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粮食安全、气候变暖和环境恶化是当今世界各国面临的主要挑战。全球粮食总产量在过去的50年里增加了近150%，平均氮肥用量已达到180 kg/hm2，比世界平均用量高75%[1]。与此同时田间粮食生产过程中排放的大量温室气体和活性氮损失推动了全球气候变暖和环境恶化的进程[2]。我国氮肥施用和管理措施不尽合理，主粮作物的当季氮肥利用率仅为31%～33%，施入土壤中的部分氮肥以活性氮的形式通过NH3挥发、N2O排放、N淋溶以及径流等途径进入大气或者水体环境，加重了土壤酸化、空气污染、酸雨以及水体富营养化等环境问题[3]。因此，管控大气活性氮污染物是实现我国农业系统可持续发展，提高氮肥利用率，缓解农田生态压力的重要抓手。
研究发现，高达60%的氮投入通过NH3挥发损失到大气中，氨的挥发和再沉积还是N2O的间接排放源[4]。N2O虽以痕量存在，但却是导致全球气候变暖的重要温室气体之一，减少水田NH3和N2O损失显得尤为重要。在水稻生产过程中，减少NH3和N2O排放损失的主要方式包括施加适量氮肥、强化水肥管理、施用硝化抑制剂等[5]。硝化抑制剂(NI)是一类抑制土壤中铵态氮还原转化为硝态氮的物质，通过抑制硝化作用、反硝化作用，减少N2O和其它氮氧化物排放，直接或间接降低施用氮肥引发的气候和环境风险。
在稻田土壤土水界面，尿素中的酰胺态氮可快速水解为铵态氨[6]，除部分铵态氮随渗漏水进入土壤还原层外，大部分在土壤表面或水稻根际等氧化微区进行硝化反应产生硝态氮，添加NI能减缓铵态氮向硝态氮转化的速率，有效抑制这一反应进程，从而降低NO3−的淋溶和反硝化损失。常用的人工合成NI包括氯啶类化合物2-氯-6-三氯甲基吡啶(nitrapyrin，NP)、双氰胺(DCD)、3,4-二甲基吡唑磷酸盐(DMPP)等，近年来的研究表明，DCD和NP硝化抑制效果欠佳，DMPP可显著减少旱季土壤氮素的流失，但在水稻田环境下的效果差别较大[7−9]。李杰等[10]研究发现，DMPP在培养后30天内，稻田土壤N2O排放量减少78.3%。刘发波等[11]研究发现，DMPP对潮土铵态氮向硝态氮转化抑制效果优于水稻土，而对红壤硝化作用的抑制效果不明显，其中pH值是影响硝化抑制剂作用效果的主因。目前对DMPP影响水稻土氮素转化的微生物学机制还缺乏足够的认识，相关机理还亟需探索。
由于NI延长了铵态氮在土壤中的存留时间，可能会增加氨挥发损失风险[12]。周玉玲[13]研究表明，硝化抑制剂降低了稻田N2O排放，但氨挥发损失增加了138%，其中1%～5%的氨挥发经大气沉降、硝化和反硝化再次转化为N2O。有学者研究发现，生物炭有较大的比表面积，能够调节土壤氮库，对铵态氮有较好的吸附作用，可阻断土壤冗余氮素的迁移，降低麦季土壤氨挥发损失并提高氮素利用率[14]。但也有研究表明生物炭可提高土壤pH，因而增加氨挥发损失，还有研究认为生物炭通过影响微生物活性降低了氨挥发损失。Liu等[15]基于文献数据整合和meta分析发现，生物炭施加对农田土壤氨挥发损失量引起−12%～31%的波动。在当前减氮增产的大背景下，实现NH3和N2O协同减排是降低其大气环境效应的根本途径。
水稻田作为一类特殊的人工湿地，是我国农田生态系统的重要组成部分。由于其生长过程中需频繁淹水−排水，导致其不论在结构、功能还是物质循环过程方面均有别于旱地土壤[16]。本研究以浙江水稻土为对象，设计温室盆栽试验，探究了硝化抑制剂和生物炭施加对水稻施肥产生的气态活性N排放(主要是NH3和N2O)通量、排放强度、氮素转化的影响，并探究了其对氮素转化相关的微生物的影响，为硝化抑制剂的合理应用和减少稻田生态系统活性氮损失提供科学依据。
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供试土壤采自浙江省农业科学院海宁市许村镇杨渡科研创新基地试验田(30°31′N，120°19′E )，按照“S”型多点混合采集0—20、20—40 cm耕层土壤，采集的新鲜土样充分混匀后，一部分装入无菌自封袋，储存于4℃冰箱中；另一部分室内自然风干供土壤基本化学性质测定。表层土壤基本理化性质为：有机碳含量19.5 g/kg，速效磷含量16.9 mg/kg，速效钾含量136 mg/kg，pH 6.23。生物炭为水稻秸秆500°C条件下炭化炉热解3 h制成，其基本理化性质为：总碳含量610 g/kg，总氮含量14.3 g/kg，土壤阳离子交换量(CEC) 18.9 cmol/kg，pH 9.20。供试氮肥为尿素，由国药集团有限公司生产，氮含量46%；硝化抑制剂选用3，4-二甲基吡唑磷酸盐(DMPP)，为分析纯，由Macklin生物科技公司生产。
