• ISSN 1008-505X
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长期施肥对稻田土壤微生物群落结构及氮循环功能微生物数量的影响

邹湘 易博 张奇春 邸洪杰

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长期施肥对稻田土壤微生物群落结构及氮循环功能微生物数量的影响

    作者简介: 邹湘 E-mail:xiangzou@zju.edu.cn;
    通讯作者: 张奇春, E-mail:qczhang@zju.edu.cn
  • 基金项目: 国家自然科学基金项目(41877044)。

Effects of long-term fertilization on the microbial community structure and the population of N cycle-related functional microorganism in paddy soil

    Corresponding author: ZHANG Qi-chun, E-mail:qczhang@zju.edu.cn ;
  • 摘要:   【目的】   稻田是陆生生态系统中重要的氮库之一,在氮素生物地球化学循环中具有重要地位。研究不同施肥处理对稻田土壤微生物群落结构及其功能的影响具有重要意义。   【方法】   田间试验位于江苏省金坛市,在取样时试验已进行了6年。施肥处理包括:不施肥对照 (CK)、施化肥 (CF)、化肥+猪粪混施 (CMF)、化肥+秸秆混施 (CSF)。采用高通量测序和定量PCR方法测定稻田土壤微生物群落结构及氮循环相关功能微生物数量。   【结果】   在施用肥料6年后,土壤全碳、可溶性有机碳、全氮、铵态氮和硝态氮含量均不同程度地提高。与CF相比,CSF和CMF处理土壤pH升高,全碳、可溶性有机碳与养分含量升高。CK与施肥处理的土壤细菌群落结构差异明显,不同施肥处理的细菌群落结构之间有明显差别。聚类结果显示,CK与CMF处理细菌群落聚类更接近,CF处理和CSF处理细菌群落结构更为接近;与CK相比,CF、CMF、CSF处理土壤中氨氧化细菌 (AOB) 和铁氨氧化微生物Feammox A6的丰度显著提高,其中Feammox A6分别增长87.6%、158%和157%。冗余分析结果表明,施肥过程及其对土壤化学性质的改变显著影响土壤细菌群落的组成和分布。   【结论】   施肥导致的反应底物 (NH4+、NO3含量) 及土壤理化性质的差异,是土壤微生物群落结构和功能微生物数量响应的主要决定因素。不施肥与化肥配施猪粪的土壤细菌群落聚类更接近,施化肥与化肥配施秸秆的细菌群落结构更为接近。施肥对氨氧化细菌AOA数量影响不明显,但显著提高氨氧化古菌AOB和厌氧铁氨氧化功能微生物Feammox A6的数量,特别是有机肥 (猪粪、秸秆) 提高Feammox A6数量的效果大于化肥。长期单施化肥土壤中厌氧氨氧化细菌丰度显著降低,反硝化功能基因nirKnosZ丰度显著增高;化肥配施猪粪土壤中的厌氧氨氧化细菌丰度变化不明显,反硝化功能基因narGnirKnosZ丰度显著增高;化肥配施秸秆处理厌氧氨氧化细菌丰度变化不明显,反硝化功能基因nirKnosZ丰度显著增高。
  • 图 1  基于Bray-Curtis距离的样品相对丰度聚类树分析 (a),基于加权Unifrac metric距离的主坐标 (PcoA) 分析(b)和基于不加权UniFrac metric距离的PCoA分析 (c)

    Figure 1.  The cluster dendrogram of Bray-Curtis dissimilarity of samples based on relative abundance (a), principal coordinate analysis (PcoA) plots of the OTU-based weighted (b) and unweighted UniFrac metric in all treatments (c)

    图 2  细菌各分类水平下的线性判别分析 (LefSe)

    Figure 2.  LefSe cladogram indicating the phylogenetic distribution of bacterial lineages

    图 3  不同处理土壤中氨氧化菌 (AOA、AOB) 和厌氧铁氨氧化细菌 (Anammox和Feammox A6) 的数量

    Figure 3.  Abundance of ammonia oxidizing archaea (AOA), ammonia oxidizing bacteria (AOB), anammox bacteria and Feammox A6 in soils under different fertilization treatments

    图 4  土壤反硝化微生物功能基因丰度

    Figure 4.  Abundance of denitrification functional genes in soils

    图 5  不同处理基于微生物群落和土壤理化性质的冗余分析

    Figure 5.  Redundancy analysis based on bncterial community and soil physical and chemical properties ofdifferent treatments

    图 6  基于不同施肥处理和土壤理化性质的典型相关分析 (VPA) 及相关土壤因子的Mantel检验

    Figure 6.  Variation partitioning analysis on the effects of fertilizer treatments and soil properties and Mantel test of related soil factors

