QTL mapping of leaf related traits of maize with or without nitrogen stress
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摘要:目的
叶片是植物光合作用的重要器官，也是蒸腾作用和抗逆的主要器官。在施氮 (N+) 与不施氮 (N–) 条件下鉴定玉米叶片相关性状的QTL，为高光效玉米新品种选育提供重要的理论依据。
方法利用玉米骨干系综3为供体，许178为受体，通过杂交、回交和分子标记辅助选择的方法，构建了一套以许178为背景的综3单片段代换系 (SSSLs) 群体，其中包含160个单片段代换系。以这套SSSLs以及许178为材料，在施氮和不施氮条件下，通过一年三点 (贵州贵阳、德江和云南罗平) 的表型评价，利用复合区间作图法对叶面积、叶绿素含量和穗下绿叶数3个叶片相关性状进行QTL定位。
结果在基因组范围内，两种氮处理条件下共检测到42个主要叶片相关性状QTLs，分布于10条染色体上。N+条件下，在3个地点共检测出8个叶面积的QTLs，5个穗下绿叶数的QTLs，8个叶绿素QTLs。其中，qLAI1b在3个环境中同时被检测到；qLAI1b在德江、贵阳和罗平点对叶面积的贡献率分别为14.41%、14.47%和16.38%，来自于综3的等位基因起增效作用。同时，穗下绿叶数QTL (qLN7a和qLN7b) 在3个环境中均被检测到。在氮胁迫 (N–) 条件下，3个环境中共检测出9个叶面积QTLs，7个穗下绿叶数QTLs，8个叶绿素QTLs；其中，位于bin3.08的叶面积QTL qLAI3b，片段大小为120.48 cM，在德江、贵阳和罗平的贡献率分别为20.4%、12.8%和13.2%，来自于许178的等位基因起增效作用；玉米穗下绿叶数QTL，位于bin9.01区的穗下绿叶数QTL qLN9 (umc1957～umc1867～umc2078)，片段大小为62.7 cM。位于bin4.08的叶绿素含量QTL qCHL4a，片段大小为18.69 cM，在德江、贵阳和罗平点对叶绿素含量的贡献率分别为17.6%、10.6%和11.4%，且来自于亲本综3的等位基因起减效作用。
结论不同氮素处理下，检测出一些共有的玉米氮响应的主效 QTLs，如qLAI3b (umc1844～umc1320～bnlg1182)、qLN7a (umc1642～umc2160～umc1929)、qLN7b (phi328175)。这些区段可能在玉米氮素吸收、转运和利用过程中起重要作用，可作为下一步精细定位和图位克隆玉米叶片相关基因的重要候选区域。
Abstract:ObjectivesLeaf is the important organ for photosynthesis, transpiration and resistance in crops. The purpose of this study was to provide an important theoretical basis for breeding maize cultivars with high sunlight utilization efficiency, to dissect genetic variation of maize leaf-related traits under normal and no nitrogen application, and to map related QTLs.
MethodsUsing maize backbone Zong3 as the donor and Xu 178 as the acceptor, a total of 166 single segment substitution lines (SSSLs) of maize backbone Zong3 were constructed with Xu 178 as the background by means of hybrid, backcrossing and molecular marker assisted selection. All the SSSLs and Xu 178 were treated under normal (N+) and no N supply (N–) conditions in field plot experiment. The experiments were conducted in Guiyang and Dejiang City of Guizhou Province and Luoping City of Yunnan Province. The leaf area (LA), chlorophyll content (CC) and number of green leaves under ear (NGLE) were investigated.
ResultsAcross the whole genomes, 42 leaf-related traits QTLs were identified under both N+ and N– conditions and located on ten chromosomes. Under N+ treatment, we identified 8 QTLs related to leaf area, 5 QTLs related to green leaf number under ear, and 8 chlorophyll content QTLs at the three experimental sites. qLAI1b was detected in all the three sites, and it contributed 14.41%, 14.47% and 16.38% of phenotypic variation in Dejiang, Guiyang and Luoping, respectively. The allele from Zong3 exaggerated the phenotypic effects. Besides, the QTLs (qLN7a and qLN7b) related to the number of green leaves under ear were detected in the three experimental sites. Under N– treatment, we identified 9 QTLs related to LA, 7 QTLs related to NGLE, and 8 chlorophyll content QTLs at the three experimental sites. Among them, QTL qLAI3b, which was located on bin3.08, whose fragment size was 120.48 cM, and it contributed 20.4% (Dejiang), 12.8% (Guiyang) and 13.2% (Luoping), respectively. The allele from Xu178 synergistic the phenotypic effects. QTL qLN9 (umc1957～umc1867～umc2078), which was located in bin9.01, whose fragments size was 62.7 cM. QTL qCHL4a, which was located on bin4.08, whose fragment size was 18.69 cM, and it contributed 17.6% (Dejiang), 10.6%（Guiyang）and 11.4% (Luoping), respectively. The allele from Zong3 exaggerated the phenotypic effects.
