Effects of zinc deficiency on growth, photosynthetic characteristics, and endogenous hormone content of apple sapling ‘Tianhong 2/Jizhen 2’
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摘要:目的
研究‘天红2号/冀砧2号’幼树生长、光合特性及内源激素变化对缺锌胁迫的响应。
方法以1年生‘天红2号/冀砧2号’砧穗组合苹果幼苗为试材，采用营养液浇灌方式进行盆栽试验。营养液设置供锌浓度分别为0 µmol/L (Zn0)、2 µmol/L (Zn2)、4 µmol/L (Zn4，对照) ，共3个处理。处理后40天，测量幼树株高、叶面积，取样测定叶片锌含量、光合特性、叶绿素含量、叶绿素荧光参数、内源激素含量等指标，并分析叶绿素合成关键酶基因MdHEMA1、叶绿素降解关键酶基因MdPAO、生长素合成基因MdYUCCA4a和MdYUCCA6a相对表达量。
结果‘天红2号/冀砧2号’幼树的株高、叶面积及叶片锌含量随供锌浓度的下降而显著降低；供锌浓度越低，生长素合成基因MdYUCCA4a和MdYUCCA6a相对表达量越低，植株体内IAA和GA3水平越低；与对照(Zn4)相比，净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、气孔导度(Gs)在缺锌条件下显著降低，胞间CO2浓度(Ci)升高；缺锌胁迫下，叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素含量下降，叶绿素a/b值上升，叶绿素合成关键酶基因MdHEMA1和叶绿素降解关键酶基因MdPAO均显著升高；‘天红2号/冀砧2号’幼树叶片叶绿素荧光参数Fv/Fm、ΦPSⅡ、qP及ETR值在缺锌胁迫下显著下降， Fo和NPQ显著上升。
结论缺锌胁迫使生长素合成基因MdYUCCA4a和MdYUCCA6a表达量显著降低，IAA合成受阻，导致IAA和GA3水平降低，抑制幼树生长。PSⅡ反应中心和PSⅡ氧化传递链在缺锌胁迫下受到一定损伤，造成PSⅡ活性下降，并加剧叶绿素降解，导致光合作用降低；同时，叶绿素降解基因MdPAO的高表达引起树体产生反馈调节机制来进行自我保护，诱导叶绿素合成代谢途径中的关键酶基因MdHEMA1表达量升高，但所合成的叶绿素依然不能补偿由缺锌所造成的叶绿素降解损失。
Abstract:ObjectivesThe study investigates the growth response, photosynthetic characteristics, and changes in endogenous hormones in young ‘Tianhong 2 / Jizhen 2’ trees due to zinc deficiency.
MethodsOne-year-old ‘Tianhong 2 / Jizhen 2’ rootstock-spike combined apple saplings were used as experimental materials. Three zinc concentrations were set up in nutrient solution: 0 µmol/L (Zn0), 2 µmol/L (Zn2), and 4 µmol/L (Zn4, control). We measured the plant height and leaf area of young trees and determined zinc content, photosynthetic characteristics, chlorophyll content, chlorophyll fluorescence parameters and endogenous hormone in leaves at 40 days after treatment. We studied the relative expression levels of the enzyme encoding gene MdHEMA1, chlorophyll degradation key enzyme encoding gene MdPAO, and auxin synthesis genes MdYUCCA4a and MdYUCCA6a.
ResultsThe plant height, leaf area, and leaf zinc content of ‘Tianhong 2/Jizhen 2’ saplings (P<0.05) decreased with decreasing zinc concentration. The lower the zinc concentration, the lower the relative expression of auxin synthesis genes MdYUCCA4a and MdYUCCA6a and IAA and GA3 levels in plants. Compared with the control, net photosynthetic rate (Pn), transpiration rate(Tr), and stomatal conductance (Gs) (P<0.05) decreased, while intercellular CO2 concentration (Ci) increased under zinc deficiency. Under zinc stress, chlorophyll a, b, and total chlorophyll content decreased, and the chlorophyll a/b ratio increased. Chlorophyll synthesis enzyme encoding gene MdHEMA1 and chlorophyll degradation enzyme encoding gene MdPAO (P<0.05) increased. The chlorophyll fluorescence parameters Fv/Fm, ΦPSⅡ, qP and ETR of ‘Tianhong 2/Jizhen 2’ seedlings (P<0.05) decreased under zinc deficiency, while Fo and NPQ increased.