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盆栽试验在浙江省农业科学院温室进行。试验用聚氯乙烯盆直径25 cm，高60 cm的灰色硬质PVC筒，在填装土壤之前，在PVC管内部涂抹凡士林，避免土柱管壁效应。并且，在土柱筒内每隔10 cm均镶接1 cm厚的向下倾斜的塑料挡板，这一做法也可有效减少因管壁效应引起的淋洗过程。按照采集土壤深度分别对应装盆，底层铺垫10 cm厘米厚度石英，并在土壤表层及20、40 cm处及底部设有排水孔收集滤液(图1)。此外，每个盆栽装土22.5 kg (烘干基)，土壤容重约为1.02 kg，装土45 cm深。为了确保土层土壤容重一致，每次装5 cm夯实土壤，保证土体紧实度一致。试验设置5个处理：不施肥(N0)，只施尿素(Urea)，尿素+硝化抑制剂(DMPP)，尿素+生物炭(BC)，尿素+硝化抑制剂+生物炭(BCDM)，每个处理设置3个重复。氮肥添加量为尿素N 300 kg/hm2，氮肥用量按3∶4∶3的比例在播种、分蘖和拔节期施用。供试P、K肥为磷酸二氢钾和氯化钾，P2O5和K2O用量均为60 kg/hm2，全部基施。秸秆生物炭(过2mm筛)添加量为15 t/hm2，硝化抑制剂用量为施加纯氮量的1%。试验开始前，将基施肥料、生物炭及硝化抑制剂与盆中0—10 cm土层土壤混合均匀。水稻在2021年7月1日插秧，密度为15株/盆。在水稻移栽2周左右后，追施分蘖肥，8月15日追施穗肥。
图 1 盆栽试验及气体采样装置
Figure 1. Pot experiment and gas sampling device
整个试验过程中各试验处理水分管理条件保持一致，即淹水−中间排水−复水−排水收获，11月初收获。收获时采集土壤表层 0—10 cm样品，风干后用于土壤各项理化生物学性质分析。
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气体采集从水稻插秧第一天开始。采用Drage-Tube Method (DTM法)测定氨挥发，属于动态密闭箱原位测定[17]。测定频率为每天2次(上午8：00—9：00、下午14：00—15：00)，采集时间约为1周，直到检测不到NH3为止。用手泵抽气时，气态经过1个德尔格氨检测管，抽气结束后(抽气次数一般为5次，每次泵入气体体积100 cm3)，记录氨管读数，用于氨挥发浓度的计算。氨检测管中填充固态酸性混合物以及遇碱变蓝的pH指示剂溴苯酚，可进行0.05～700 µL/L氨气的检测。
采用密闭静态箱法采集N2O气体，采样箱规格为25 cm×25 cm×50 cm，底座长、宽各50 cm，高10 cm，采样时，底座凹槽注水密封。在每天固定时间采集N2O气体；每次通过规格为20 mL注射器在0、15、30、45 min抽取采样箱内气体。采气间隔一般在7天左右，在中间排水期提高采气频率至3～4天，持续1周。样品带回实验室于1～2天内用安捷伦气相色谱仪测定。稻田土壤表层径流液及渗漏液在水稻季每隔10天或2～3天(施肥后)同步采集持续1周。采集的水样分析前保存于−20°C冰箱，水样过0.45 µm滤膜后，部分用流动注射分析仪(Skalar San)分析水样中全氮、硝态氮与铵态氮浓度。
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水稻收割后，采集鲜土进行土壤微生物DNA 提取和qPCR分析。土壤样品DNA的提取按照土壤DNA提取试剂盒(Fast DNA SPIN Kit for soil MP-bio, USA)说明书进行操作。氨氧化细菌(AOB)定量选用amoA功能基因特异引物amoA-1F (5-GGG GTT TCTACTGGTGGT-3)和amoA-2R (5-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3)、氨氧化古菌(AOA)选用amoA功能基因特异引物amoA-F(5-STAATGG TCTGGCTTAGACG -3)和amoA-R(5-GCGGCCATCCAT CTGTATG T-3)。氧化亚氮还原酶(nosZ)定量选用功能基因特异引物noslb (5-CCCGCTGCACACCN CCTTCGA -3)和nosrb (5-CCCGCTGCACACCNCCTTCGA-3)。反应体系共 20 μL：10 μL SYBR Premix Ex TaqTM (Takara，日本)，10 μmol/L 正反引物各 1 μL，DNA 模板2 μL，灭菌超纯水补至 20 μL。PCR 扩增程序为：94℃预变性 30 s；94℃变性 45 s，60℃退火 12 s，72℃延伸 30 s，循环 40 次。PCR 扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。
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N2O直接排放速率的公式如下：
$ F=\rho \times \Delta C/\Delta t\times 273/((273+T)\times V/A) $ 式中：F为N2O排放速率[μg N2O-N/(mg2·h)]；ρ为标准状态下的N2O密度(1.25 kg/m3)；ΔC/Δt为N2O的浓度变化率ppb/h)；V为箱体实际体积(m3)；T为温度(℃)；A表示箱体占地面积(m2)。
N2O直接累积损失量计算公式如下：
$ E=\sum((f_{i}+f_{i+1})/ 2)\times(t_{i} +t_{i+1}) $ 式中：E为N2O的累积释放量(μg N/mg2)；fi和fi+1为培养ti和ti+1的N2O排放速率。
土壤 N2O总排放量=N2O直接损失量+N2O间接累积损失量
其中，间接N2O来自于NH3 的再沉降与通过淋溶径流排入地下水体系的各形态N的硝化与反硝化过程。其计算公式为：
间接 N2O=EF1×NH3-N+EF2×(TNleaching+TNleakage) (3)
