• ISSN 1008-505X
  • CN 11-3996/S

留言板

尊敬的读者、作者、审稿人, 关于本刊的投稿、审稿、编辑和出版的任何问题, 您可以本页添加留言。我们将尽快给您答复。谢谢您的支持!

姓名
邮箱
手机号码
标题
留言内容
验证码

降解玉米秸秆真菌复合菌系的构建及其降解效果评价

江高飞 杨天杰 郑海平 韦中 王世梅 樊晓腾 沈其荣 徐阳春

引用本文:
Citation:

降解玉米秸秆真菌复合菌系的构建及其降解效果评价

    作者简介: 江高飞 E-mail: gjiang@njau.edu.cn;
    通讯作者: 徐阳春, E-mail:ycxu@njau.edu.cn
  • 基金项目: 国家重点研发计划 (编号2017YFD0800203);江苏省自然科学基金项目 (SBK20180527和SBK2019040382)

Construction and evaluation of fungal consortia effect on maize straw degradation

    Corresponding author: XU Yang-chun, E-mail:ycxu@njau.edu.cn
  • 摘要:   【目的】  秸秆的木质纤维素含量丰富、结构复杂,需要多种微生物及其降解酶的协调作用进行降解,增加秸秆降解菌剂中菌株的多样性有利于提升还田秸秆的降解效果。本研究旨在探究菌株多样性和组成,影响复合菌系秸秆降解的效果及原因,为复合菌系在秸秆降解中的应用提供理论支撑。  【方法】  通过富集驯化培养从玉米秸秆还田土壤中筛选具有秸秆降解能力的真菌,从中挑选5株高效秸秆降解真菌进行基因间隔区序列 (ITS) 测序和物种鉴定,明确其分类地位。通过全组合构建菌株多样性为1~5的复合菌系,分别检测复合菌系的秸秆相对降解率及其滤纸酶、纤维素内切酶和木聚糖酶活性,利用方差分析和相关性分析等方法研究菌株多样性和组成对复合菌系的玉米秸秆降解效果及其纤维素酶活性的影响。  【结果】  筛选获得13株具有秸秆降解能力的真菌,其中5株真菌的秸秆降解效果好、纤维素水解能力强。经ITS序列鉴定和系统发育分析发现5株降解真菌的遗传差异较大,Z7-6、F7-5、F4-3、L1-1和J2-5与草酸青霉 (Z7-6: Penicillium oxalicum)、烟曲霉 (F7-5: Aspergillus fumigatus)、哈茨木霉 (F4-3: Trichoderma harzianum)、白耙齿菌 (L1-1: Irpex lacteus) 和木贼镰刀菌 (J2-5: Fusarium equiseti) 的ITS序列相似度均超过99.95%。全组合复配结果表明,复合菌系的秸秆降解能力和纤维素酶活力均高于各单一菌株,且随着菌株多样性水平的增加而提高。滤纸酶、纤维素内切酶和木聚糖酶的活力越强,复合菌系对玉米秸秆的降解效果越好,而其秸秆相对降解率主要取决于滤纸酶和纤维素内切酶的活性。抽样效应分析发现,不同菌株对复合菌系的秸秆降解效果、滤纸酶和纤维素内切酶活性的影响不同。不含菌株F7-5的复合菌系降解效果显著优于含有该菌株的组合,以Z7-6 (P. oxalicum)、F4-3 (T. harzianum)、L1-1 (I. lacteus) 和J2-5 (F. equiseti) 组合F1的玉米秸秆降解效果最佳、酶活力最高。  【结论】  秸秆降解复合菌系的构建过程需要同时考虑多样性效应和抽样效应,增加降解菌的多样性有助于增强秸秆的降解效果。本研究筛选获得的复合菌系F1在玉米秸秆降解中具有潜在的应用前景。
  • 图 1  菌株鉴定 (A) 和秸秆降解效果的菌株多样性效应 (B)

    Figure 1.  Strain identification (A) and fungal diversity effect on maize straw degradation (B)

    图 2  三种纤维素酶活与复合菌系的菌株多样性 (A) 和相对降解率 (B) 的关系

    Figure 2.  Relationship between enzyme activity and strain richness (A) and relative degradation (B)

    图 3  复合菌系的抽样效应 (A) 和菌株F7对复合菌系秸秆降解效果的影响 (B)

    Figure 3.  Sampling effect of fungal consortia (A) and effect of strain F7 on maize straw degradation (B)

    表 1  菌株复配试验处理设置

    Table 1.  Constructionof compound strains for test

    菌株丰富度
    Species richness
    组合
    Combination
    (No.)
    复配方法
    Settings
    1 5每株菌单独接种,重复两次
    Single inoculation of each strain, 2 repeats
    2105株菌任选2株复配后接种,重复一次
    Random2 out of 5 strains for inoculation, 1 repeat
    3105株菌任选3株复配后接种,重复一次
    Random 3 out of 5 strains for inoculation, 1 repeat
    4 55株菌任选4株复配后接种,重复一次
    Random 4 out of 5 strains for inoculation, 1 repeat
    5 15菌株全部复配后接种,重复三次
    Co-inoculation of 5 strains, 3 repeats
    合计 Total31
    下载: 导出CSV

    表 2  复合菌株的秸秆降解效果及其酶活性多样性效应

    Table 2.  Diversity effect on maize straw degradation and enzyme activity of fungal consortia

    项目
    Item
    多样性效应 Diversity effect
    自由度 dfFF-valuePP-value
    相对降解率 Relative degradation efficiency4, 338.1280.0001
    滤纸酶活性 FPe activity4, 3313.23 < 0.0001
    纤维素内切酶活性 CMCase activity4, 331.5970.1980
    木聚糖酶活性 Xylanase activity4, 331.1440.3530
    下载: 导出CSV