ConclusionsTwo QTLs are detected under two nitrogen treatments, one is qLAI3b, which is located on Bin3.01 with flank markers of umc1844～umc1320～bnlg1182, and the other are qLN7a and qLN7b, which are located on bin7.01 and bin7.05 with flank markers of umc1642～umc2160～umc1929 and phi328175. These loci may play important roles in nitrogen absorbing, transporting and utilization during maize development, and served important candidate loci in further map-based cloning of maize leaf-related traits.
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玉米是我国三大主要粮食作物之一，保障玉米安全生产关系到我国粮食安全[1-2]。随着世界人口的不断增长，全球范围内对玉米的需求量也日益增加[3-4]。在玉米的诸多增产因素中，除选育高产品种外，增施氮肥也是提高玉米产量最关键的措施之一[5-6]。然而，大量氮肥的施用在获得玉米高产的同时，对环境造成了严重污染，如水体富营养化等[7]。在许多地区玉米生产中的实际施氮量已远远超过最佳经济施肥量，由于施肥方法不当、环境胁迫等原因严重降低了氮肥的利用效率，净效益比下降[8]。因此，根据土壤养分状况，最大限度地发挥氮肥利用效率，选育氮高效吸收利用的玉米品种，从而减少田间氮肥施用量已成为玉米育种的重要目标之一。玉米的氮素利用效率 (nitrogen use efficiency，NUE) 受品种、氮肥施用量、氮肥施用方法和土壤含氮量等多种因素的影响[9]。目前，玉米的氮肥利用效率平均在30%以下[10]。因此，提高玉米氮肥利用效率是一项非常迫切而重要的研究课题。利用现代生物技术，挖掘与氮高效基因位点紧密关联的分子标记，分析其遗传效应，可促进玉米耐低氮分子标记辅助选择体系的建立，是培育耐低氮玉米新品种的有效途径之一[11-12]，其显著的经济效益和生态效益，已逐渐成为玉米育种的方向。
前人曾利用不同的技术手段对植物株型性状在氮高效利用方面的评价做了大量研究。Rogerio等[13]研究指出，提高施氮水平将增加叶绿素含量、氨基酸总量、植物干物质中氮含量、株高、分蘖和子粒产量，降低植物干物质中糖含量。Miklos等[14]认为，玉米叶色的深浅取决于叶绿素的积累，不同的施肥水平和基因型的差异都会明显影响叶绿素的含量。刘宗华等[15] 以农大108的203个F2:3家系为材料，在施氮 (N+) 和不施氮 (N–) 2种条件下对拔节期到灌浆期的株高变化进行了动态QTL分析。在N–条件下拔节期至喇叭口期、开花期至灌浆期分别定位了1和5个条件QTL；在N+条件下的相应时期分别定位1和4个条件QTL。近年来，前人同时通过玉米氮响应相关突变体的研究和QTL定位等方法鉴定了多个与NUE相关的基因及位点[16-18]。
叶片是光合作用的重要器官，玉米吐丝前同化物对籽粒产量的贡献率小于10%，吐丝后叶片光合同化产物是玉米产量的主要来源[19]。因此，研究作物光合特性对低氮胁迫的响应机理，通过提高叶片的光合作用提高作物在低氮胁迫下的产量，改善土壤中氮肥的吸收利用效率，在经济效益和环境效益上都具有非常重大的意义。前人通过植物形态学、生理生化和分子生物学等方法对玉米叶片相关性状进行了大量研究。Agrama等[20]首次报道了玉米叶面积QTL。随后，Reymond等[21]利用RFLP标记定位了玉米叶长和叶宽的QTL，并发现不同环境下叶夹角和叶长比叶宽更容易受环境影响。在随后的研究中，科研工作者利用不同群体在不同环境下检测到大量叶形相关性状的QTL[22-27]。Lian等[28]利用表达谱芯片全基因组分析水稻苗期低氮胁迫基因表达，结果表明，在低氮胁迫下水稻根系光合相关基因的表达水平被下调了，而在叶片中的表达水平变化很小，推测可能是由于胁迫时间或胁迫程度还未影响叶片基因的表达。赵明辉等[29]研究表明，在低氮胁迫下，2 个水稻剑叶的叶绿素含量和净光合速率都受到了影响，但影响程度在 2 个水稻中有显著的不同，超绿水稻剑叶的这 2 个指标对低氮胁迫的反应较微弱。郭书磊等[30]通过对620个叶形QTL进行整合，利用元分析发掘出22个叶长、22个叶宽、12个叶面积以及17个叶夹角mQTL；进一步确定了44个与叶片发育密切相关的候选基因。然而，以叶形相关性状作为研究目标，探究氮素胁迫条件的遗传机制则少有报道。以玉米单片段代换系为材料，采用施氮和不施氮两种处理，鉴定不同施氮水平下的叶片相关性状变异情况，并利用复合区间作图法定位控制叶形相关性状的QTL。通过对两种施氮条件下的玉米叶形相关性状进行QTL定位，发掘控制玉米叶形相关的遗传区段，借助不同条件下的定位结果一致性分析，鉴定出与氮素吸收利用显著相关的候选遗传区段，为揭示玉米氮素效率利用差异以及分子辅助的提高玉米氮利用效率育种提供分子遗传学依据。