式中：EF1 为 NH3 损失的 N2O 排放系数，其值为 0.01 mg N2O-N/mg N，EF2 为淋溶氮损失的N2O排放系数(EF2=0.0075 mg N2O-N/mg N)[18]。
TN淋溶 = C×V/(A×100) (4)
式中：TN淋溶是累积淋溶损失(kg N/hm2)，C是平均 N 浓度(mg N/L)，V是淋溶量(L)；A为面积(m2)。
(3) N2O排放系数(%)=[施肥区N2O排放量−不施肥处理N2O排放量]/总施氮量×100 (5)
NH3排放系数(%)=[施肥区氨挥发量−不施肥处理氨挥发量]/总施氮量×100
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采用OriginPro 9软件绘图，IBM SPASS 22.0软件对5个处理间各施肥期土壤 NH3累积排放量、N2O排放量和土壤理化性质等进行单因素分析，不同大小写英文字母表示表示各处理之间具有显著差异(P<0.005)。
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如图2a所示，基肥没有显著提升田面水中的NH4+-N浓度，追加分蘖肥和穗肥后田面水NH4+-N浓度急剧增加，最高峰出现在BC处理，浓度高达35.44 mg/L。追施分蘖肥后，Urea处理田面水NH4+-N含量较低，浓度范围为6.21～20.57 mg//L；相比于Urea处理，DMPP及BCDM处理NH4+-N含量有所增加，浓度范围分别为5.08～25.38 mg/L及6.65～24.23 mg/L。追施穗肥后，各处理NH4+-N含量变化趋势基本一致；田面水NH4+-N浓度急剧增加，最高峰出现在BCDM处理，浓度最高为26.17 mg/L；其次为BC处理18.33 mg/L (图2a)。
图 2 不同生物炭和DMPP处理水稻田面水中的NH4+-N、NO3−-N含量及累积氮损失量
Figure 2. The NH4+-N、NO3−-N content and the cumulative N loss in surface water of biochar and DMPP treatments
图2b为插秧后田面水中的 NO3−-N浓度变化。各处理田面水NO3−-N含量普遍较低，浓度范围在0.02～4.46 mg/L；其中，在基肥和穗肥期，田面水中NO3−-N含量高峰均出现在施肥第2天的Urea处理，浓度分别为4.46及2.76 mg/L，BCDM、DMPP处理分别降低NO3−-N含量高达80.04%及56.88%。图2c为田面水的累积氮(N)损失量，其损失范围为0.42～9.62 kg /hm2；与Urea处理相比，BC和DMPP单施或配施均显著降低田面水累计氮损失量，降幅最大为95.63% (BCDM)，其次为DMPP (89.81%)及BC处理 (62.68%)。
不同施肥处理水稻渗漏水NH4+-N含量动态变化如图3所示。试验期间，0—20 cm渗漏水NH4+-N浓度介于0.83～44.59 mg/L (图3a)，分蘖肥和穗肥期NH4+-N浓度介于−0.25～4.66 mg/L，基肥期显著高于分蘖肥和穗肥期；生物炭和DMPP施加显著提高了3个施肥时期NH4+-N含量。在20—40 cm土壤渗漏水中，与Urea处理相比，BC、DMPP及BCDM均增加了NH4+-N含量(图3b)。
图 3 施用生物炭和DMPP水稻土渗漏水中的无机氮含量
Figure 3. Inorganic nitrogen content in leakage water of paddy field applied with biochar and DMPP
试验期间，0—20 cm基肥期、分蘖肥和穗肥期的渗漏水NO3−-N浓度范围分别在29.07～68.33、0.37～37.5和0.2～36.73 mg/L，20—40 cm的范围分别在9.25～12.74、−0.37～5.11、0. 17～2.19 mg/L，Urea处理基肥期间渗漏水中NO3−-N浓度同样处于较高水平(图3c～d)。各处理累积淋溶损失量如图3e所示。渗漏损失主要集中在基肥期间，在基肥期间各处理的氮损失量占总氮损失的65%以上。Urea处理的累积渗漏损失量为N 3.67 kg/hm2，BC、BCDM及DMPP处理降低了累积渗漏损失量16.5%、27.9%及37.4%。
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水稻生长发育期，添加氮肥后土壤NH3排放速率如图4a。整体而言，水稻季各处理NH3排放速率走势一致，开始呈现增加趋势随后迅速下降。N0处理水稻NH3挥发通量在0.5 kg/(hm2·d)以下波动，其中，基肥和一追期NH3挥发速率顺序为：Urea>BCDM>DMPP>BC>N0，二追期氨挥发速率峰值大小排列为：BCDM>DMPP>Urea>BC>N0。添加基肥后Urea处理NH3释放速率峰值最高，为3.82 kg/(hm2·d)，一追后Urea处理峰值依然最高，为16.22 kg/(hm2·d)。
图 4 不同生物炭与DMPP处理下土壤NH3排放速率、累积排放量及排放系数
Figure 4. Emission rate, cumulative emission and emission coefficient of NH3 in soils as affected by biochar and DMPP addition