    表 1  氮循环功能基因定量PCR引物及扩增条件

    Table 1.  Real time PCR primers and conditions used for the amplification in this study

    功能基因/微生物
    Functional genes/
    microoganism
    引物
    Primers
    引物序列 (5'–3')
    Primer sequence (5'–3')
    扩增条件
    Amplification conditions
    参考文献
    Reference
    Bacteria amoAamoA1FSTAATGGTCTGGCTTAGACG95℃ 2 min; 1 cycle[15]
    amoA2RGCGGCCATCCATCTGTATGT94℃ 20 s,55℃ 20 s,72℃ 30 s ; 40 cycles
    Archaeal amoAArch-amoAFGGGGTTTCTACTGGTGGT94℃ 2 min; 1 cycle[16]
    Arch-amoARCCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC94℃ 94℃ 20 s,57℃ 30 s,72℃ 30 s ; 40 cycles
    AnammoxAmx368fTTCGCAATGCCCGAAAGG94℃30 s ;1 cycle[17]
    Amx820rAAAACCCCTCTACTTAGTGCCC94℃5 s,56℃ 30 s,70℃ 30 s; 40 cycles
    Acidimicrobiaceae
    bacteria A6
    acm342fGCAATGGGGGAAACCCTGAC94℃ 30 s ; 1 cycle[18]
    acm439rACCGTCAATTTCGTCCCTGC94℃ 5 s,58℃ 30 s,70℃ 30 s ; 40 cycles
    narGnarGG-FTCGCCSATYCCGGCSATGTC94℃ 2 min ; 1 cycle[19]
    narGG-RGAGTTGTACCAGTCRGCSGAYTCSG94℃ 5 s,58℃ 30 s,72℃ 30 s; 40 cycles
    nirScd3aFGTSAACGTSAAGGARACSGG94℃ 2 min ; 1 cycle[20]
    R3cdGASTTCGGRTGSGTCTTGA94℃ 45 s,55℃ 45 s,72℃ 45 s ; 40 cycles
    nirKFlaCuATCATGGTSCTGCCGCG94℃ 2 min ; 1 cycle[21]
    R3CuGCCTCGATCAGRTTGTGGTT94℃ 20 s,63℃ 30 s,72℃ 30 s ; 40 cycles
    nosZnosZ-FCGYTGTTCMTCGACAGCCAG94℃ 2 min; 1 cycle[22]
    nosZ1622RCGSACCTTSTTGCCSTYGCG94℃ 20 s,58℃ 30 s,72℃ 30 s ; 40 cycles
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    表 2  长期不同施肥土壤化学性质变化

    Table 2.  Physicochemical properties of soils after long-term fertilizer treatments

    处理
    Treatment
    pH全碳 (g/kg)
    Total C
    可溶性有机碳 (mg/kg)
    DOC
    全氮 (g/kg)
    Total N
    铵态氮 (mg/kg)
    NH4+-N
    硝态氮 (mg/kg)
    NO3-N
    CK6.76 ± 0.08 a18.02 ± 1.33 c122.00 ± 4.61 b1.37 ± 0.16 b19.64 ± 1.80 b5.17 ± 0.65 b
    CF6.25 ± 0.17 c22.38 ± 0.76 bc126.50 ± 2.86 b1.64 ± 0.16 a23.47 ± 2.49 a10.31 ± 1.23 a
    CMF6.52 ± 0.09 b27.83 ± 1.24 a145.00 ± 6.90 a1.88 ± 0.26 a25.08 ± 1.42 a11.91 ± 0.29 a
    CSF6.34 ± 0.39 c24.95 ± 1.51 ab156.75 ± 7.28 a1.90 ± 0.39 a27.48 ± 3.84 a12.80 ± 1.82 a
    注(Note):DOC—Dissolved organic carbon; CK—不施肥对照 No-fertilizer control; CF—化肥 Chemical fertilizer; CMF—化肥+猪粪混施 Chemical fertilizers plus pig manure; CSF—化肥+秸秆混施 Chemical fertilizers plus crop straw; 数值为平均值 ± 标准误差,同列数值后不同小写字母表示施肥处理间差异显著 (P < 0.05) The value is the mean value ± standard error,and values followed by different lowercase letters in the same column indicate significant difference among treatments (P < 0.05).
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    [20] 王淑平周广胜孙长占姜亦梅姜岩刘孝义 . 土壤微生物量氮的动态及其生物有效性研究. 植物营养与肥料学报, 2003, 9(1): 87-90. doi: 10.11674/zwyf.2003.0116
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-08-20
  • 网络出版日期:  2021-01-21
  • 刊出日期:  2020-12-25