1. 材料与方法
1.1 供试材料
本研究所用的160份玉米单片段代换系由河南农业大学汤继华教授课题组提供。该群体是以优良玉米自交系综3为供体亲本、许178为受体亲本，通过杂交、回交、自交，结合SSR分子标记辅助选择的方法构建而成。综3和许178作为中国玉米育种中的骨干自交系材料，以这两个材料为亲本之一的玉米杂交种豫玉22号 (综3 × 87-1) 和农大108 (黄C × 许178) 先后在我国玉米生产上得到了大面积推广应用。
1.2 试验区条件与试验设计
试验采用裂区设计，不同氮处理水平作为主区，设施氮 (N+) 和不施氮 (N–) 两个水平，单片段代换系群体 (SSSLs) 作为副区。2015 年分别在贵州省德江县 (北纬28°15′51″、东经108°06′39″)、贵阳市 (北纬26°34′13″、东经106°42′39″) 和云南省罗平县 (北纬24°31′、东经103°57′) 进行田间试验。小区行长4.0 m，宽行0.7 m，单行区，每行17 株，株距0.235 m，密度为52500 plant/hm2，每个处理2次重复。对代表叶片相关性状叶面积 (cm2)、叶绿素含量 (mg/g) 和穗下绿叶数 (片) 进行田间测定。每个试点的表层土壤基础肥力状况见表1。
表 1 供试土壤表层基础肥力Table 1. Basic fertility of tested soils in 0–20 cm depth地点Experimental site 全氮Total N (g/kg) 有效磷Avail. P (mg/kg) 速效钾Avail. K (mg/kg) 有机质OM (g/kg) 贵阳市Guiyang 1.69 47.1 333 29.0 罗平县Luoping 2.45 38.4 303 55.1 德江县Dejiang 1.96 52.7 162 22.5 施氮 (N+) 处理：在苗期增施尿素375 kg/hm2、过磷酸钙375 kg/hm2、硫酸钾187.5 kg/hm2，大喇叭口期增施尿素375 kg/hm2。不施氮 (N–) 处理：除不施尿素外，所施P、K肥与施氮 (N+) 处理完全相同，其它田间管理措施同大田。
叶面积测量从小区内随机调查5株穗位叶： 叶面积 (cm2) = 长 (cm) × 宽 (cm) × 0.75
在玉米灌浆初期，利用Yaxin-1260叶绿素仪测定玉米穗位叶距离叶柄1/3处的叶绿素含量，每处理测定5株，取平均值。穗下绿叶数在玉米灌浆初期每处理测定5株，取平均值。采用目测计数，记为0～1，如，半片绿叶记为0.5。
1.3 表型数据分析与QTL定位
采用SPSS17.0统计软件，对160份SSSLs的开花期进行单因素方差分析和Duncan’s多重比较。利用复合区间作图法对叶形相关性状QTL进行定位[31]，若某一性状与许178在P < 0.05水平上差异显著，则认为该单片段代换系代换片段上存在一个QTL，并同时估算各个QTL的加性效应值及贡献率[32]。
加性效应值 (A) = (单片段代换系的表型值−对照的表型值)/2；
贡献率 (R%) = (加性效应值/对照的表型值) × 100。
2. 结果与分析
2.1 玉米叶片相关性状的表型分析
叶片相关性状在两种氮水平下均表现出丰富的表型变异，在施氮条件下，SSSLs群体的叶面积在贵阳的变异范围为292～599 cm2，平均值为 (471 ± 60) cm2 (表2)；在德江和罗平的变异范围分别为307～621 cm2和354～648 cm2；SSSLs群体的叶绿素含量在贵阳、德江和罗平的变异范围分别为32.9～46.1 mg/g、32.8～51.7 mg/g和39.8～54.7 mg/g。在玉米灌浆初期，SSSLs群体的穗下绿叶数在贵阳、德江和罗平的变异范围分别为1.47～5.35片、0.60～4.11片和1.36～4.61片。
表 2 不同品种及SSSLs群体叶片相关性状平均值Table 2. Phenotypic value of SSSLs population in three experimental sites处理
Treatment性状
Trait地点
Site许178 Xu178 综3 Zong3 SSSLs群体Population 平均值Mean 平均值Mean 范围Range 平均值Mean ± SD N+ 叶面积
Leaf area
(cm2)贵阳Guiyang 524 266 292～599 471 ± 60 德江Dejiang 584 150 307～621 499 ± 53 罗平Luoping 526 376 354～648 524 ± 47 叶绿素含量
Chl. content
(mg/g)贵阳Guiyang 39.3 33.1 32.9～46.1 40.4 ± 2.18 德江Dejiang 40.4 35.2 32.8～51.7 42.4 ± 3.23 罗平Luoping 46.5 37.8 39.8～54.7 48.2 ± 2.78 穗下绿叶数