土壤氨挥发累积量及氨挥发的排放系数如图4b所示，施加秸秆生物炭对水稻季土壤氨累积损失量具有显著降低效果；而施加DMPP对水稻季土壤氨累积损失量效果相反；不同处理间氨挥发系数也表现为同样的变化趋势。DMPP处理氨累积排放量最高为82.65 kg/(hm2·d)，其次是Urea处理73.99 k kg/(hm2·d)，BC处理64.80 kg/(hm2·d)，BCDM处理61.83 kg/(hm2·d)。
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所有处理的N2O排放通量的变化趋势大体一致(图5a)，水稻移栽后，由于施用氮肥的原因(除N0处理)，都出现明显的排放峰，但N2O排放在水稻生长季整体偏低，基肥期、分蘖肥期、中间排水期、穗肥期排放速率从大到小排列为：中间排水期>基肥>穗肥期>分蘖肥期。在中间排水期，N2O排放速率出现最大峰值，Urea处理为73.23 μg/(m2·h)，DMPP、BCDM与N0处理较低，分别为11.34、29.72、18.16 μg/(m2·h)，添加硝化抑制剂的处理N2O排放速率峰值低于未添加氮肥的处理。与Urea处理相比，硝化抑制剂单施或与生物炭配施，显著降低了三期施肥和中间排水期N2O 排放速率峰值，DMPP在三期施肥和中间排水期排放速率分别较Urea处理降低了25.7%、34.3%、64.8%、84.5%。生物炭施加主要降低分蘖期、中间排水期、穗肥期的N2O排放速率峰值。水稻种植过程中不同处理N2O损失量具有显著性差异(图5b)。单施氮肥N2O损失量最大，生物炭、DMPP分别显著降低31.50%、64.04%。四个时期累积N2O排放及N2O排放系数，顺序为：Urea>BC>BCDM>DMPP。未添加DMPP的处理N2O排放量最高均为中间排水期，添加 DMPP的两个处理N2O排放量最高发生在基肥期。
图 5 添加生物炭与DMPP对N2O排放的影响
Figure 5. N2O emission in paddy soil as affected by biochar and BCDM addition
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由图6可知，作为常规施肥的Urea处理的N2O总排放量最高，BC、DMPP和BCDM与Urea处理相比降低了N2O总排放量，降低幅度分别为23.4%、18.6%和32.2%；BC、BCDM、DMPP、N0、Urea处理 N2O直接排放对N2O总排放的贡献率分别为16.1%、9.8%、9.6%、47.2%、18.0%，NH3产生的N2O间接排放对N2O总排放的贡献率分别为83.9%、90.2%、90.5%、52.9%、82.0%；所有处理土壤N2O直接排放占据N2O总排放的次要地位，由NH3排放造成的N2O间接排放占据N2O总排放的主要地位。分蘖肥期间产生的N2O总排放在整个水稻生长期间最高，中间排水期间产生的N2O总排放最少。其中，BC、BCDM、DMPP、N0、Urea处理N2O直接排放对N2O总排放的贡献率分别为16. 1%、9.8%、9.6%、47.2%、18.0%；排放的NH3-N中约有1% (0.2%～5%)沉积到陆地后转化为N2O，考虑到当前研究中与NH3挥发相关的N2O间接排放，BC、BCDM、DMPP、Urea处理NH3对N2O总排放的贡献率分别为83.9%、90.2%、90.5%、52.9%、82.0%，氨挥发导致的N2O间接排放占据土壤N2O总排放的优势地位。DMPP和生物炭配施可同时减少N2O排放和氨挥发，进而减少其产生的N2O总排放。
图 6 不同处理水稻生育期N2O总排放量
Figure 6. Total N2O emissions in paddy soil applied with biochar and DMPP during rice growing season
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由图7可知，处理间氨氧化细菌(AOB)的amoA基因拷贝数存在显著差异。与N0处理相比，Urea和BC处理增加了基因丰度，Urea处理提高AOB数量增幅达292.7%，添加DMPP处理显著降低了AOB 基因丰度，大小顺序为 Urea>BC>N0>DMPP>BCDM。土壤氨氧化古菌(AOA)对DMPP的响应与AOB相反，施加DMPP处理的AOA数量显著高于N0处理，而BC处理的AOA丰度依然高于Urea处理。通过实时荧光定量 PCR结果发现，五个处理的nosZ基因拷贝数在11.01E+7～14.68E+7 copies/g (以干土计)，N0处理nosZ基因丰度最低，DMPP处理nosZ基因丰度明显高于其他处理，说明添加单独DMPP 处理土壤反硝化作用较强，利于N2O还原为N2，BC处理 nosZ基因数量低于Urea处理，降低了反硝化基因丰度，添加生物炭减弱了反硝化作用，BCDM与Urea处理中nosZ基因差异并不显著，说明生物炭削弱了DMPP对反硝化基因丰度的促进作用。
图 7 水稻收获后土壤AOA、 AOB及nosZ基因数量
Figure 7. The number of AOA, AOB and nosZ genes in soils as affected by biochar and DCMP addition