长期施肥对稻田土壤微生物群落结构及氮循环功能微生物数量的影响

    作者简介:邹湘 E-mail:xiangzou@zju.edu.cn
    通讯作者: 张奇春, qczhang@zju.edu.cn
  • 浙江省农业资源与环境重点实验室/污染环境修复与生态健康教育部重点实验室/浙江大学,杭州 310058
  • 基金项目: 国家自然科学基金项目(41877044)。
  • 摘要:    【目的】   稻田是陆生生态系统中重要的氮库之一,在氮素生物地球化学循环中具有重要地位。研究不同施肥处理对稻田土壤微生物群落结构及其功能的影响具有重要意义。   【方法】   田间试验位于江苏省金坛市,在取样时试验已进行了6年。施肥处理包括:不施肥对照 (CK)、施化肥 (CF)、化肥+猪粪混施 (CMF)、化肥+秸秆混施 (CSF)。采用高通量测序和定量PCR方法测定稻田土壤微生物群落结构及氮循环相关功能微生物数量。   【结果】   在施用肥料6年后,土壤全碳、可溶性有机碳、全氮、铵态氮和硝态氮含量均不同程度地提高。与CF相比,CSF和CMF处理土壤pH升高,全碳、可溶性有机碳与养分含量升高。CK与施肥处理的土壤细菌群落结构差异明显,不同施肥处理的细菌群落结构之间有明显差别。聚类结果显示,CK与CMF处理细菌群落聚类更接近,CF处理和CSF处理细菌群落结构更为接近;与CK相比,CF、CMF、CSF处理土壤中氨氧化细菌 (AOB) 和铁氨氧化微生物Feammox A6的丰度显著提高,其中Feammox A6分别增长87.6%、158%和157%。冗余分析结果表明,施肥过程及其对土壤化学性质的改变显著影响土壤细菌群落的组成和分布。   【结论】   施肥导致的反应底物 (NH4+、NO3含量) 及土壤理化性质的差异,是土壤微生物群落结构和功能微生物数量响应的主要决定因素。不施肥与化肥配施猪粪的土壤细菌群落聚类更接近,施化肥与化肥配施秸秆的细菌群落结构更为接近。施肥对氨氧化细菌AOA数量影响不明显,但显著提高氨氧化古菌AOB和厌氧铁氨氧化功能微生物Feammox A6的数量,特别是有机肥 (猪粪、秸秆) 提高Feammox A6数量的效果大于化肥。长期单施化肥土壤中厌氧氨氧化细菌丰度显著降低,反硝化功能基因nirKnosZ丰度显著增高;化肥配施猪粪土壤中的厌氧氨氧化细菌丰度变化不明显,反硝化功能基因narGnirKnosZ丰度显著增高;化肥配施秸秆处理厌氧氨氧化细菌丰度变化不明显,反硝化功能基因nirKnosZ丰度显著增高。

    English Abstract

    • 水稻是重要的粮食作物[1],其种植面积占我国粮食作物总种植面积的27%,产量接近全国粮食总产量的50%。我国水稻种植已持续数千年,约60%以上的人口以稻米为主食,稻作农业被认为是国家粮食安全保障的主要支撑[2]。稻田是重要的农业生态系统和人工湿地系统,长期人为耕作和外源有机、无机肥料的投入使稻田中养分含量维持在较高水平,加之稻田周期性水旱交替,使其在碳氮生物地球化学循环中发挥重要作用[3]。稻田是重要的氧化亚氮 (N2O) 排放源,占农田生态系统总排放量的11.4%,明确稻田生态系统中氮循环过程对调控和缓解全球变暖有重要意义。因此,稻田中氮素周转不但关系到粮食安全和农业体系发展的可持续性[4],而且关乎农业生产过程对全球气候变化和温室气体减排影响等问题。

      在土壤生态系统中,微生物是物质循环和能量流动的重要参与者、维持者和贡献者,承担了碳氮循环等多种重要的生态服务功能[5]。用分子生物学方法对土壤中控制关键过程相关微生物的丰度、群落组成进行表征,是评价土壤质量和生态系统功能的重要方法[6]。稻田土壤中氮转化途径包括:硝化-反硝化、厌氧氨氧化、铁氨氧化等过程。其中,硝化过程由氨氧化古菌 (ammonia-oxidizing archaea,AOA) 和氨氧化细菌 (ammonia-oxidizing bacteria,AOB) 调控[7]。反硝化功能微生物较多,现已发现超过60个属,其功能基因narGnirS/nirKnorBnosZ可编码相关蛋白调控反硝化过程[8]。厌氧氨氧化过程由联氨合成酶和联氨转化酶调控,分别由功能基因hzs-βhzo编码[9]。迄今为止,只有酸微菌科A6菌 (Feammox A6) 被发现具有进行铁氨氧化反应的能力[10]