    表 3  不同菌株对复合菌系秸秆降解效果及其酶活的抽样效应

    Table 3.  Sampling effect of each strain on the degradation and enzyme activity of fungal community

    菌株
    Strain
    自由度
    df
    相对降解率 Relative degradation efficiency滤纸酶活性 FPe activity纤维素内切酶活性 CMCase activity
    FF-value PP-value FF-value PP-value FF-value PP-value
    Z7 1, 32 52.05 < 0.0001↑ 52.05 0.0010↑ 18.01 0.0002↑
    F71, 320.010.9237↓0.010.0074↑0.510.4786↓
    F41, 3211.300.0020↑11.30 < 0.0001↑10.640.0026↑
    L11, 328.920.0054↑8.920.0001↑0.150.7043↑
    J21, 324.820.0354↑4.820.3111↑1.070.3097↓
    汇总 Summary5, 32F = 15.42; R2 = 0.7067;
    P < 0.0001
    F = 18.95; R2 = 0.7475;
    P < 0.0001
    F = 6.08; R2 = 0.4870;
    P < 0.0005
    下载: 导出CSV
  • [1] 宋大利, 侯胜鹏, 王秀斌, 等. 中国秸秆养分资源数量及替代化肥潜力[J]. 植物营养与肥料学报, 2018, 24(1): 1–21. Song D L, Hou S P, Wang X B, et al. Nutrient resource quantity of crop straw and its potential of substituting[J]. Chinese Journal of Plant Nutrition and Fertilizers, 2018, 24(1): 1–21. doi:  10.11674/zwyf.17348
    [2] 高静, 朱捷, 黄益国, 等. 农作物秸秆还田研究进展[J]. 作物研究, 2019, 33(6): 597–602. Gao J, Zhu J, Huang Y G, et al. Discussion on the utilization methods of straw[J]. Chinese Journal of Crop Research, 2019, 33(6): 597–602.
    [3] Yu Q, Liu R, Li K, et al. A review of crop straw pretreatment methods for biogas production by anaerobic digestion in China[J]. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 2019, 107: 51–58. doi:  10.1016/j.rser.2019.02.020
    [4] 朱丹, 王敬敬, 赵思崎, 等. 关于秸秆微生物降解的文献计量分析[J]. 微生物学通报, 2020, 47(8): 2550–2559. Zhu D, Wang J J, Zhao S Q, et al. Bibliometric analysis of straw degradation by microorganisms[J]. Chinese Journal of Microbiology China, 2020, 47(8): 2550–2559.
    [5] 张斯童, 兰雪, 李哲, 等. 微生物降解玉米秸秆的研究进展[J]. 吉林农业大学学报, 2016, 38(5): 517–522. Zhang S T, Lan X, Li Z, et al. Research progress of microbial degradation of corn straw[J]. Journal of Jilin Agricultural University, 2016, 38(5): 517–522.
    [6] Yan Y, Wen J, Tan H, et al. Research progress and application on the cellulase[J]. Asia-Pacific Journal of Biology, Science Publishing Group, 2019, 2(1): 6.
    [7] Jiménez D J, Dini-Andreote F, Deangelis K M, et al. Ecological insights into the dynamics of plant biomass-degrading microbial consortia[J]. Trends in Microbiology, 2017, 25(10): 788–796. doi:  10.1016/j.tim.2017.05.012
    [8] 李鹤, 张恒芳, 秦治家, 等. 低温秸秆降解菌的研究进展[J]. 中国农学通报, 2014, 30(33): 116–119. Li H, Zhang H F, Qin Z J, et al. Advanced in microbiological agent of straw degradation under low temperature[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2014, 30(33): 116–119. doi:  10.11924/j.issn.1000-6850.2014-1287
    [9] 王少昆, 赵学勇, 黄文达, 等. 科尔沁沙质草地纤维素分解菌的筛选、鉴定及其分解能力[J]. 中国沙漠, 2015, 35(6): 1584–1591. Wang S K, Zhao X Y, Huang W D, et al. Isolation and identification of cellulose decomposing fungi and their decomposition ability in the Khorchin sandy grassland[J]. Chinese Journal of Desert Research, 2015, 35(6): 1584–1591. doi:  10.7522/j.issn.1000-694X.2014.00047
    [10] 李静, 张瀚能, 赵翀, 等. 高效纤维素降解菌分离筛选、复合菌系构建及秸秆降解效果分析[J]. 应用与环境生物学报, 2016, 22(4): 0689–0696. Li J, Zhang H N, Zhao C, et al. Isolation and screening of cellulose decomposing microbe and the straw decomposing effect of complex microbial system[J]. Chinese Journal of Applied & Environmental Biology, 2016, 22(4): 0689–0696.
    [11] 顾文杰, 徐有权, 徐培智, 等. 酸性土壤中高效半纤维素降解菌的筛选与鉴定[J]. 微生物学报, 2012, 52(10): 1251–1259. Gu W J, Xu Y Q, Xu P Z, et al. Screening and identification of hemicellulose degrading microorganisms in acid soil[J]. Chinese Journal of Acta Microbiologica Sinica, 2012, 52(10): 1251–1259.
    [12] 邓兵, 贾军, 艾士奇, 等. 常温降解玉米秸秆复合菌系及其微生物多样性研究[J]. 可再生能源, 2017, 35(8): 1127–1134. Deng B, Jia J, Ai S Q, et al. The screening and diversity of a bacterial community capable of degrading corn straw at 30℃[J]. Chinese Journal of Renewable Energy, 2017, 35(8): 1127–1134.
    [13] 徐炜, 马志远, 井新, 等. 生物多样性与生态系统多功能性:进展与展望[J]. 生物多样性, 2016, 24(1): 55–71. Xu W, Ma Z Y, Jing X, et al. Biodiversity and ecosystem multifunctionality: advances and perspectives[J]. Chinese Journal of Biodiversity Science, 2016, 24(1): 55–71. doi:  10.17520/biods.2015091
    [14] Boddy L. Interspecific combative interactions between wood-decaying basidiomycetes[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2000, 31(3): 185–194. doi:  10.1111/j.1574-6941.2000.tb00683.x
    [15] Hättenschwiler S, Fromin N, Barantal S. Functional diversity of terrestrial microbial decomposers and their substrates[J]. Comptes Rendus Biologies, 2011, 334(5): 393–402.