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农田氨挥发是氮肥损失重要途径之一。所谓的土壤氨挥发即土壤胶体吸附的NH4+离子转化为土壤溶液中的游离态，进而转化为NH3，然后通过土壤大气交换过程挥发到空气中。氨挥发反应的进行主要取决于土壤液态或固态NH4+浓度。本研究发现，与Urea处理相比，单独施加DMPP显著增加氨挥发损失，而其与生物炭配施或者单独施加生物炭处理均能显著降低氨挥发损失。添加生物炭虽然在基肥期增加了土壤NH4+浓度，反而降低了土壤氨累积挥发量。原因可能是基肥期施加的肥料和土壤混和后移栽水稻，可使生物炭与肥料充分接触，生物炭的比表面积较大，表面附着丰富的含氧官能团，对土壤中氮素有较好的吸附效果，能够降低土壤氨气排放[19]。也有研究表明短期生物炭输入显著增加土壤氨挥发，主要原因可能与生物炭会显著提高土壤pH、改善土壤通透性有关[20]，后续研究可关注生物炭吸附性能或者孔径大小对土壤氨挥发影响的差异。
土壤NH3排放是一个涉及土壤NH4+的产生及其在土壤界面迁移转化的复杂过程。已有研究表明，NH3挥发还受到氮素的其他转化过程如硝化作用的影响[21]。氨氧化微生物是NH4+氧化过程发生的主要驱动者。本研究提取土壤总DNA，通过实时荧光定量PCR方法观测水稻收割后的amoA-AOA、amoA-AOB标记基因丰度的变化。处理间氨氧化细菌(AOB)的amoA基因拷贝数存在显著差异。与N0处理相比，Urea处理提高AOB数量增幅达292.7%，添加DMPP处理显著降低了AOB基因丰度。自然环境中，虽然AOA基因数量往往高于AOB基因，甚至可高出几个数量级，然而，研究表明AOB是硝化作用的主要贡献者[22]。DMPP单独施用显著降低了AOB基因丰度，其通过抑制AOB生长繁殖而抑制硝化作用，从而减缓了NH4+-N的氧化过程，使得表层与地表水中的氨态氮含量较高，进而促进土壤氨挥发[23]。本研究的持续时间仅有一季，长期施加生物炭和DMPP配施对土壤氨挥发的影响因素及变化规律研究较少，且生物炭在农田中长期存在必然会发生自然风化和老化，自身理化性质也随之改变，对农田土壤系统的影响也随之改变，后续研究需关注生物炭和DMPP长期配施对农田生态系统氨挥发的影响研究。
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与单独施加氮处理(Urea)相比，生物炭与DMPP的添加均显著降低了土壤N2O的排放，且单施DMPP降低幅度更为明显。一般来说，土壤N2O的排放来自硝化、反硝化过程[24]。除烤田期(中间排水期)外，水稻均处于淹水状态，因此，该研究中N2O的排放主要来自于土壤的反硝化作用。中间排水期间，水分急剧减少，导致土壤通气性良好，能够促进土壤的硝化过程，促进N2O的产生和排放，因此Urea和BC处理中间排水期产生的N2O显著高于其他3个时期，这与前人研究结论一致[25]。土壤pH值、底物NO3−含量、温度、有机碳等影响土壤反硝化速率的主要因素。Joseph等[26]发现生物炭可以吸附有机物质到其表面或形成有机-矿物质结合物，从而限制微生物活动所需要的碳源或氮源，进而影响反硝化作用的进行，降低反硝化N2O的排放。Cayuela等[27]认为生物炭降低N2O排放的关键机制与生物炭的芳香化程度有关，而H∶C比是生物炭芳香度的指示因子；一般认为H∶C<0.3 (裂解温度为200～700°C)，生物炭的芳香度越高，降低N2O排放的能力越大，且可高达73%。本研究中生物炭的热解温度为500°C，具有较多的芳香结构和较小的H∶C比，因此，生物炭的施加降低了土壤N2O的排放。武丽君等[28]用柱状淋溶实验发现，生物炭能使NH4+-N和NO3−-N的淋失量达到峰值的时间推迟，起到缓释作用，从而可能减少反硝化作用所需的底物，进而影响反硝化进程及中间产物N2O的排放。反硝化过程是在多种微生物的参与下，催化NO3−还原为N2O、最终将N素还原为N2的过程[29]。反应完全的反硝化过程可将N2O还原为N2，因此反硝化过程也常被认为是吸收N2O的途径。反硝化作用呈现出对N2O的吸收还是排放取决于参与该过程的微生物及其相关酶活，当土壤中微生物缺少N2O还原酶(nosZ)或是土壤环境不适合N2O还原酶合成时，将会致使反硝化作用不彻底以N2O为终产物。因此，nosZ基因丰度直接关系到土壤中N2O的产生与排放，其被广泛用做功能标志基因来表现样品中反硝化细菌的多样性。本研究中，DMPP处理nosZ基因丰度明显高于其他处理，说明添加单独DMPP处理土壤N2O还原为N2的能力较强，生物炭单施加或与DMPP配施处理的nosZ基因数量均低于或与Urea处理无显著差异，说明生物炭添加削弱了DMPP对反硝化nosZ基因丰度的促进作用。生物炭孔隙结构发达、比表面积大，且表面官能团丰富，DMPP具有质子化氮的化学结构，可以通过静电吸附被生物炭的羧基固定或吸附，从而降低其作用效率[30]，因此，单施DMPP对土壤N2O的减排效果更佳。Zhao等[31]在小麦−玉米轮作中数据表明，DMPP也能很好的降低土壤N2O排放，这与本研究结论具有相同的结果；也有研究表明二者联合施用对农田生态系统N2O排放无显著影响[32]，可能与生物炭的性质和土壤类型、pH、水分、质地、有机质含量等因素有关。