      施肥会改变土壤物理、化学和生物学特征,往往也会促进土壤氮素的积累,并驱动土壤微生物群落的演变。因此,明晰不同施肥条件下氮循环过程的驱动者在微观层面的分布情况,有助于了解稻田微生物变化特征及其对氮素生物地球化学过程的影响。研究表明,微生物生物量易受不同施肥模式影响,与单施化肥相比,化肥-有机肥混施可以缓解土壤酸化,提高土壤养分含量,提高微生物生物量碳氮[11-12],降低反硝化功能基因nirS的丰度[13]。此研究以长期 (6年) 施肥的水稻土为载体,对土壤微生物群落结构及其氮循环功能微生物的丰度进行表征,以期从分子生物学水平了解稻田土壤微生物对不同类型肥料施用的响应。

      • 试验区位于江苏省金坛市指前镇建春村 (N 31°39′49.42″,E 119°28′4.12″),当地为亚热带季风气候区,年平均降雨量为1054 mm,年平均气温15.4℃,年均湿度78%。试验区土壤类型为黏壤质铁积潜育水耕人为土,当地典型的农业耕作模式为水旱轮作的稻麦轮作体系。

      • 长期定位试验区建立于2010年,按照随机区组设计,4种不同施肥处理随机分布,每个处理4个重复,共16个小区,每个小区面积40 m2 (长8 m × 宽5 m)。不同小区之间用水泥板隔开,避免串水串肥。施肥处理如下:1) 整个试验期间不施加任何外源肥料 (CK);2) 施化肥 (CF),每年施入肥料量为N 240 kg/hm2、P2O5 40 kg/hm2、K2O 85 kg/hm2,年总养分投入量为490 kg/hm2;3) 化肥+猪粪 (CMF),每年施入化肥N 120 kg/hm2、P2O5 20 kg/hm2、K2O 42.5 kg/hm2,猪粪堆肥6000 kg/hm2,年总养分投入量为404.36 kg/hm2;4) 化肥+秸秆 (CSF),每年施入肥料用量为N 240 kg/hm2、P2O5 40 kg/hm2、K2O 85 kg/hm2,秸秆全量还田。其中CSF与CF化肥施用量相等,CMF化肥用量为CF的50%。氮磷钾肥分别以尿素 (N 46%)、过磷酸钙 (P2O5 16%) 和硫酸钾 (K2O 60%) 的形式施入,猪粪堆肥养分含量为有机质554 g/kg、N 2.3 g/kg、P 14.3 g/kg、K 9.96 g/kg,含水量29.1%。秸秆养分含量为有机质626 g/kg,N 5.32 g/kg、P 1.13 g/kg、K 10.7 g/kg,含水量30.7%。磷钾肥和猪粪堆肥均作为基肥一次施用,氮肥按基肥∶分蘖肥∶穗肥1∶穗肥2为4∶2∶2∶2的质量比施入。水稻种植模式按当地农民耕作习惯制定,种植水稻品种为武运粳23。

      • 土壤样品采集时间为2016年9月26日,试验区水稻处于成熟期,采样前提前一周进行田间排水处理,土壤样品采用五点取样法,将样品置于冰盒内带回实验室。在实验室条件下,样品混合后分装为两份,一份风干,过2 mm筛后用于测定土壤化学性质,另一份存储于–80℃用于后续分子生物学的分析。土壤化学性质测定方法参照《土壤农化分析》第三版[14]:pH用pH计 (SevenCompactS210) 测定;土壤全碳 (包含有机和无机碳)、全氮用元素分析仪 (vario EL cube,Elementar,Germany) 测定;可溶性有机碳用TOC分析仪测定 (MULTI N/C3100);土壤硝态氮、铵态氮用连续流动分析仪 (SAN++.Skalar.Holland) 测定。

      • 采用Fast DNA SPIN Kit (MP Biomedical,France) 试剂盒提取土壤DNA,过程按照说明手册操作。提取完成后,用Nanodrop®ND-2000UV-vis (Nano Drop Technologies,Wilmington,DE,USA) 检查质量和纯度,合格的DNA分装保存于–20℃以备分子生物学分析。