ConclusionsThe expression of auxin synthesis genes MdYUCCA4a and MdYUCCA6a decreased under zinc deficiency, and IAA synthesis was blocked. This decreased IAA and GA3 levels, inhibiting the young tree growth. The PSⅡ reaction center and PSⅡ oxidation transfer chain were damaged to some extent under zinc deficiency, resulting in decreased PSⅡ activity, chlorophyll degradation, and decreased photosynthesis. Simultaneously, the high expression of the chlorophyll degradation gene MdPAO caused the tree to produce a feedback regulation mechanism to protect itself. It induced the expression of the key enzyme gene MdHEMA1 in the chlorophyll synthesis metabolism pathway. However, the synthesized chlorophyll did not compensate for the loss of chlorophyll degradation caused by zinc deficiency.
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锌是植物生长所必需的微量元素，参与植物体内光合作用、碳水化合物的代谢、蛋白质合成、调节生长素的代谢等过程[1-2]，被认为是继氮之后最容易缺乏的矿质元素[3]。苹果对缺锌比较敏感[4]，树体缺锌易发生小叶病。当前，苹果缺锌已成为许多苹果产区苹果产量和品质提高的重要限制因子之一[5]。
锌对植物光合作用的正常进行和维持叶绿体的结构及功能具有重要作用[6-7]。缺锌可导致大田苹果树在盛果期光合速率下降，叶片的光能吸收利用效率降低[8]。另外，缺锌还会引起玉米叶绿素含量下降，叶绿体数量减少[9]。关于缺锌对苹果叶片叶绿素含量变化影响的分子机理研究较少。HEMA1是调控叶绿素合成途径的关键酶基因，在叶绿素合成过程中具有重要作用[10]。叶绿素降解途径包括氧化降解和酶降解，酶降解途径目前比较认可的是PAO途径，脱镁叶绿酸a加氧酶(pheophorbide a oxygenase，PAO)是叶绿素降解代谢的关键酶。
缺锌会使植物体内生长素含量下降[11]。有研究发现，锌是色氨酸的重要组成成分，而色氨酸是IAA合成的重要前体物质，因此认为缺锌导致IAA含量降低是因为抑制了其前体物质色氨酸的合成[12]。但也有报道称，色氨酸含量不是限制IAA合成的关键因子，缺锌可能是减弱了植物由色氨酸向IAA的转化或增强了IAA的降解[11]。YUCCA基因编码黄素单加氧酶，在生长素生物合成的吲哚丙酮酸途径中发挥重要作用，是生长素合成的关键限速酶[13]。其是否响应苹果缺锌胁迫下IAA的生物合成尚无报道。
不同苹果砧木对缺锌及高锌胁迫的耐性不同[14]。前人研究表明，不同砧木上嫁接红富士品种会影响根系对锌的吸收，SH40作中间砧时根系中锌含量较低[15]。‘冀砧2号’是从SH40的实生后代中选出的苹果矮化砧木新品种，具有矮化性状明显，嫁接亲和性好，接穗早花早果、丰产性强等优点[16]。‘冀砧2号’作砧木是否表现缺锌以及其对缺锌胁迫下的响应研究尚无报道。因此，本研究以‘冀砧2号’自根砧上嫁接‘天红2号’红富士苹果为试材，探讨缺锌胁迫对‘天红2号/冀砧2号’苹果幼树生长、光合特性及激素变化的影响，比较分析生长素合成关键酶基因MdYUCCA4a、MdYUCCA6a以及叶绿素合成、降解关键基因MdHEMA1和MdPAO在缺锌和健康叶片之间的相对表达差异，以期为阐明缺锌导致苹果光合和激素代谢变化的生理生化机制提供理论依据，并为‘冀砧2号’自根砧的优质高效利用提供理论支撑。
1. 材料与方法