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农业过程是导致气候变化的一个关键因素，全球约25%的温室气体排放量归因于农业土地利用；提高土壤碳库储量和减少农田温室气体排放，是世界各国确保粮食安全和应对全球气候变化的重要战略。在中国主要水稻产区，每年的氮肥施用量高达500～600 kg/hm2[33]，其产生的活性氮气体(主要是NH3、NOx和N2O)对缓解气候变化造成了重大挑战。本研究中，综合分析N2O的直接排放和间接排放总量 (间接N2O排放来自于挥发NH3的再沉降与渗漏排进水系统氮素的硝化反硝化作用)，作为常规施肥的Urea处理的累积N2O总排放量最高，与Urea处理相比，BC、DMPP和BCDM处理均降低了N2O总排放量。从单一施用外源物质时，生物炭起到了抑制氨挥发和N2O排放的作用，并减少了渗漏水无机氮的损失，故其N2O总排放量低于Urea处理；硝化抑制剂DMPP促进了氨挥发，但抑制了N2O排放和渗漏水无机氮的损失，其N2O总排放量低于Urea处理；由于淹水稻田氮损失氨挥发占主要角色，硝化抑制剂DMPP单独施加所带来的N2O总排放量高于生物炭单独施加处理，但二者配施起到了抑制效果的叠加作用。因此，根据本研究的结果，从减少活性氮温室气体排放来看，在稻田土壤中建议将生物炭与硝化抑制剂复配施用。今后将进一步关注反硝化微生物丰度及多样性对硝化抑制剂与生物炭配合施用的响应，探索生物炭和硝化抑制剂配合施用对硝化过程的影响机制及调控途径。
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生物炭和DMPP施加显著提升分蘖肥和穗肥期田面水NH4+-N浓度，降低田面水NO3−-N含量，进而影响稻田土壤环境温室气体的排放；这可能与生物炭与DMPP单独施加或配施均显著降低AOB的amoA基因拷贝数，显著增加nosZ基因拷贝数有关。进一步分析发现，生物炭与DMPP对稻季N2O排放均具有良好的减排效果。单独施加生物炭或与DMPP配施均能显著降低氨挥发损失，但配施效果优于单施效果。生物炭和DMPP配施可有效降低N2O直接排放和氨挥发导致的N2O间接排放。未来研究需进一步探索生物炭和硝化抑制剂联合施用对硝化过程的影响机制及微生物调控途径，以及联合施用对农田作物生长及温室气体排放增温效应潜能的响应。
生物炭配施DMPP降低稻田土壤NH3和N2O排放的微生物机制
Effect of biochar combined with DMPP on reducing NH3 and N2O emission in paddy soil and its microbial mechanism
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摘要:
【目的】 研究生物炭和硝化抑制剂对稻田土壤主要活性氮气体(NH3和N2O)排放的影响及机制，以提升生物炭与硝化抑制剂的减排效果。 【方法】 采集浙江典型水稻土，结合密闭箱−气相色谱法开展了盆栽试验。试验设置5个处理：不施氮肥(N0)，尿素(Urea)，尿素配施硝化抑制剂(DMPP)、生物炭(BC)、硝化抑制剂和生物炭(BCDM)，从水稻插秧后开始，监测土壤N2O及NH3排放，在基肥、分蘖肥和穗肥后，取田面水和渗漏水样，测定无机氮含量。在水稻收割后，采集鲜土提取土壤微生物DNA，利用qPCR技术分析测定氨氧化细菌(AOB)、氨氧化古菌(AOA)的amoA以及氧化亚氮还原酶nosZ的基因拷贝数。 【结果】 施加基肥后，各处理没有显著提升田面水中的NH4+-N浓度，追加分蘖肥和穗肥后，BC和DMPP处理显著提升田面水NH4+-N浓度，最高达35.44 mg/L；BCDM、DMPP处理分别降低田面水NO3−-N含量高达80.04%及56.88%。与Urea处理相比，BC和DMPP单施或配施均显著降低田面水累计氮损失量，降幅最大为95.2% (BCDM)。Urea处理20 cm和40 cm深度土层的累积渗漏氮损失量为3.67 kg N/hm2，BC、BCDM及DMPP处理降低了累积渗漏氮损失量16.5% 、27.9% 及37.4%。与Urea处理相比，BC、DMPP、BCDM处理分别显著降低了水稻基肥期与中间排水期N2O累积排放量约31.50%、64.04%、57.60%；施加DMPP显著增加了氨挥发损失量10.5%，而BC与DMPP配施或BC单独施加降低了氨挥发损失，降幅分别为25.2%和21.6%。在稻田生育期，BC、BCDM、DMPP、N0、Urea处理氨排放带来的N2O间接排放对N2O总排放的贡献率分别为83.9%、90.2%、90.5%、52.9%、82.0%。QPCR结果显示，与Urea处理相比，BC、DMPP、BCDM处理土壤AOA的amoA基因拷贝数较Urea处理增加48.0%～73.4%，AOB的基因拷贝数降低了62.7%−95.6% (P<0.05)。DMPP、BCDM处理nosZ基因拷贝数较Urea处理增加了3.7%和14.8%，BC处理无显著影响。 【结论】 生物炭和DMPP同时与肥料基施可显著降低土壤amoA-AOB 基因拷贝数，减缓土壤铵根离子的硝化过程，从而降低NO3−-N含量，减少稻田田面水、渗漏水中的无机氮含量；增加N2O还原酶nosZ基因拷贝数，促进N2O还原能力，降低N2O (N2O直接排放和NH3带来的间接排放)总排放量32.2%，是同时有效减少N2O排放和氨挥发的组合。 