GLUE贵阳Guiyang 3.87 2.46 1.47～5.35 3.39 ± 0.75 德江Dejiang 2.01 0.33 0.60～4.11 2.30 ± 0.70 罗平Luoping 2.47 2.64 1.36～4.61 3.12 ± 0.70 N– 叶面积
Leaf area
(cm2)贵阳Guiyang 434 345.0 252～504 378 ± 47 德江Dejiang 402 187.6 166～480 322 ± 64 罗平Luoping 480 268.0 212～572 424 ± 61 叶绿素含量
Chl. content
(mg/g)贵阳Guiyang 36.4 34.7 26.6～45.2 34.3 ± 3.15 德江Dejiang 41.8 31.5 21.1～49.2 37.4 ± 4.4 罗平Luoping 43.8 34.3 27.9～50.5 42.5 ± 3.7 穗下绿叶数
GLUE贵阳Guiyang 2.03 2.40 1.15～5.14 2.69 ± 0.89 德江Dejiang 1.11 0.20 0.15～3.61 1.70 ± 0.75 罗平Luoping 2.09 2.45 0.98～4.40 2.62 ± 0.70 注（Note）：GLUE—Number of green leaves under ear. 在缺氮条件下，SSSLs群体叶面积在贵阳、德江和罗平的变化范围分别为252～504 cm2、166～480 cm2、212～572 cm2；叶绿素含量的变化范围分别为26.6～45.2 mg/g、21.1～49.2 mg/g、27.9～50.5 mg/g；在玉米灌浆初期，穗下绿叶数的变化范围分别为1.15～5.14片、0.15～3.61片、0.98～4.40片。
2.2 玉米叶片相关性状的QTL分析
在施氮 (N+) 和不施氮 (N–) 两种处理条件下，利用复合区间作图法共检测到42个叶片相关性状QTL，分布于10条染色体上 (表3、表4、图1)，单个QTL可解释目标表型变异的变幅为6.2%～33.65%，其中在德江点共检测到19个QTL，在贵阳点共检测到16个QTL，在罗平点共检测到17个QTL。
表 3 施氮处理叶片相关性状的QTLsTable 3. The leaf traits related QTLs under nitrogen application性状
TraitQTL Bin 位点
Position
(cM)代换片段
Substitution segment加性效应值(A)
Additive effect贡献率(R%)
Contribution德江
Dejiang贵阳
Guiyang罗平
Luoping德江
Dejiang贵阳
Guiyang罗平
Luoping叶面积
Leaf areaqLAI1a 1.03 272–341.75 phi001～phi095～bnlg182～umc2217 –85.41 –16.31 qLAI1b 1.03 283.27–398.2 phi095～bnlg182～umc2217～bnlg2295 –84.19 –75.77 –86.13 –14.41 –14.47 –16.38 qLAI1c 1.06 532.8–782.35 bnlg1598～umc1122～umc2396～umc1013～dupssr12 –92.22 –17.61 qLAI3a 3.04 165–344.28 umc1425～umc2000～umc1307～umc1954 –138.63 –84.54 –23.72 –16.15 qLAI3b 3.08 608.17–728.65 umc1844～umc1320～bnlg1182 –91.53 –17.48 qLAI4a 4.03 81–252.52 phi074～umc1550～umc1117～umc1662 55.61 10.58 qLAI4b 4.11 687.8–737.8 umc1109～phi076～umc1058 –135.56 –23.19 qLAI8 8.06 412.9–571.5 umc2356～umc1724～phi080 57.97 11.03 穗下绿叶数
Number of green leaves under earqLN1 1.02 138.415–259.3 phi427913～bnlg1007～bnlg1203 0.92 0.61 15.77 15.76 qLN2 2.06 323.3–376.39 umc1485～bnlg1831～bnlg1396 –1.20 –31.01 qLN7a 7.01 27.2–249.1 umc1642～umc2160～umc1929 1.05 0.74 0.89 22.24 19.12 25.83 qLN7b 7.05 392.1–545.2 phi328175 0.98 0.56 0.98 18.76 14.47 19.47 qLN9 9.01 0–62.7 umc1957～umc1867～umc2078 0.78 0.92 28.56 27.04 叶绿素