        PCR扩增的体系为20 μL,其中包含:2 μL dNTP 混合物 (2.5 m mon/L),0.4 μL Fast Pfu Polymerase,4 μL的5 × Fast Pfu Buffer,1 μL DNA样本 (10 ng),0.2 μL BSA和12.4 μL的灭菌水。PCR扩增条件为:变性94℃ 30 s,退火55℃ 30 s,延伸72℃ 45 s,扩增循环数为27个,以不加DNA的样品作为阴性对照,用2%的琼脂糖凝胶电泳检验扩增产物。扩增后的产物送美吉生物公司用Illumina Miseq平台测序。序列信息用QIIME过滤、优化和质控。测序基因序列上传至NCBI数据库,进行序列片段归档 (SequenceRead Archive),检索号为SRP140763。

      • 首先制备各功能基因标线:对普通PCR扩增的功能基因产物进行纯化后连接到T载体,用pEasy-T1 Simple Cloning Kit (Transgen Biotech,Beijing,China) 克隆试剂盒将连接产物转入大肠杆菌感受态细胞,37℃培养孵化后,接种到含有氨苄青霉素的LB培养基上对阳性克隆体进行筛选,筛选后送样测序。在测序结果中找到目标片段后,在NCBI数据库中进行BLAST比对确认,选取正确的质粒测定浓度后,以102~109共8级进行梯度稀释,制成标准曲线。

        定量PCR:使用实时荧光定量PCR扩增仪系统 (LightCycler 480;Roche,Germany) 进行定量扩增和数据分析,采用20 μL扩增体系,具体如下:10 μL 2 × SYBR Premix Ex Taq酶 (Takara,Dalian,China),1 μL前后引物 (浓度为10 μmol/L),1 μL DNA样本 (1~10 ng) 和7 μL灭菌水。定量PCR扩增中的引物和条件如表1所示。

        表 1  氮循环功能基因定量PCR引物及扩增条件

        Table 1.  Real time PCR primers and conditions used for the amplification in this study

        功能基因/微生物
        Functional genes/
        microoganism
        引物
        Primers
        引物序列 (5'–3')
        Primer sequence (5'–3')
        扩增条件
        Amplification conditions
        参考文献
        Reference
        Bacteria amoAamoA1FSTAATGGTCTGGCTTAGACG95℃ 2 min; 1 cycle[15]
        amoA2RGCGGCCATCCATCTGTATGT94℃ 20 s,55℃ 20 s,72℃ 30 s ; 40 cycles
        Archaeal amoAArch-amoAFGGGGTTTCTACTGGTGGT94℃ 2 min; 1 cycle[16]
        Arch-amoARCCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC94℃ 94℃ 20 s,57℃ 30 s,72℃ 30 s ; 40 cycles
        AnammoxAmx368fTTCGCAATGCCCGAAAGG94℃30 s ;1 cycle[17]
        Amx820rAAAACCCCTCTACTTAGTGCCC94℃5 s,56℃ 30 s,70℃ 30 s; 40 cycles
        Acidimicrobiaceae
        bacteria A6
        acm342fGCAATGGGGGAAACCCTGAC94℃ 30 s ; 1 cycle[18]
        acm439rACCGTCAATTTCGTCCCTGC94℃ 5 s,58℃ 30 s,70℃ 30 s ; 40 cycles
        narGnarGG-FTCGCCSATYCCGGCSATGTC94℃ 2 min ; 1 cycle[19]
        narGG-RGAGTTGTACCAGTCRGCSGAYTCSG94℃ 5 s,58℃ 30 s,72℃ 30 s; 40 cycles
        nirScd3aFGTSAACGTSAAGGARACSGG94℃ 2 min ; 1 cycle[20]
        R3cdGASTTCGGRTGSGTCTTGA94℃ 45 s,55℃ 45 s,72℃ 45 s ; 40 cycles
        nirKFlaCuATCATGGTSCTGCCGCG94℃ 2 min ; 1 cycle[21]
        R3CuGCCTCGATCAGRTTGTGGTT94℃ 20 s,63℃ 30 s,72℃ 30 s ; 40 cycles
        nosZnosZ-FCGYTGTTCMTCGACAGCCAG94℃ 2 min; 1 cycle[22]
        nosZ1622RCGSACCTTSTTGCCSTYGCG94℃ 20 s,58℃ 30 s,72℃ 30 s ; 40 cycles
      • 主成分分析 (principal components analysis,PcoA)、Mantel检验分析、冗余分析 (redundancy analysis,RDA) 和差异分区分析 (variance partitioning canonical correspondence analysis,VPA) 用R语言中的vegan数据包分析[23]。线性判别分析[linear discriminant analysis(LDA) effect size (LefSe)]用http://huttenhower.sph.harvard.edu/lefse/平台运算[24],将LDA值 > 3.5作为丰度显著差异的判定值。试验数据所有表格均采用Microsoft Excel 2013处理制作;采用SPSS19.0进行单因素方差分析 (ANOVA) 和Pearson相关性分析,当P < 0.05时则处理间差异性显著;用Origin 8.5进行作图分析。