Abstract:【Objectives】 The effect and mechanism of biochar and nitrification inhibitor on reducing the emission of main active nitrogen gas in paddy soil and evaluate the mitigation effects of single or combined application of biochar and nitrification inhibitor. 【Methods】 a typical paddy soil in Zhejiang province was collected, and a potted experiment was conducted with airtight box gas chromatography to observe the effects of rice straw biochar and nitrification inhibitor (DMPP) on soil N2O and NH3 emissions during crop growth. Five treatments were set up: no nitrogen fertilizer (N0), urea (Urea), urea + nitrification inhibitor (DMPP), urea + biochar (BC), urea + nitrification inhibitor + biochar (BCDM), inorganic nitrogen content changes in surface and leakage water, N2O emission and ammonia volatilization were observed during the critical fertilization period of crops. Fresh soil was collected to extract soil microbial DNA, and qPCR technology was used to analyze the number of key functional microorganisms (AOB, AOA and nosZ) in the production process of active nitrogen gas to reveal its microbial mechanism. 【Results】 After base fertilization, NH4+-N concentration in surface water was not significantly increased in each treatment, after tillering and panicle fertilization, BC and DMPP treatment significantly increased NH4+-N concentration in surface water, up to 35.44 mg/L. BCDM and DMPP treatments reduced NO3−-N content of surface water up to 80.04% and 56.88%.Compared with Urea treatment, BC and DMPP alone or combined application significantly reduced the accumulated nitrogen loss in surface water up to 95.2% (BCDM).The results of nitrogen leakage at 20 cm and 40 cm soil depth of key fertilization periods (base fertilizer period, tillering period and ear fertilizer period) revealed that the cumulative leakage N loss in Urea was 3.67 kg N/hm2, while BC, BCDM and DMPP treatments reduced cumulative leakage N loss by 16.5%, 27.9% and 37.4%. Compared with Urea treatment, BC, DMPP and BCDM treatment significantly reduced the cumulative N2O emission by 31.50%, 64.04% and 57.60%, respectively, in the basal fertilizer stage and the intermediate drainage stage. DMPP significantly increased ammonia volatilization loss by 10.5%, while BC combined with DMPP or BC