    [16] Eichorst S A, Varanasi P, Stavila V, et al. Community dynamics of cellulose-adapted thermophilic bacterial consortia[J]. Environmental Microbiology, 2013, 15(9): 2573–2587. doi:  10.1111/1462-2920.12159
    [17] 徐春淼, 韦中, 廖汉鹏, 等. 一种评价稻秆降解菌分解能力的方法[J]. 南京农业大学学报, 2015, 38(3): 417–423. Xu C M, Wei Z, Liao H P, et al. Study on evaluation of the degradation ability of rice straw-degrading bacteria[J]. Journal of Nanjing Agricultural University, 2015, 38(3): 417–423. doi:  10.7685/j.issn.1000-2030.2015.03.010
    [18] White T J, Bruns T, Lee S, Taylor J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics[A]. Innis M, Gelfand D, Sninsky J. PCR Protocols: A guide to methods and applications[M]. San Diego, Calif.: Academic Press, Inc, 1990, 31: 315−322.
    [19] Parry N J, Beever D E, Owen E, et al. Biochemical characterization and mechanism of action of a thermostable beta-glucosidase purified from Thermoascus aurantiacus[J]. Biochemical Journal, 2001, 353: 117–127. doi:  10.1042/bj3530117
    [20] Yang T, Han G, Yang Q, et al. Resource stoichiometry shapes community invasion resistance via productivity-mediated species identity effects[J]. Proceedings. Biological Sciences, 2018, 285(1893): 2018–2035.
    [21] Byrnes J E K, Gamfeldt L, Isbell F, et al. Investigating the relationship between biodiversity and ecosystem multifunctionality: challenges and solutions[J]. Methods in Ecology and Evolution, 2014, 5(2): 111–124. doi:  10.1111/2041-210X.12143
    [22] 宋云皓, 满都拉, 郜晋楠, 等. 玉米秸秆纤维素降解菌的筛选及复合菌系的构建[J]. 饲料工业, 2017, 38(19): 33–37. Song Y H, Man D L Gao J N, et al. Screening of cellulose-degrading bacteria for corn straw and construction combined strains[J]. Siliao Gongye, 2017, 38(19): 33–37.
    [23] 李春黎, 李文豪, 余君, 等. 烟秆高效复合降解菌群的筛选、鉴定及组合应用[J]. 中国烟草科学, 2019, 40(6): 26–32. Li C L, Li W H, Yu J, et al. Screening, identification and combination of high efficiency degrading bacteria for tobacco stem[J]. Journal of Chinese Tobacco Science, 2019, 40(6): 26–32.
    [24] Jousset A, Schmid B, Scheu S, et al. Genotypic richness and dissimilarity opposingly affect ecosystem functioning[J]. Ecology Letters, 2011, 14(6): 537–545. doi:  10.1111/j.1461-0248.2011.01613.x
    [25] Alessi A M, Bird S M, Oates N C, et al. Defining functional diversity for lignocellulose degradation in a microbial community using multi-omics studies[J]. Biotechnology for Biofuels, 2018, 11: 166. doi:  10.1186/s13068-018-1164-2
  • [1] 王义坤苏厚文段亚楠李前进陈学森沈向尹承苗毛志泉 . 三种菌肥对连作平邑甜茶根系生长和土壤真菌群落多样性的促进效应. 植物营养与肥料学报, doi: 10.11674/zwyf.19122
    [2] 刘佳欢王倩罗人杰陈喜孙淑娟 . 黄腐酸肥料对小麦根际土壤微生物多样性和酶活性的影响. 植物营养与肥料学报, doi: 10.11674/zwyf.18363
    [3] 李桂花郭俊娒姜慧敏张建峰 . 有机肥和秸秆炭分别替代部分尿素和秸秆降低黑土温室效应的效果. 植物营养与肥料学报, doi: 10.11674/zwyf.18159
    [4] 孟应宏冯瑶黎晓峰刘元望李兆君 . 土霉素降解菌筛选及降解特性研究. 植物营养与肥料学报, doi: 10.11674/zwyf.17161
    [5] 毛云飞于文章王增辉杨恒峰张佳腾高付凤陈学森毛志泉沈向 . 土施维生素B6对苹果园土壤微生物多样性的影响. 植物营养与肥料学报, doi: 10.11674/zwyf.17323
    [6] 张雪艳张亚萍许帆田兴武刘馨祁娟霞李建设 . 不同种植年限黄瓜温室土壤线虫群落结构及多样性的比较. 植物营养与肥料学报, doi: 10.11674/zwyf.16246
    [7] 张丽娟曲继松朱倩楠吴涛 . 不同剂量外源纤维素酶对设施土壤生物活性与番茄生长的影响. 植物营养与肥料学报, doi: 10.11674/zwyf.16323
    [8] 李继福薛欣欣李小坤任涛邹家龙陈华东丛日环周鹂鲁剑巍 . 水稻-油菜轮作模式下秸秆还田替代钾肥的效应. 植物营养与肥料学报, doi: 10.11674/zwyf.14516
    [9] 高明霞孙瑞崔全红杨学云张树兰孙本华 . 长期施用化肥对塿土微生物多样性的影响. 植物营养与肥料学报, doi: 10.11674/zwyf.2015.0624
    [10] 胡乃娟韩新忠杨敏芳张政文卞新民朱利群 . 秸秆还田对稻麦轮作农田活性有机碳组分含量、酶活性及产量的短期效应. 植物营养与肥料学报, doi: 10.11674/zwyf.2015.0211
    [11] 陆海飞郑金伟余喜初周惠民郑聚锋张旭辉刘晓雨程琨李恋卿潘根兴 . 长期无机有机肥配施对红壤性水稻土微生物群落多样性及酶活性的影响. 植物营养与肥料学报, doi: 10.11674/zwyf.2015.0310
    [12] 王戈杨焕文赵正雄李佛琳易建华 . 不同抗性烤烟品种根际微生物数量及多样性差异研究. 植物营养与肥料学报, doi: 10.11674/zwyf.2012.11257
    [13] 陈胜男谷洁付青霞孙薇钱勋高华秦清军 . 接种自生固氮菌对玉米根际土壤酶活性和细菌群落功能多样性的影响. 植物营养与肥料学报, doi: 10.11674/zwyf.2012.11325
    [14] 刘爽范丙全 . 秸秆纤维素降解真菌QSH3-3的筛选及其特性研究. 植物营养与肥料学报, doi: 10.11674/zwyf.2012.11101
    [15] 裴雪霞周卫梁国庆孙静文王秀斌李双来 . 长期施肥对黄棕壤性水稻土氨氧化细菌多样性的影响. 植物营养与肥料学报, doi: 10.11674/zwyf.2011.0121
    [16] 房玉林屈雁朋张稼涵孟江飞刘金串程宝森栾丽英 . 西北地区赤霞珠葡萄根际土壤中AM真菌的多样性. 植物营养与肥料学报, doi: 10.11674/zwyf.2011.0117
    [17] 解开治徐培智李康活周少川陈建生唐拴虎张发宝黄旭 , . 三种不同种植模式对土壤细菌群落多样性的影响. 植物营养与肥料学报, doi: 10.11674/zwyf.2009.0518
    [18] 都韶婷杜静章永松林咸永于承艳 . 纤维素降解菌对农业有机废弃物发酵进行CO2施肥的作用. 植物营养与肥料学报, doi: 10.11674/zwyf.2007.0414
    [19] 张电学韩志卿刘微高书国候东军李国舫常连生 . 不同促腐条件下玉米秸秆直接还田的生物学效应研究. 植物营养与肥料学报, doi: 10.11674/zwyf.2005.0606
    [20] 江木兰宋玉萍张学江 . 土壤中大豆根瘤菌优势类群以及与寄主共生关系的多样性. 植物营养与肥料学报, doi: 10.11674/zwyf.1995.0210
  • 加载中
WeChat 点击查看大图
图(3)表(3)
计量
  • 文章访问数:  41
  • HTML全文浏览量:  13
  • 被引次数: 0
出版历程
  • 收稿日期:  2020-07-28