Chlorophyll contentqCHL3a 3.06 344.28–538.2 umc1954～umc1266～umc2050 4.95 2.89 12.25 6.20 qCHL3b 3.09 789.78–806.9 umc1052～umc1641～末端 5.23 3.84 12.93 8.24 qCHL5 5.05 156.9–434.8 umc1587～mmc0081～umc2072 5.65 13.99 qCHL7 7.02 118.5–264.83 umc2160～umc1929～umc1585 5.16 2.66 12.77 6.76 qCHL10 10.04 253.3–283.5 umc1077～umc1053～umc2350 –3.19 –8.12 表 4 不施氮处理叶片相关性状的QTLsTable 4. The leaf traits related QTLs under no N supply性状
TraitQTL Bin 位点
Position
(cM)代换片段
Substitution segment加性效应值(A)
Additive effect贡献率(R%)
Contribution德江
Dejiang贵阳
Guiyang罗平
Luoping德江
Dejiang贵阳
Guiyang罗平
Luoping叶面积
Leaf areaqLAI1a 1.01 86.3–190.53 umc1269～phi427913～bnlg1007 –82.30 –20.47 qLAI1b 1.03 283.27–398.2 phi095～bnlg182～umc2217～bnlg2295 –66.38 –73.06 –15.28 –15.22 qLAI1c 1.06 457–599.89 umc1703～umc1754～bnlg1598～umc1122 –78.21 –19.45 qLAI2a 2.04 294.2–323.3 bnlg1018～umc2079～umc1485 –134.10 –27.94 qLAI2b 2.06 323.3–376.39 umc1485～bnlg1831～bnlg1396 –84.12 –17.53 qLAI3a 3.04 165–344.28 umc1425～umc2000～umc1307～umc1954 –87.48 –92.66 –21.76 –19.31 qLAI3b 3.08 608.17–728.65 umc1844～umc1320～bnlg1182 –82.00 –55.68 –63.29 –20.40 –12.82 –13.19 qLAI4 4.11 687.8–737.8 umc1109～phi076～umc1058 –118.01 –57.57 –19.35 –13.25 qLAI9 9.04 317.08–321.6 umc1771～umc1990～umc1519 –80.54 –16.78 穗下绿叶数
Number of green leaves under earqLN1 1.01 0–86.3 末端～phi097～umc1106～umc1269 1.05 0.86 24.59 22.36 qLN2 2.04 294.2–368.8 bnlg1018～umc2079～umc1485～bnlg1831 1.50 0.78 23.65 23.32 qLN3 3.02 77–165 bnlg1144～bnlg1647～umc1425 1.02 28.56 qLN6 6.05 244.75–335.45 umc1614～umc1020～umc1462 1.25 12.61 qLN7a 7.01 27.2–249.1 umc1642～umc2160～umc1929 1.06 1.01 1.02 25.50 29.75 28.56 qLN7b 7.05 392.1–545.2 phi328175 0.78 1.35 20.27 26.26 qLN9 9.01 0–62.7 umc1957～umc1867～umc2078 0.94 1.16 1.06 14.68 17.14 20.72 叶绿素
Chlorophyll contentqCHL1a 1.05 438.8–457 umc1461～umc1689～umc1124 –6.74 –16.13 qCHL1b 1.08 604.41–842.3 umc2396～umc1013～dupssr12～umc2047 –7.46 –17.84 qCHL2 2.06 294.2–408.89 bnlg1018～umc2079～umc1485～bnlg1831～bnlg1396～umc1637 –4.18 –11.49 qCHL3 3.04 165–344.28 umc1425～umc2000～umc1307～umc1954 –4.29 –11.80 qCHL4a 4.08 462.5–481.19 bnlg1444～phi066～umc2041 –7.37 –3.86 –4.98 –17.64 –10.61 –11.37 qCHL4b 4.11 687.8–737.8 umc1109～phi076～umc1058 –10.33 –24.71 qCHL9 9.06 415.05–520.76 umc2345～umc2207～bnlg292 –7.92 –18.10 qCHL10 10.04 253.3–283.5 umc1077～umc1053～umc2350 –4.86 –13.38 ![]()