1.1 试验设计
试验于2021年在河北农业大学西校区创新试验园进行。试验材料为1年生盆栽‘天红2号/冀砧2号’砧穗组合。2021年3月，将‘冀砧2号’自根砧苗栽植于装有沙子的塑料花盆(口径30 cm，底径20 cm，盆高22 cm)中，栽植后一周采用单芽腹接嫁接‘天红2号’。嫁接后每15天浇一次1/2 Hoagland营养液，保证幼树生长。处理前1个月停止浇营养液，每隔2天进行去离子水冲洗，以消除砂培中残存的矿质营养成分。
2021年8月1日开始处理。除Zn2+以外，其他营养元素按照1/2 Hoagland营养液标准配制。设3个不同锌浓度，即0 µmol/L (Zn0)、2 µmol/L (Zn2)、4 µmol/L (Zn4)。随机区组设计，每小区15株幼树，3次重复，每处理共45株幼树。每隔1天对各试材定量浇灌1.5 L营养液，为避免高盐毒害，每隔7天进行1次4 L去离子水冲洗。处理40天后采样测定各项指标。
1.2 测定项目与方法
1.2.1 生长指标测定
在处理第0天和第40天测量新梢生长量，用1 m钢卷尺测量嫁接口至顶端生长点的高度；处理第40天，选取各处理新梢顶端下部第5～7片叶，用Yaxin-1241叶面积仪测量叶面积。
1.2.2 光合参数、叶绿素含量及叶绿素荧光参数测定
处理第40天，测定叶片光合、荧光参数及叶绿素含量。使用Li-6800 XT便携式光合仪测定植株叶片净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间二氧化碳浓度(Ci)、蒸腾速率(Tr)。每处理选取5片完全暴露在光下且叶位相同的功能叶，在9：00—11：00进行测量。测定时采用1 cm2的叶室，流速为500 μmol/s，参比室的CO2浓度为400 μmol/mol，光强设置为1000 μmol/(m2·s)。
采用Handy PEA叶绿素荧光仪测定叶片叶绿素荧光参数，包括初始荧光(Fo)、PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)、PSⅡ实际光化学效率(ΦPSⅡ)、光化学猝灭系数(qP)、非光化学猝灭系数(NPQ)和表观光合电子传递效率(ETR)。叶绿素含量测定参照Arnon[17]的方法。
1.2.3 植物内源激素含量测定
植物内源激素IAA、GA3、玉米素核苷(ZR)采用高效液相色谱法测定。
1.2.4 锌含量测定
采用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP)测定。
1.2.5 叶绿素合成降解及IAA合成相关基因表达量测定
采取距新梢顶端(生长点)以下第6～7片成熟叶片进行叶绿素相关生理指标及基因表达分析；采取新梢顶端(生长点)的第2～3片嫩叶进行内源激素含量及相关基因表达分析。采用聚合美试剂盒提取总RNA，将RNA反转录成cDNA并稀释，用UEIrisIIRT-PCR试剂盒(美国光大股份有限公司，中国苏州)进行荧光定量。检测MdHEMA1、MdPAO、MdYUCCA4a、MdYUCCA6a的表达量。利用7500 Real-time PCR system进行q RT-PCR，反应程序为起始模板95℃酶激活2 min，95℃变性15 s，57℃退火和延伸60 s，45个循环，4℃终止反应。每个基因表达量均测定3个生物学重复和3个技术重复，计算平均值。利用NCBI设计基因特异性引物，由安徽通用生物股份有限公司合成(表1)。
表 1 实时荧光定量PCR基因引物序列Table 1. Primer sequences for the real-time PCR quantification基因 Gene 引物序列 Primer sequences (5'−3') F 引物序列 Primer sequences (5'−3') R β-Actin GGATTTGCTGGTGATGATGCT AGTTGCTCACTATGCCGTGCT MdHEMA1 GAACATGCACGCTCTTAAC CGAGTTGAAGATTACACCAG MdPAO CAAATGAAGGCAACCCACGG AGTCTTCCCTGGTGCCATTG MdYUCCA4a TAGGCAACACAGACCAATTAGG ACAATGCTCCAACATCAAGAAC MdYUCCA6a GGACTACTTGGTGCCTCAATGGA ATGATGGTGGTGATGATGATGATAGTG 1.3 数据分析