降解玉米秸秆真菌复合菌系的构建及其降解效果评价

    作者简介:江高飞 E-mail: gjiang@njau.edu.cn
    通讯作者: 徐阳春, ycxu@njau.edu.cn
  • 1. 南京农业大学,南京农业大学资源与环境科学学院/作物免疫重点实验室/江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室/江苏省有机固体废弃物资源化协同创新中心/国家有机类肥料工程技术研究中心,南京 210095
  • 2. 河南师范大学,河南新乡 453000
  • 基金项目: 国家重点研发计划 (编号2017YFD0800203);江苏省自然科学基金项目 (SBK20180527和SBK2019040382)
  • 摘要:   【目的】  秸秆的木质纤维素含量丰富、结构复杂,需要多种微生物及其降解酶的协调作用进行降解,增加秸秆降解菌剂中菌株的多样性有利于提升还田秸秆的降解效果。本研究旨在探究菌株多样性和组成,影响复合菌系秸秆降解的效果及原因,为复合菌系在秸秆降解中的应用提供理论支撑。  【方法】  通过富集驯化培养从玉米秸秆还田土壤中筛选具有秸秆降解能力的真菌,从中挑选5株高效秸秆降解真菌进行基因间隔区序列 (ITS) 测序和物种鉴定,明确其分类地位。通过全组合构建菌株多样性为1~5的复合菌系,分别检测复合菌系的秸秆相对降解率及其滤纸酶、纤维素内切酶和木聚糖酶活性,利用方差分析和相关性分析等方法研究菌株多样性和组成对复合菌系的玉米秸秆降解效果及其纤维素酶活性的影响。  【结果】  筛选获得13株具有秸秆降解能力的真菌,其中5株真菌的秸秆降解效果好、纤维素水解能力强。经ITS序列鉴定和系统发育分析发现5株降解真菌的遗传差异较大,Z7-6、F7-5、F4-3、L1-1和J2-5与草酸青霉 (Z7-6: Penicillium oxalicum)、烟曲霉 (F7-5: Aspergillus fumigatus)、哈茨木霉 (F4-3: Trichoderma harzianum)、白耙齿菌 (L1-1: Irpex lacteus) 和木贼镰刀菌 (J2-5: Fusarium equiseti) 的ITS序列相似度均超过99.95%。全组合复配结果表明,复合菌系的秸秆降解能力和纤维素酶活力均高于各单一菌株,且随着菌株多样性水平的增加而提高。滤纸酶、纤维素内切酶和木聚糖酶的活力越强,复合菌系对玉米秸秆的降解效果越好,而其秸秆相对降解率主要取决于滤纸酶和纤维素内切酶的活性。抽样效应分析发现,不同菌株对复合菌系的秸秆降解效果、滤纸酶和纤维素内切酶活性的影响不同。不含菌株F7-5的复合菌系降解效果显著优于含有该菌株的组合,以Z7-6 (P. oxalicum)、F4-3 (T. harzianum)、L1-1 (I. lacteus) 和J2-5 (F. equiseti) 组合F1的玉米秸秆降解效果最佳、酶活力最高。  【结论】  秸秆降解复合菌系的构建过程需要同时考虑多样性效应和抽样效应,增加降解菌的多样性有助于增强秸秆的降解效果。本研究筛选获得的复合菌系F1在玉米秸秆降解中具有潜在的应用前景。