图 1 两种施氮条件下检测到的玉米叶片相关性状QTLFigure 1. The QTL identified for leaf traits in different developing stages under N+ and N– conditions在施氮 (N+) 条件下，在3个地点共检测出8个叶面积的QTL，其中，qLAI1b在3个环境中同时被检测到 (表3)。qLAI1b在德江、贵阳和罗平点对叶面积的贡献率分别为14.4%、14.5%和16.4%；来自于综3的等位基因起增效作用。qLAI3b在德江和贵阳2个环境中检测到，对叶面积的贡献率分别为23.7%和16.2%；其余6个QTL仅在一个环境中检测到。在施氮 (N+) 条件下，在3个地点共检测出5个穗下绿叶数的QTL，分布在第1、2、7和9染色体上，有2个QTL (qLN7a和qLN7b) 在3个环境中同时被检测到。qLN7a在德江、贵阳和罗平点对穗下绿叶数的贡献率分别为22.24%、19.12%和25.8%；而qLN7b在德江、贵阳和罗平点对穗下绿叶数的贡献率分别为18.8%、14.5%和19.5%。在施氮 (N+) 条件下，在德江、贵阳、罗平分别检测到4、2、2个叶绿素QTL。在德江检测到的4个QTL分布在第3、5、7染色体上。在贵阳检测到的2个QTL分布在第7、10染色体上。在罗平检测到的2个QTL分布在第3染色体上。
在氮胁迫 (N–) 条件下，3个环境中共检测出9个叶面积QTL，分布于第1、2、3、4和9染色体上，单个QTL可解释的表型变异介于12.5%～27.9% 之间，其中qLAI3b在3个试验环境中同时被检测到，位于第3染色体上的bin3.08，在德江、贵阳和罗平的贡献率分别为20.4%、12.8%和13.2%，来自于许178的等位基因起增效作用。5个QTL在2个环境中同时被检测到。在不施氮 (N–) 条件下共检测出7个穗下绿叶数QTL，其中有2个QTL在3个环境中重复检出，其贡献率在12.6%～29.8%之间。在3个试验环境中重复检出、效应较大且一致的玉米穗下绿叶数QTL主要有bin7.01区的qLN7a (umc1642～umc2160～umc1929)，bin 9.01区的qLN9 (umc1957～umc1867～umc2078)。
在氮胁迫 (N–) 条件下，在3个环境中共检测出8个叶绿素QTL，分布在除第5、6、7、8以外其他染色体上，有1个QTL在3个环境中同时被检测到，位于bin 4.08的bnlg1444～phi 066～umc 2041染色体片段上，在德江、贵阳和罗平点对叶绿素含量的贡献率分别为17.6%、10.6%和11.4%，且来自于亲本综3的等位基因起减效作用。
3. 讨论
前人对玉米氮高效利用的QTL定位研究已有报道[33-35]。刘宗华等[36]的研究结果表明，叶绿素含量的QTL表达存在时空性，其中qchl4和qchl5b在整个生育时期均能检测到。Gallais等[37]在高氮和低氮水平下检测到的QTL有很大差别；本研究中，施氮条件下，在染色体bin1.03区域检测到QTL qLAI1b；前人在该区域检测出与株型性状和丝黑穗病抗性相关的QTL-qDH12[38-39]；检测开花期相关的QTL qDTP1b、QTL qDTS1[33]，一定程度上反映出株型、抗病性和生育期重叠的“一因多效”的作用结果。因此，对玉米叶片相关性状的QTL分析，不仅有助于增加对其遗传结构的了解，发掘更多候选基因，阐明叶形发育和形成的分子机制，还可为耐密理想株型的分子标记辅助选择提供依据。不施氮条件下，在染色体bin3.08区域检测到1个QTL qLAI3b；该区域存在抗大斑病QTL[40]、控制株高QTL[41]。在染色体bin7.01和bin 9.01区域，分别检测到QTL qLN7A和QTL qLN9；在该区域检测到玉米株型、品质和产量等相关性状的QTL[42-44]。在染色体bin4.08区域，检测到1个QTL qCHL4a。不同氮素处理下，共检测出在 3个试验环境中均稳定表达且效应较大的一致性QTLs，分别位于bin3.08区域QTL qLAI3b、bin7.01区域QTL qLN7a和bin7.05区域QTL qLN7b。虽然，该群体重要QTL区段在玉米氮素吸收、转运以及利用过程中的重要性的研究未见报道；但是，本研究结果证明了这些区段在玉米不同氮素处理过程中均起着重要作用，对于深入挖掘玉米氮素利用效率将提供更为可靠的分子遗传学信息。