试验数据采用IBM SPSS Statistics 26软件进行方差分析，采用Tukey’s 检验进行多重比较(P<0.05)，Sigma Plot 14.0 软件作图。
2. 结果与分析
2.1 缺锌胁迫对‘天红2号/冀砧2号’幼树生长和锌含量的影响
由表2可知，Zn4处理的叶片锌含量最高，分别是Zn0和Zn2处理的2.12、1.29倍；Zn0和Zn2处理的新梢生长量分别比Zn4处理低52.17%、27.52%，叶面积比Zn4处理低51.10%、25.30%。由此可见，缺锌胁迫导致叶片锌含量显著降低，抑制了‘天红2号/冀砧2号’幼树的新梢生长和叶片发育 (图1)。
表 2 缺锌胁迫对‘天红2号/冀砧2号’幼树生长和锌含量的影响Table 2. Effects of zinc deficiency on the growth and zinc content of ‘Tianhong 2/Jizhen 2’ saplings处理
Treatment新梢生长量
Shoot length
(cm)叶面积
Leaf area
(cm2)锌含量
Zn content
(mg/kg)Zn0 11.00±1.73 c 13.57±2.85 c 10.47±0.45 c Zn2 16.67±1.15 b 20.73±3.50 b 17.27±0.53 b Zn4 23.00±3.61 a 27.75±1.41 a 22.25±0.29 a 注：同列数据后不同小写字母表示处理间差异显著 (P<0.05)。
Note: Values followed by different lowercase letters in a column indicate significant difference among treatments (P<0.05).2.2 缺锌胁迫对‘天红2号/冀砧2号’幼树叶片叶绿素含量的影响
由表3可知，随锌浓度的下降，苹果叶片叶绿素含量显著下降。Zn0处理的叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素含量分别较Zn4下降49.04%、64.71%和54.34%；Zn2处理的叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素含量分别较Zn4下降15.38%、34.31%和21.54%。而Zn0和Zn2处理的叶绿素a/b值显著高于Zn4处理，分别是Zn4处理的1.35、1.23倍。
表 3 缺锌胁迫对‘天红2号/冀砧2号’幼树叶片叶绿素含量的影响Table 3. Chlorophyll content in leaves of ‘Tianhong 2/Jizhen 2’ saplings under different Zn concentrations处理
Treatment叶绿素a (mg/g)
Chlorophyll a叶绿素b (mg/g)
Chlorophyll b总叶绿素 (mg/g)
Total chlorophyll叶绿素a/b
chlorophyll a/bZn0 1.06±0.02 c 0.36±0.01 c 1.42±0.03 c 2.91±0.02 a Zn2 1.76±0.13 b 0.67±0.08 b 2.44±0.21 b 2.64±0.14 b Zn4 2.08±0.09 a 1.02±0.07 a 3.11±0.06 a 2.15±0.03 c 注：同列数据后不同小写字母表示处理间差异显著 (P<0.05)。
Note: Values followed by different lowercase letters in a column indicate significant difference among treatments (P<0.05).2.3 缺锌胁迫对‘天红2号/冀砧2号’幼树光合参数的影响
由表4可知，与Zn4相比，Zn0和Zn2处理的净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)和气孔导度(Gs)显著降低，且胁迫程度越大，下降幅度越大。Zn0和Zn2处理的Pn分别比Zn4低23.38%、13.01%，Tr分别比Zn4低36.58%、15.49%；Zn4处理的Gs分别是Zn0和Zn2处理的1.69、1.22倍，Zn0处理的Gs比Zn2低27.87%；不同锌浓度处理下的胞间CO2浓度(Ci)与Pn、Tr和Gs的变化趋势相反，Zn0的Ci最高，分别是Zn2和Zn4的1.04、1.10倍。