    English Abstract

    • 我国农作物秸秆年产量超七亿吨,约占世界总产量的20%~30%,近年来这些秸秆的随意弃置日益严重,严重制约了我国美丽乡村建设与农业的可持续发展[1]。直接还田是秸秆资源化利用的有效方式之一,秸秆还田能培肥土壤、改善土壤结构、提高土壤速效养分、促进作物增产[2]。但由于直接还田的秸秆腐解速率慢,影响后茬作物生长,在一定程度上限制了该技术的推广应用,加速秸秆还田的微生物腐解过程是其资源高效利用的关键技术,已成为学术界理论研究和应用开发的热点[3-4]。秸秆中纤维素含量丰富,其降解过程需要多种降解微生物[5]和多种酶的参与[6]。当前秸秆的生物降解研究以单菌或以复合菌系的效果研究为主,在一定程度上忽略了降解菌种类的多少与降解效果之间的关系[7],即复合菌系的多样性效应。通常认为降解复合菌系具有更丰富的纤维素酶系,菌株间相互协同,并在不同时期交替发挥作用,其降解效果优于单一菌株[8]。研究表明,纤维素降解菌与木质素降解菌对稻草[9]、玉米[10]秸秆的联合降解能力高于单一菌株。顾文杰等[11]从腐烂的水稻秸秆中筛选得到6种降解菌组合的高效降解半纤维素的复合菌系,其半纤维素酶活力约为300 U/mL。邓兵等[12]通过连续富集培养,筛选得到一组高效降解玉米秸秆复合菌系,对玉米秸秆中纤维素、半纤维素和木质素的降解效果较好。因此,组合不同种类的秸秆降解菌,并构建复合菌系加速秸秆降解对秸秆资源化利用具有重要意义。

      尽管复合菌系对秸秆的降解效果优于单一菌株,但是复合菌系的构建也存在一些问题。赵小蓉等[12]研究发现由两种降解菌组合的降解效果不是简单的叠加作用,需要考虑不同菌株对复合菌系降解能力的影响,即抽样效应[13]。有研究表明,在降解过程中不同真菌之间可能存在资源和空间的竞争,导致降解速率的减弱[14]。也有研究表明,降解菌种类的增加对降解过程具有协同促进作用,从而加速植物叶片的降解[15];但Eichorst等[16]发现菌株种类和数量过高,不仅不能促进降解过程,反而抑制纤维素的降解。因此如何构建效果好、稳定性强的复合菌系是提高还田秸秆降解率的关键,也是推动复合菌系策略在秸秆降解中应用的重要手段,但菌株多样性影响复合菌系秸秆降解的效果和机制尚不清楚。为此,本研究从玉米秸秆还田土壤中筛选到5株秸秆降解能力较强的真菌,探究其复合菌系多样性水平和组成对秸秆降解及其纤维素酶活的影响,明确高效降解秸秆的最佳组合,为复合菌系策略在秸秆降解中应用提供思路。

      • 从江苏金坛、张家港、句容、宜兴的玉米秸秆直接还田地块里采集土样,用于玉米秸秆降解菌的筛选。从南京农业大学宜兴基地采集玉米秸秆晾干,剪成2~3 cm的小段,经1.5%的NaOH浸泡预处理48 h后,用去离子水反复洗净至pH中性,65℃烘干,磨成粉状,经0.149 mm的筛子过滤玉米秸秆粉,用于制备以玉米秸秆粉为唯一碳源的富集培养基。称取10 g土壤样品至装有90 mL无菌水的三角瓶中,在170 r/m摇床振荡2 h后静止30 min,吸取10 mL上清液加入到90 mL玉米秸秆粉富集培养基中,至于30℃、170 r/m振荡培养3天后,转接至新鲜的富集培养基中,连续转接5次,初步筛选能利用玉米秸秆粉作为碳源维持生长的真菌,作为具备降解玉米秸秆能力的真菌,详见参考徐春淼等[17]报道的方法。最后基于秸秆降解效果和CMC-刚果红平板水解圈大小,筛选出5株降解真菌。将各菌株置于PDA培养基中30℃恒温培养2~3天,用含有20%甘油的无菌生理盐水收集真菌孢子,保存于–80℃超低温冰箱中备用。

        采用Axygen公司真菌基因组DNA微量抽提试剂盒,参照使用说明提取各菌株总DNA。采用真菌基因间隔区序列 (ITS) 的通用引物ITS1和ITS4[18]分别扩增5株降解真菌的ITS序列,将PCR扩增产物送至上海凌恩生物科技有限公司测序。ITS1, 5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3';ITS4, 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。采用Takara PCR扩增试剂盒50 μL反应体系:DNA模板1 μL,2.5 mmol/L dNTP 4 μL,1 mmol/L引物各1 μL,10 × Loading Buffer 5 μL,25 mmol/L MgCl2 3 μL,5 U/μL Taq酶0.5 μL,ddH2O 34.5 μL。扩增程序:94℃ 5 min,94℃变性 30 s,退火温度52℃ 30 s,72℃ 1 min,共30个循环;72℃ 10 min。将5株降解真菌ITS序列的测序结果在NCBI数据库 (https://ncbi.nlm.nih.gov/) 中BLAST比对分析,以序列相似度为99.95%鉴定菌株分类地位,并在MEGA 7.0软件中采用Neighbor-Joining法构建5株降解菌株的ITS序列系统发育树。