叶片是光合作用的重要器官，氮素供应显著影响叶片的扩展，通过提高叶片的光合作用效率，从而达到提高作物在氮胁迫下的产量；Tian等[45]研究发现，氮高效品种在叶片扩展方面具有明显优势；在低氮条件下保持了较大的叶片面积，从而保证光合产物的生产用于籽粒灌浆[37]。在本研究中，氮胁迫下 共检测到4个叶型相关性状QTL，分别为QTL qLAI3b、QTL qCHL4a、QTL qLN7A和QTL qLN9。Bertin等[46]研究发现，控制叶片衰老的位于第7染色体的QTL可以解释表型变异的42%，是一个主效基因。氮胁迫条件下检测到叶型相关性状QTL为氮高效分子标记辅助选择育种提供支撑；但本试验是在一年多点环境下，试验结果仍需进一步验证。本研究为揭示玉米氮素效率利用差异以及分子辅助的提高玉米氮利用效率育种提供分子遗传学依据。
4. 结论
在不同环境条件下，检测出一些共有的玉米氮响应主效QTLs，如qLAI3b (umc1844～umc1320～bnlg1182)、qLN7a (umc1642～umc2160～umc1929)、qLN7b (phi328175)；在施氮和不施氮条件下均被检测到；同时还存在一些特异性的QTLs区段，如qCHL4a (bnlg1444～phi066～umc2041)、qLN9(umc1957～umc1867～umc2078) 仅在不施氮条件下被检测到。这些染色体区段将为进一步改良玉米氮素利用效率以及株型相关候选基因的图位克隆等提供更多的分子遗传学支持。
致谢：贵州省旱粮研究所杨明伦老师在田间管理过程中给予帮助，在此表示感谢。
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图 1 两种施氮条件下检测到的玉米叶片相关性状QTL
Figure 1. The QTL identified for leaf traits in different developing stages under N+ and N– conditions
表 1 供试土壤表层基础肥力
Table 1 Basic fertility of tested soils in 0–20 cm depth
地点Experimental site 全氮Total N (g/kg) 有效磷Avail. P (mg/kg) 速效钾Avail. K (mg/kg) 有机质OM (g/kg) 贵阳市Guiyang 1.69 47.1 333 29.0 罗平县Luoping 2.45 38.4 303 55.1 德江县Dejiang 1.96 52.7 162 22.5 
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表 2 不同品种及SSSLs群体叶片相关性状平均值
Table 2 Phenotypic value of SSSLs population in three experimental sites
处理
Treatment性状
Trait地点
Site许178 Xu178 综3 Zong3 SSSLs群体Population 平均值Mean 平均值Mean 范围Range 平均值Mean ± SD N+ 叶面积
Leaf area
(cm2)贵阳Guiyang 524 266 292～599 471 ± 60 德江Dejiang 584 150 307～621 499 ± 53 罗平Luoping 526 376 354～648 524 ± 47 叶绿素含量
Chl. content
(mg/g)贵阳Guiyang 39.3 33.1 32.9～46.1 40.4 ± 2.18 德江Dejiang 40.4 35.2 32.8～51.7 42.4 ± 3.23 罗平Luoping 46.5 37.8 39.8～54.7 48.2 ± 2.78 穗下绿叶数
GLUE贵阳Guiyang 3.87 2.46 1.47～5.35 3.39 ± 0.75 德江Dejiang 2.01 0.33 0.60～4.11 2.30 ± 0.70 罗平Luoping 2.47 2.64 1.36～4.61 3.12 ± 0.70 N– 叶面积
Leaf area
(cm2)贵阳Guiyang 434 345.0 252～504 378 ± 47 德江Dejiang 402 187.6 166～480 322 ± 64 罗平Luoping 480 268.0 212～572 424 ± 61 叶绿素含量
Chl. content
(mg/g)贵阳Guiyang 36.4 34.7 26.6～45.2 34.3 ± 3.15 德江Dejiang 41.8 31.5 21.1～49.2 37.4 ± 4.4 罗平Luoping 43.8 34.3 27.9～50.5 42.5 ± 3.7 穗下绿叶数
GLUE贵阳Guiyang 2.03 2.40 1.15～5.14 2.69 ± 0.89 德江Dejiang 1.11 0.20 0.15～3.61 1.70 ± 0.75 罗平Luoping 2.09 2.45 0.98～4.40 2.62 ± 0.70 注（Note）：GLUE—Number of green leaves under ear.