      • 表2所示,与CK处理相比,长期施肥处理土壤养分含量均有不同程度的提高,且碳、氮含量呈现出明显的“梯度变化”规律。CK处理土壤pH为6.76,与之相比,所有施肥处理pH显著降低。CF处理土壤pH下降最显著 (降至6.25);而CMF处理降至6.52,与CF处理差异显著,能缓解施用化肥导致的酸化效应。与CK相比,CF处理土壤全碳含量趋于升高,两种混施有机肥的处理土壤全碳和可溶性有机碳含量均显著升高;3种施肥处理土壤全氮、铵态氮和硝态氮含量均显著升高。结果表明:有机–无机肥混施模式对地力的提升效果更为显著,且在一定程度上可以缓解因化肥施用而带来的土壤酸化等问题[25]

        表 2  长期不同施肥土壤化学性质变化

        Table 2.  Physicochemical properties of soils after long-term fertilizer treatments

        处理
        Treatment
        pH全碳 (g/kg)
        Total C
        可溶性有机碳 (mg/kg)
        DOC
        全氮 (g/kg)
        Total N
        铵态氮 (mg/kg)
        NH4+-N
        硝态氮 (mg/kg)
        NO3-N
        CK6.76 ± 0.08 a18.02 ± 1.33 c122.00 ± 4.61 b1.37 ± 0.16 b19.64 ± 1.80 b5.17 ± 0.65 b
        CF6.25 ± 0.17 c22.38 ± 0.76 bc126.50 ± 2.86 b1.64 ± 0.16 a23.47 ± 2.49 a10.31 ± 1.23 a
        CMF6.52 ± 0.09 b27.83 ± 1.24 a145.00 ± 6.90 a1.88 ± 0.26 a25.08 ± 1.42 a11.91 ± 0.29 a
        CSF6.34 ± 0.39 c24.95 ± 1.51 ab156.75 ± 7.28 a1.90 ± 0.39 a27.48 ± 3.84 a12.80 ± 1.82 a
        注(Note):DOC—Dissolved organic carbon; CK—不施肥对照 No-fertilizer control; CF—化肥 Chemical fertilizer; CMF—化肥+猪粪混施 Chemical fertilizers plus pig manure; CSF—化肥+秸秆混施 Chemical fertilizers plus crop straw; 数值为平均值 ± 标准误差,同列数值后不同小写字母表示施肥处理间差异显著 (P < 0.05) The value is the mean value ± standard error,and values followed by different lowercase letters in the same column indicate significant difference among treatments (P < 0.05).
      • 不同施肥处理6年后,土壤微生物群落发生改变,不同的施肥处理能够在一定程度上重构土壤微生物群落,使之形成自身独特的组成和结构。聚类结果 (图1a) 表明,不施肥处理与施肥处理细菌群落结构差异明显,其中CK与CMF处理细菌群落聚类更接近,CF处理和CSF处理细菌群落结构更为接近。基于加权的PcoA分析同样验证了该结论,图1b表明CK处理和CMF处理细菌群落的分布位置相近,而CF处理和CSF处理在Pco1和Pco2坐标轴上均不能分开,表明其细菌群落结构相似;基于加权的PcoA分析Pco1和Pco2坐标能够解释土壤细菌群落分布中78.5%的变量。肥料施入能够提升土壤氮磷等营养元素含量,提高土壤微生物生物量,从而影响土壤微生物群落结构[26],肥料用量在本试验中可能是决定微生物群落演替方向的主导因素。CK处理与CMF处理施入化学肥料的氮磷钾含量一致,且CMF处理中秸秆分解过程缓慢,微生物可利用性较低,因此二者微生物群落组成较为接近。肥料用量的主导作用也能解释CSF处理因化学肥料施用量为CK和CSF处理的50%,其微生物群落组成与CK和CSF处理差异较大。基于不加权的PcoA分析能更明显表示出细菌群落结构的差异,Pco1和Pco2坐标解释了43.2%的变量。CK与其他施肥处理在Pco1坐标上分开 (图1c),表明施肥处理与不施肥处理细菌群落结构差异明显,CF、CMF、CSF处理能够在坐标Pco1或Pco2上完全分开,表明不同施肥处理下细菌群落结构差异明显。

        图  1  基于Bray-Curtis距离的样品相对丰度聚类树分析 (a),基于加权Unifrac metric距离的主坐标 (PcoA) 分析(b)和基于不加权UniFrac metric距离的PCoA分析 (c)