alone decreased ammonia volatilization loss by 25.2% and 21.6%. During the growth period of paddy field, the indirect N2O emission caused by NH3 emission in all treatments accounted for the main position of the total N2O emission, the contribution rate of NH3 to the total emission of N2O treated in BC, BCDM, DMPP and Urea treatment was 83.9%, 90.2%, 90.5%, 52.9% and 82.0%, respectively. QPCR results showed that compared with Urea treatment, BC and DMPP alone or combined application significantly increased the amoA gene copy number of AOA by 48.0%−73.4%, and decreased the amoA gene copy number of AOB by 62.7%−95.6%; DMPP alone or combined with BC increased the copy number of nosZ gene by 3.7%-14.8%, thus promoting the N2O reduction ability, and reducing N2O emission. 【Conclusions】 In the growing stage of rice, the combined application of biochar and DMPP can significantly reduce the copy number of amoA-AOB gene in soil,decrease the nitrification process, and reduce NO3−-N content, thus, reduce the inorganic nitrogen loss in surface and leakage water; it can increase the copy number of N2O reductase nosZ gene, which is a key function of active nitrogen gas production process, thus reducing the total emission of N2O (N2O direct emission and NH3 indirect emission) by 32.2%, and It is an effective combination of reduction of N2O emission and NH3 volatilization. -
Key words:
- paddy field /
- Biochar /
- DMPP /
- NH3 emission /
- N2O emission /
- amoA gene copies /
- amoA-AOB gene copies /
- nosZ gene copies
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图 2 不同生物炭和DMPP处理水稻田面水中的NH4+-N、NO3−-N含量及累积氮损失量
Figure 2. The NH4+-N、NO3−-N content and the cumulative N loss in surface water of biochar and DMPP treatments
图 3 施用生物炭和DMPP水稻土渗漏水中的无机氮含量
Figure 3. Inorganic nitrogen content in leakage water of paddy field applied with biochar and DMPP
图 4 不同生物炭与DMPP处理下土壤NH3排放速率、累积排放量及排放系数
Figure 4. Emission rate, cumulative emission and emission coefficient of NH3 in soils as affected by biochar and DMPP addition
图 5 添加生物炭与DMPP对N2O排放的影响
Figure 5. N2O emission in paddy soil as affected by biochar and BCDM addition
图 6 不同处理水稻生育期N2O总排放量
Figure 6. Total N2O emissions in paddy soil applied with biochar and DMPP during rice growing season
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