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表 3 施氮处理叶片相关性状的QTLs
Table 3 The leaf traits related QTLs under nitrogen application
性状
TraitQTL Bin 位点
Position
(cM)代换片段
Substitution segment加性效应值(A)
Additive effect贡献率(R%)
Contribution德江
Dejiang贵阳
Guiyang罗平
Luoping德江
Dejiang贵阳
Guiyang罗平
Luoping叶面积
Leaf areaqLAI1a 1.03 272–341.75 phi001～phi095～bnlg182～umc2217 –85.41 –16.31 qLAI1b 1.03 283.27–398.2 phi095～bnlg182～umc2217～bnlg2295 –84.19 –75.77 –86.13 –14.41 –14.47 –16.38 qLAI1c 1.06 532.8–782.35 bnlg1598～umc1122～umc2396～umc1013～dupssr12 –92.22 –17.61 qLAI3a 3.04 165–344.28 umc1425～umc2000～umc1307～umc1954 –138.63 –84.54 –23.72 –16.15 qLAI3b 3.08 608.17–728.65 umc1844～umc1320～bnlg1182 –91.53 –17.48 qLAI4a 4.03 81–252.52 phi074～umc1550～umc1117～umc1662 55.61 10.58 qLAI4b 4.11 687.8–737.8 umc1109～phi076～umc1058 –135.56 –23.19 qLAI8 8.06 412.9–571.5 umc2356～umc1724～phi080 57.97 11.03 穗下绿叶数
Number of green leaves under earqLN1 1.02 138.415–259.3 phi427913～bnlg1007～bnlg1203 0.92 0.61 15.77 15.76 qLN2 2.06 323.3–376.39 umc1485～bnlg1831～bnlg1396 –1.20 –31.01 qLN7a 7.01 27.2–249.1 umc1642～umc2160～umc1929 1.05 0.74 0.89 22.24 19.12 25.83 qLN7b 7.05 392.1–545.2 phi328175 0.98 0.56 0.98 18.76 14.47 19.47 qLN9 9.01 0–62.7 umc1957～umc1867～umc2078 0.78 0.92 28.56 27.04 叶绿素
Chlorophyll contentqCHL3a 3.06 344.28–538.2 umc1954～umc1266～umc2050 4.95 2.89 12.25 6.20 qCHL3b 3.09 789.78–806.9 umc1052～umc1641～末端 5.23 3.84 12.93 8.24 qCHL5 5.05 156.9–434.8 umc1587～mmc0081～umc2072 5.65 13.99 qCHL7 7.02 118.5–264.83 umc2160～umc1929～umc1585 5.16 2.66 12.77 6.76 qCHL10 10.04 253.3–283.5 umc1077～umc1053～umc2350 –3.19 –8.12
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表 4 不施氮处理叶片相关性状的QTLs
Table 4 The leaf traits related QTLs under no N supply
性状
TraitQTL Bin 位点
Position
(cM)代换片段
Substitution segment加性效应值(A)
Additive effect贡献率(R%)
Contribution德江
Dejiang贵阳
Guiyang罗平
Luoping德江
Dejiang贵阳
Guiyang罗平
Luoping叶面积
Leaf areaqLAI1a 1.01 86.3–190.53 umc1269～phi427913～bnlg1007 –82.30 –20.47 qLAI1b 1.03 283.27–398.2 phi095～bnlg182～umc2217～bnlg2295 –66.38 –73.06 –15.28 –15.22 qLAI1c 1.06 457–599.89 umc1703～umc1754～bnlg1598～umc1122 –78.21 –19.45 qLAI2a 2.04 294.2–323.3 bnlg1018～umc2079～umc1485 –134.10 –27.94 qLAI2b 2.06 323.3–376.39 umc1485～bnlg1831～bnlg1396 –84.12 –17.53 qLAI3a 3.04 165–344.28 umc1425～umc2000～umc1307～umc1954 –87.48 –92.66 –21.76 –19.31 qLAI3b 3.08 608.17–728.65 umc1844～umc1320～bnlg1182 –82.00 –55.68 –63.29 –20.40 –12.82 –13.19 qLAI4 4.11 687.8–737.8 umc1109～phi076～umc1058 –118.01 –57.57 –19.35 –13.25 qLAI9 9.04 317.08–321.6 umc1771～umc1990～umc1519 –80.54 –16.78 穗下绿叶数
Number of green leaves under earqLN1 1.01 0–86.3 末端～phi097～umc1106～umc1269 1.05 0.86 24.59 22.36 qLN2 2.04 294.2–368.8 bnlg1018～umc2079～umc1485～bnlg1831 1.50 0.78 23.65 23.32 qLN3 3.02 77–165 bnlg1144～bnlg1647～umc1425 1.02 28.56 qLN6 6.05 244.75–335.45 umc1614～umc1020～umc1462 1.25 12.61 qLN7a 7.01 27.2–249.1 umc1642～umc2160～umc1929 1.06 1.01 1.02 25.50 29.75 28.56 qLN7b 7.05 392.1–545.2 phi328175 0.78 1.35 20.27 26.26 qLN9 9.01 0–62.7 umc1957～umc1867～umc2078 0.94 1.16 1.06 14.68 17.14 20.72 叶绿素
Chlorophyll contentqCHL1a 1.05 438.8–457 umc1461～umc1689～umc1124 –6.74 –16.13 qCHL1b 1.08 604.41–842.3 umc2396～umc1013～dupssr12～umc2047 –7.46 –17.84 qCHL2 2.06 294.2–408.89 bnlg1018～umc2079～umc1485～bnlg1831～bnlg1396～umc1637 –4.18 –11.49 qCHL3 3.04 165–344.28 umc1425～umc2000～umc1307～umc1954 –4.29 –11.80 qCHL4a 4.08 462.5–481.19 bnlg1444～phi066～umc2041 –7.37 –3.86 –4.98 –17.64 –10.61 –11.37 qCHL4b 4.11 687.8–737.8 umc1109～phi076～umc1058 –10.33 –24.71 qCHL9 9.06 415.05–520.76 umc2345～umc2207～bnlg292 –7.92 –18.10 qCHL10 10.04 253.3–283.5 umc1077～umc1053～umc2350 –4.86 –13.38
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