        Figure 1.  The cluster dendrogram of Bray-Curtis dissimilarity of samples based on relative abundance (a), principal coordinate analysis (PcoA) plots of the OTU-based weighted (b) and unweighted UniFrac metric in all treatments (c)

        线性判别分析 (LefSe) 结果如图2所示,将LDA值 > 3.5定义为微生物在数量上差异显著,这部分微生物叫做响应微生物 (responder),代表这部分微生物数量对施肥处理响应显著。CSF处理中有7个分化枝的数量显著增加,其次为CF处理有6个,CK处理和CMF处理均有5个。在门水平上,只有CSF处理中的厚壁菌门 (firmicutes) 和芽单胞菌门 (gemmatimonadetes) 的数量显著高于其他处理。值得注意的是,在科水平下,CMF和CSF处理中厌氧氨氧化协同铁还原过程功能微生物所在的酸微菌科 (acidobacteria) 数量显著增加,说明有机肥的输入可能有利于氮循环过程的铁氨氧化反应的发生。而在属水平上,CSF处理中发现厌氧粘细菌 (anaeromyxobacter) 数量显著增加,表明猪粪有机肥的输入能够促进厌氧粘细菌的生长。厌氧粘细菌属、地杆菌属和假单胞菌属是铁还原反应过程中发挥作用功能菌[27],作为3种代表性铁还原菌之一,厌氧粘细菌数量的显著增加,能在一定程度上表明土壤中发生活跃的铁还原过程。根据有机肥施用能使铁氨氧化和铁还原过程功能菌群富集,我们推测施肥处理,尤其是有机-无机肥混施能够提供有利于氮循环中铁氨氧化反应发生的土壤生境。

        图  2  细菌各分类水平下的线性判别分析 (LefSe)

        Figure 2.  LefSe cladogram indicating the phylogenetic distribution of bacterial lineages

      • 前面的研究结果表明,不同施肥处理影响了氮循环,因此进一步对氮循环相关功能微生物进行了定量分析 (图3)。从图3可以看出,4种不同施肥处理均表现出AOB丰度高于AOA。施肥处理间,CF处理中AOA的含量 (基因拷贝数为9.82 × 107/g, 干土) 最低,比CK处理低14.4%;有机–无机肥混施处理 (CMF、CSF) 土壤中AOA丰度没有显著降低,甚至CMF处理较CK略显增加。AOB丰度对施肥的响应显著,与CK相比,CF、CMF、CSF处理AOB丰度显著提高35.7%、38.3%、50.2% (P < 0.05),但3个施肥处理间没有显著差异。AOA与AOB丰度响应的差异可能与AOA、AOB对底物亲和力强度差异有关。大量研究表明,AOB对高NH3环境更具亲和力,但高浓度NH3对AOA丰度表现出一定的抑制效应,相反,低氮环境可以刺激AOA在土壤中的表达[28-29]。本试验中,3种施肥处理土壤氮含量均显著升高,与AOA相比,含氮相对较高的环境更有利于AOB的生长。

        图  3  不同处理土壤中氨氧化菌 (AOA、AOB) 和厌氧铁氨氧化细菌 (Anammox和Feammox A6) 的数量

        Figure 3.  Abundance of ammonia oxidizing archaea (AOA), ammonia oxidizing bacteria (AOB), anammox bacteria and Feammox A6 in soils under different fertilization treatments

        厌氧条件下,主导氨氧化过程的厌氧氨氧化细菌 (anammox bacteria) 和铁氨氧化菌 (Feammox A6) 在不同施肥处理中的数量如图3所示。与CK相比,CF处理中厌氧氨氧化细菌数量 (基因拷贝数为4.48 × 107/g, 干土) 略低,CK、CMF处理略高,但差异均不显著。相比之下,施肥处理Feammox A6的数量显著增加。CK处理Feammox A6的数量最低,为2.47 × 107/g, 干土,与之相比,CF处理增长了87.6%,达到4.64 × 107/g, 干土,而CMF和CSF处理分别增长了158%和157%,基因拷贝数分别达到6.39 × 107和6.35 × 107/g, 干土,且与CF处理差异显著。与不施肥处理相比,施肥可为铁氨氧化过程提供反应底物 (NH4+),显著增加Feammox A6在土壤中的数量。此外,研究表明有机碳和无机碳含量增加显著提高Feammox过程中的微生物数量。与CF处理相比,有机肥处理 (CMF、CSF) 显著增加土壤中全碳、可溶性有机碳含量,从而创造出更适宜Feammox A6生长的生境[1030]