      • 以1.1中分离保存的5株降解真菌 (Z7-6、F7-5、F4-3、L1-1和J2-5) 为对象,将其孢子分别接种至PDA培养基试管中,至于30℃恒温培养箱中培养2~3天,挑取菌丝转接至新鲜的PDA培养基中继续培养,以此方式活化3次。将活化后的真菌孢子接种到装有50 mL秸秆粉固体Madenls培养基的三角瓶中,然后在30℃条件下培养产孢6~7天,在超净台里加入20 mL灭菌生理水溶液,170 rpm的摇床震荡30 min后,用两层无菌纱布过滤除去菌丝和部分培养基,并用血球计数板计每毫升孢子悬液里面的孢子数目。用无菌水分别制备孢子浓度为1.0 × 107 CFU/mL的真菌孢子液,将5株真菌进行全组合复配试验,通过不同菌株等比例组合,构建菌株多样性为1、2、3、4和5的复合菌系,共设置31种组合 (表1)。

        表 1  菌株复配试验处理设置

        Table 1.  Constructionof compound strains for test

        菌株丰富度
        Species richness
        组合
        Combination
        (No.)
        复配方法
        Settings
        1 5每株菌单独接种,重复两次
        Single inoculation of each strain, 2 repeats
        2105株菌任选2株复配后接种,重复一次
        Random2 out of 5 strains for inoculation, 1 repeat
        3105株菌任选3株复配后接种,重复一次
        Random 3 out of 5 strains for inoculation, 1 repeat
        4 55株菌任选4株复配后接种,重复一次
        Random 4 out of 5 strains for inoculation, 1 repeat
        5 15菌株全部复配后接种,重复三次
        Co-inoculation of 5 strains, 3 repeats
        合计 Total31
      • 以1.2中构建的真菌复合菌系为对象,采用失重法检测复合菌系对玉米秸秆的相对降解率[17],按1%比例 (v/v) 接种复合菌系至含有无菌玉米秸秆粉的无机盐培养基中 (KH2PO4 3.0 g、NaNO3 3.0 g、CaC12 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.0075 g、MnSO4·H2O 0.0025 g、ZnSO4 0.002 g、CoC12 0.003 g、无菌秸秆粉20 g、去离子水1 L、pH 7.3 ± 0.1),于30℃、170 r/m振荡培养7天。取发酵残渣用无菌水反复冲洗干净,65℃烘干称重,秸秆相对降解率RDE (%) = (W0−W) / W0 × 100,式中,W0为对照秸秆残渣干重,W为处理秸秆残渣干重。

      • 以1.3中复合菌系第7天的秸秆发酵液为对象,检测发酵液中3种纤维素降解酶的活性,即采用DNS比色法[19]分别检测复合菌系滤纸酶 (FPe)、纤维素内切酶 (CMCase) 和木聚糖酶 (Xylanase) 的活性;在50℃条件下,每分钟水解滤纸、CMC或木聚糖生成1 µmol还原糖所需的酶量,为一个酶活力国际单位 (IU),简称U。详细检测方法参考徐春淼等[17]报道的方法。

      • 本研究中数据处理、统计分析和相关性分析均采用R 4.0版本 (https://www.r-project.org)。通过tidyverse、reshape2和tidyr包进行数据转化处理,采用stats、ggpubr和agricolae等工具包进行统计分析和相关性分析,利用ggplot2进行数据可视化。统计分析主要采用单因素方差分析 (ANOVA)、最小显著性差异法配对比较 (LSD检验) 和t检验,显著性水平为P < 0.05。相关性分析主要采用线性回归 (Y = ax + b) 评价检测指标随菌株多样性或者秸秆相对降解率改变的变化趋势 (a为斜率,b为截距),多元回归 (Y = ax1+bx2+ cx3+ d) 评价不同酶活性对秸秆相对降解率的影响,进而明确发挥关键作用的酶。抽样效应参考Yang等[20]报道的方法,采用multifunc工具包[21]评估不同菌株对复合菌系的秸秆相对降解率和酶活性的影响。

      • 从玉米秸秆直接还田土壤中,通过富集筛选获得了15株具有秸秆降解能力的真菌,其中5株真菌菌株Z7-6、F7-5、F4-3、L1-1和J2-5的降解能力较好。水解圈试验和水稻秸秆降解试验结果表明,5株降解真菌在CMC刚果红培养基上水解圈约为13~41 mm,水解圈与菌落直径比约为1.3~2.1,对玉米秸秆的相对降解率超过35%,具有良好的秸秆降解能力和纤维素水解能力 (图1A)。形态观察发现5株降解真菌在培养基上的菌落形态差异较大,可能属于不同种属。进一步ITS序列鉴定和系统发育分析表明 (图1A):Z7-6为草酸青霉 (Penicillium oxalicum),简称Z7;F7-5为烟曲霉 (Aspergillus fumigatus),简称F7;F4-3为哈茨木霉 (Trichoderma harzianum),简称F4;L1-1为白耙齿菌 (Irpex lacteus),简称L1;J2-5为木贼镰刀菌 (Fusarium equiseti),简称J2。

        图  1  菌株鉴定 (A) 和秸秆降解效果的菌株多样性效应 (B)

        Figure 1.  Strain identification (A) and fungal diversity effect on maize straw degradation (B)

      • 5株真菌全组合复配结果表明 (图1B),玉米秸秆的相对降解率与复合菌系的菌株多样性呈正相关关系 (a = 0.2003,b = –5.4053,R2 = 0.6845,P < 0.0001);随秸秆降解真菌种类的增加,玉米秸秆的相对降解率成上升趋势,种类越多,玉米的秸秆降解效果越好 (ANOVA: F4,33 = 8.13, P = 0.0001)。其中4~5种真菌组成的复合菌系 (丰富度为4和5,P > 0.05) 的降解效果最好,3种真菌组成的复合菌系的降解效果略差 (丰富度为3,P > 0.05),单一菌株 (丰富度为1) 和成对复合 (丰富度为2) 的菌系降解效果较差 (P < 0.05,LSD检验)。上述结果表明,真菌复合菌系的玉米秸秆降解能力具有多样性效应。

