利用有着重要影响。

      • 与磷低效小麦基因型‘中国春’相比,磷高效小麦基因型‘小偃54’地上部生物量较小,但根冠比明显较大。在正常培养和缺磷胁迫下,两个小麦基因型幼苗无机磷和总磷无明显差异;缺磷后恢复供磷,‘小偃54’明显具有更强的磷吸收和转运能力。缺磷早期,‘中国春’中TaIPS1TaSPX3的表达量比‘小偃54’高,但在长期缺磷和缺磷后恢复供磷处理下又比‘小偃54’低。两个根系特异表达的高亲和磷转运子TaPHT1.1/9TaPHT1.10均表现出缺磷早期表达受到抑制,而长期缺磷被诱导升高;‘中国春’的磷转运子TaPHT1.1/9的表达量明显低于‘小偃54’。缺磷促进了‘中国春’根表铁的富集但对‘小偃54’无明显影响。

    参考文献 (54)
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