        土壤反硝化过程功能基因数量如图4所示,反硝化过程功能基因随施肥处理变化不一,但从整体看,均表现出施肥处理高于CK处理。narG基因在CK处理中数量为2.36 × 107/g, 干土,在CF、CMF和CSF处理中数量分别为2.79 × 107、3.63 × 107和3.35 × 107/g, 干土,提高了18.2%~53.8%。nirS功能基因的数量变化为CSF (2.17 × 107/g, 干土) > CMF(1.96 × 107/g, 干土) > CF(1.92 × 107/g, 干土) > CK(1.76 × 107/, 干土),4种施肥处理间差异不显著。与CK处理相比,施肥处理中nirKnosZ基因数量均显著提高。nirK基因CK处理数量最低,为1.79 × 107/g, 干土,CF、CMF和CSF处理数量分别提高了24.6%、18.8%和37.0%。nosZ基因在CK处理土壤中含量最低,为1.97 × 107/g, 干土,CMF处理中最高,达3.19 × 107/g, 干土。表明长期施肥有利于土壤中反硝化功能微生物的生长,显著增加nirKnosZ的数量,长期化肥和猪粪配合施用还可显著增加narG的数量,但施肥对nirS的数量没有显著影响。

        图  4  土壤反硝化微生物功能基因丰度

        Figure 4.  Abundance of denitrification functional genes in soils

      • 土壤微生物群落结构与理化性状的关系如图5所示。RDA1解释了土壤微生物群落差异的54.6%,CK处理和CF、CSF以及CMF处理在此轴分开,且pH与RDA1轴和CK处理之间的夹角均为锐角,表明pH差异是导致CK处理和CF、CMF以及CSF处理微生物群落差异的主要影响因子。此外,CMF处理和CSF处理与全氮、NH4+-N和NO3-N均呈锐角,表明土壤氮含量对施有机肥处理 (CMF和CSF) 的细菌群落形成上发挥主导作用。典型相关分析 (VPA) 用于计算不同施肥模式和土壤的基础性质差异对微生物群落变化的解释量 (图6),二者对微生物群落变化的解释量为64.61%,其中共同解释部分达到26.25%。用Mental检验进一步验证单一因子对微生物群落的影响程度,结果表明,pH (r = 0.66,P < 0.01),全氮 (r = 0.74,P < 0.01)、NH4+-N (r = 0.75,P < 0.01) 和NO3-N (r = 0.80,P < 0.01) 对微生物群落的影响达到显著水平 (图6)。田间不同施肥处理会引起土壤含水量、有效氮,可溶性有机碳等的改变,从而驱动微生物群落的改变[31-32]。本研究结果表明土壤微生物群落分布与土壤化学性质有极强的相关性,微生物群落变化源于不同施肥处理。pH是影响土壤微生物群落及其多样性的重要因子,施肥导致的土壤pH变化会引起微生物在丰度上的响应[33]。氮源是微生物生命活动必不可缺的营养元素,施肥能够改变土壤中不同形态氮素的含量,从而改变微生物对氮素吸收的难易程度。长期的低氮或高氮环境能够驱动微生物群落的演替,产生适合环境生态位的微生物群落[28]。此外,氮素的差异能够影响整个氮循环过程,从而影响微生物群落的分布[34]。因此,施肥能够直接影响土壤的理化性质 (pH、氮源等),进而引起土壤微生物群落结构的变化。

        图  5  不同处理基于微生物群落和土壤理化性质的冗余分析

        Figure 5.  Redundancy analysis based on bncterial community and soil physical and chemical properties ofdifferent treatments

        图  6  基于不同施肥处理和土壤理化性质的典型相关分析 (VPA) 及相关土壤因子的Mantel检验

        Figure 6.  Variation partitioning analysis on the effects of fertilizer treatments and soil properties and Mantel test of related soil factors

      • 施肥导致的反应底物 (NH4+、NO3含量) 及土壤理化性质的差异是土壤微生物群落结构和功能微生物数量响应的主要决定因素。不施肥与化肥配施猪粪的土壤微生物群落聚类更接近,施化肥与化肥秸秆配施的群落结构更为接近。施肥对氨氧化细菌AOA数量影响不明显,但显著提高氨氧化古菌AOB和厌氧铁氨氧化功能微生物Feammox A6的数量,特别是有机肥 (猪粪、秸秆) 提高Feammox A6数量的效果大于化肥。长期单施化肥土壤中厌氧氨氧化细菌丰度显著降低,反硝化功能基因nirKnosZ丰度显著增高;化肥配施猪粪土壤中的厌氧氨氧化细菌丰度变化不明显,反硝化功能基因narGnirKnosZ丰度显著增高;化肥配施秸秆处理厌氧氨氧化细菌丰度变化不明显,反硝化功能基因nirKnosZ丰度显著增高。

    参考文献 (34)

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