      • 通过考察3种与秸秆降解过程相关酶的活力,探究复合菌系秸秆降解能力多样性效应形成的原因。结果表明,不同多样性复合菌系之间的滤纸酶活性存在显著差异 (FPe,F 4,33= 13.23,P < 0.0001),纤维素内切酶 (CMCase,F4,33 = 13.23,P = 0.1980) 和木聚糖酶 (Xylanase,F4,33 = 1.14,P = 0.3530;ANOVA) 活力的差异并不显著 (表2)。其中多样性为5的复合菌系滤纸酶活力最高,多样性为3~4的复合菌系的滤纸酶活力次之 (P < 0.05),成对组合的滤纸酶活力较弱 (P < 0.05),单一菌株的滤纸酶活力最差 (P < 0.05,LSD检验)。图2A显示,滤纸酶、纤维素内切酶和木聚糖酶的活性与复合菌系的菌株丰富度呈不同程度的正相关关系,随菌株丰富度的增加,复合菌系滤纸酶活性的变化最快 (a = 0.1249, b = –6.5318,R2 = 0.7675,P < 0.0001),纤维素内切酶活性的变化次之 (a= 0.0765,b = 0.35751,R2 = 0.3731,P = 0.0211),木聚糖酶活性的变化较慢 (a = 0.0003,b = 1.2874,R2 = 0.3412,P = 0.0360)。

        表 2  复合菌株的秸秆降解效果及其酶活性多样性效应

        Table 2.  Diversity effect on maize straw degradation and enzyme activity of fungal consortia

        项目
        Item
        多样性效应 Diversity effect
        自由度 dfFF-valuePP-value
        相对降解率 Relative degradation efficiency4, 338.1280.0001
        滤纸酶活性 FPe activity4, 3313.23 < 0.0001
        纤维素内切酶活性 CMCase activity4, 331.5970.1980
        木聚糖酶活性 Xylanase activity4, 331.1440.3530

        图  2  三种纤维素酶活与复合菌系的菌株多样性 (A) 和相对降解率 (B) 的关系

        Figure 2.  Relationship between enzyme activity and strain richness (A) and relative degradation (B)

        相关分析结果表明,复合菌系对玉米秸秆的相对降解率与三种酶活性也呈不同程度的正相关关系,即酶活性越强,复合菌系的降解效果越好。玉米秸秆的相对降解率随纤维素内切酶活性的增加增幅最大 (a = 0.4901, b = 25.7306,R2 = 0.6497,P < 0.0001);随滤纸酶活性的增加,增幅次之 (a = 0.3614, b = 13.3388,R2 = 0.6998,P < 0.0001);随木聚糖酶活性的增加,增幅较小 (a = 0.2082, b = 31.6562,R2 = 0.6431,P < 0.0001)。进一步多元回归分析发现,复合菌系的三种酶活性与复合菌系的相对降解率关系密切 (F3,34 = 14.32,R2 = 0.5583,P < 0.0001),其中滤纸酶 (F1,34 = 32.49,P < 0.0001) 和纤维素内切酶 (F1,34 = 10.43,P = 0.0027) 对复合菌系秸秆降解能力有显著贡献,而木聚糖酶贡献较小 (F1,34 = 0.05,P = 0.8333,表2)。上述结果表明,复合菌系的三种纤维素酶的活性具有多样性效应,其中滤纸酶和纤维素内切酶是复合菌系降解玉米秸秆的关键驱动因素。

      • 通过比较各真菌在复合菌系秸秆降解能力和纤维素降解关键酶活力中的抽样效应,表征不同菌株对复合菌系玉米秸秆降解效果的影响。图3A表明,不同菌株对复合菌系秸秆降解效果和酶活力的影响不同,部分菌株影响较大。其中,包含菌株Z7(P < 0.0001)、F4(P = 0.0290) 和L1(P = 0.0400) 的复合菌系,对玉米秸秆的相对降解率显著高于不包含Z7、F4或L1菌株的真菌组合 (t检验);菌株Z7(P = 0.0500)、F4(P < 0.0001) 和L1(P = 0.0039) 可显著提高复合菌系的滤纸酶活力,而只有菌株Z7(P = 0.0005) 和F4(P = 0.0065) 能显著增强复合菌系纤维素内切酶的活性 (t检验)。表3抽样效应分析结果表明,复合菌系的不同菌株对其秸秆降解能力 (F5,32 = 15.42,R2 = 0.7067,P < 0.0001)、滤纸酶活性 (F5,32 = 18.95,R2 = 0.7475,P < 0.0001) 和纤维素内切酶活性 (F5,32 = 6.08,R2 = 0.4870,P = 0.0005) 均有贡献,但贡献程度不同 (表3)。其中菌株Z7(F1,32 = 52.05,P < 0.0001)、F4(F1,32 = 11.30,P = 0.0020)、L1(F1,32 = 8.92,P = 0.0054) 和J2(F1,32 = 4.82,P = 0.0354) 对复合菌系的秸秆相对降解率具有显著地促进作用 (F1,32 = 0.01,P = 0.9237);菌株F7对复合菌系秸秆降解效果的贡献较小,甚至产生负效应 (表3)。

        图  3  复合菌系的抽样效应 (A) 和菌株F7对复合菌系秸秆降解效果的影响 (B)

        Figure 3.  Sampling effect of fungal consortia (A) and effect of strain F7 on maize straw degradation (B)

        表 3  不同菌株对复合菌系秸秆降解效果及其酶活的抽样效应

        Table 3.  Sampling effect of each strain on the degradation and enzyme activity of fungal community

        菌株
        Strain
        自由度
        df
        相对降解率 Relative degradation efficiency滤纸酶活性 FPe activity纤维素内切酶活性 CMCase activity
        FF-value PP-value FF-value PP-value FF-value PP-value
        Z7 1, 32 52.05 < 0.0001↑ 52.05 0.0010↑ 18.01 0.0002↑
        F71, 320.010.9237↓0.010.0074↑0.510.4786↓
        F41, 3211.300.0020↑11.30 < 0.0001↑10.640.0026↑
        L11, 328.920.0054↑8.920.0001↑0.150.7043↑
        J21, 324.820.0354↑4.820.3111↑1.070.3097↓
        汇总 Summary5, 32F = 15.42; R2 = 0.7067;
        P < 0.0001
        F = 18.95; R2 = 0.7475;
        P < 0.0001
        F = 6.08; R2 = 0.4870;
        P < 0.0005

        进一步分析菌株F7对复合菌系秸秆降解能力的影响,比较在有无菌株F7两种情况下,不同菌株丰富度的复合菌系对秸秆的相对降解率,以及滤纸酶和纤维素内切酶这两种关键酶活性的影响。图3B结果显示,菌株F7对3~4种真菌组合的复合菌系 (丰富度3~4) 的秸秆相对降解率 (P < 0.05)、滤纸酶活性 (P < 0.05) 和纤维素内切酶活 (P < 0.05) 具有显著的抑制作用 (t检验)。在有无菌株F7存在的情况下,复合菌系的相对降解率、纤维素内切酶和滤纸酶的活性均与复合菌系的菌株丰富度呈正相关关系,但相关程度存在差异,其中包含菌株F7的复合菌系随菌株丰富度的增加的变化幅度相对较小。菌株F7的加入使得复合菌系的秸秆相对降解率、滤纸酶活性和纤维素内切酶活性随菌株丰富度增加的,增加幅度减小 (斜率降低)。其中,纤维素内切酶活性斜率降低的幅度最大,为78.29%;其次是相对降解率,斜率降低了22.10%;滤纸酶活性斜率降低的幅度最小,为7.39%。最后,不含菌株F7的4种真菌组合 (Z7、F4、L1和J2) 的秸秆降解效果和酶活最高,因此认定该复合菌系为本研究中降解玉米秸秆的最佳组合,命名为F1。

      • 通过5株真菌的全组合,构建菌株丰富度 (多样性) 从低到高的31种复合菌系,探究了菌株多样性水平和组成对复合菌系玉米秸秆的降解效果以及三种纤维素降解酶活性的影响。本研究发现复合菌系对秸秆的降解效果显著优于单一菌株,这与宋云皓[22]、李静[10]等的研究部分结果相似。例如,宋云皓等[22]将筛选得到的玉米秸秆纤维素降解菌构建出菌株多样性为3~4的5个复合菌系,发现复合菌系的酶活力值比单一菌株提高1.1倍以上。李静等[10]将筛选获得的15株秸秆降解菌构建出菌株多样性为3~5的5个复合菌系,发现复合菌系的秸秆降解率超出单一菌株的42%~51%;但秸秆降解效果最好的是3种降解菌的组合,菌株多样性为5的复合菌系次之,效果最差的4种降解菌的组合。而本研究发现,增加复合菌系中菌株的种类总体上能够提高复合菌系的纤维素降解酶活力,有效促进玉米秸秆的降解。类似研究发现,6种烟草秸秆降解菌的复合菌系对半纤维素、纤维素和木质素的降解能力显著高于3种降解菌的组合[23]。这说明物种丰富度与菌群功能密切相关[13],而菌群功能主要由相关酶的活性决定[24]。本研究发现复合菌系的滤纸酶、纤维素内切酶和木聚糖酶活性不仅存在显著的多样性效应,随菌株丰富度的增加而提高,而且都能促进玉米秸秆的降解效果,前两种酶的贡献更大。复合菌系酶活性随菌株多样性和秸秆降解效果的变化规律,进一步解释了秸秆降解效果与复合菌系中菌株多样性之间的线性增长关系。

        有研究发现降解菌的丰富度并非越多越好,菌株之间可能存在一定的拮抗竞争或资源竞争,从而减弱了复合菌系的秸秆降解效果[14]。本研究发现不同降解菌对秸秆降解效果及其酶活的贡献不同,存在显著的抽样效应。抽样效应是微生物多样性与功能变异的重要原因之一[13,20,23],但在秸秆降解复合菌系的相关研究中并不多见。在本研究中,菌株Z7、F4、L1和J2分别在复合菌系中对秸秆降解具有正效应,而菌株F7在一定程度上抑制了复合菌系的降解效果。不仅如此,菌株F7和J2还能抑制复合菌系纤维素内切酶的活性,但5株降解菌对复合菌系滤纸酶的活性都有不同程度的促进作用。这说明在复合菌系构建过程中,需考虑不同菌株对纤维素降解酶活力的影响[25],尽量避免由抽样效应引发的降解菌组合功能的减弱。综合考虑复合菌系的多样性效应和抽样效应,本研究最终筛选获得秸秆降解效果和酶活最高的真菌组合,即草酸青霉Z7、哈茨木霉菌F4、白囊耙齿菌L1和木贼镰刀菌J2组合的复合菌系。该复合菌系可能在玉米秸秆降解中有潜在应用前景,需要在今后的研究中进一步开展实际生产应用研究,如复合菌系菌株比例和菌剂配方优化等。

      • 本研究筛选获得了一个在秸秆降解中具有潜在应用前景的复合菌系F7。在秸秆降解复合菌系构建中,应当考虑菌株的多样性效应和抽样效应,以及在生产实际过程中不同菌株的剂量效应,以优化菌株配比,提高复合菌系的秸秆降解效率。

        致谢:本课题研究得到南京农业大学生物信息学中心高性能计算平台的支持。

    参考文献 (25)
    WeChat 关注分享

    返回顶部

    目录

      /

      返回文章
      返回