表 4 缺锌胁迫对‘天红2号/冀砧2号’幼树光合参数的影响Table 4. Photosynthetic parameters of ‘Tianhong 2 / Jizhen 2’ saplings under different Zn concentrations处理
Treatment净光合速率 [µmol/(m2·s)]
Pn蒸腾速率 [mmol/(m2·s)]
Tr气孔导度 [mmol/(m2·s)]
Gs胞间CO2浓度 [µmol/mol]
CiZn0 9.60±0.17 c 12.45±0.37 c 247.04±17.63 c 363.40±5.07 a Zn2 10.90±0.41 b 16.59±0.52 b 342.51±10.74 b 348.28±8.27 b Zn4 12.53±0.34 a 19.63±0.54 a 416.95±5.64 a 329.41±5.95 c 注：同列数据后不同小写字母表示处理间差异显著 (P<0.05)。
Note: Values followed by different lowercase letters in a column indicate significant difference among treatments (P<0.05).2.4 缺锌胁迫对‘天红2号/冀砧2号’幼树叶片叶绿素荧光参数的影响
不同锌浓度处理对苹果叶片叶绿素荧光参数的影响不同(表5)。Zn0和Zn2处理的Fo分别较Zn4升高了11.67%、7.60%；与Zn4处理相比，Zn0和Zn2处理的Fv/Fm、ΦPSⅡ、qP及ETR均显著下降。Zn0和Zn2处理的ΦPSⅡ分别比Zn4低35.48%、22.58%，qP分别比Zn4低44.19%、20.93%，ETR分别比Zn4低29.66%、16.41%；缺锌胁迫使NPQ显著上升，Zn0和Zn2处理的NPQ分别是Zn4处理的2.37、1.79倍。
表 5 缺锌胁迫对‘天红2号/冀砧2号’幼树叶片叶绿素荧光参数的影响Table 5. Chlorophyll fluorescence parameters of the leaves of ‘Tianhong 2/Jizhen 2’ saplings under different Zn concentrations处理
Treatment初始荧光
FoPSⅡ最大光化学效率
Fv/FmPSⅡ实际光化学效率
ΦPSⅡ光化学猝灭系数
qP表观光合电子传递效率
ETR非光化学猝灭系数
NPQZn0 347.67±4.04 a 0.78±0.01 c 0.20±0.01 c 0.24±0.03 c 72.19±11.28 c 0.57±0.03 a Zn2 335.00±5.51 b 0.81±0.01 b 0.24±0.01 b 0.34±0.02 b 85.79±1.61 b 0.43±0.04 b Zn4 311.33±7.23 c 0.83±0.01 a 0.31±0.01 a 0.43±0.03 a 102.63±5.97 a 0.24±0.07 c 注：同列数据后不同小写字母表示处理间差异显著 (P<0.05)。
Note: Values followed by different lowercase letters in a column indicate significant difference among treatments (P<0.05).2.5 缺锌胁迫对‘天红2号/冀砧2号’幼树叶片内源激素含量的影响
由表6可知，缺锌胁迫使苹果叶片内源IAA和GA3含量显著下降。Zn4、Zn2和Zn0处理的叶片IAA和GA3含量差异显著，两种内源激素含量在不同锌浓度处理下的苹果叶片中均表现为Zn4>Zn2>Zn0的规律。Zn0和Zn2处理的IAA含量分别比Zn4低52.17%、39.48%，GA3含量分别比Zn4低49.29%、38.20%。这与不同锌浓度处理下的苹果新梢生长量结果相符。玉米素核苷(ZR)含量Zn2处理最高，显著高于Zn0和Zn4处理。
表 6 缺锌胁迫下‘天红2号/冀砧2号’幼树叶片内源激素的含量 (ng/g)Table 6. Content of endogenous hormones in the leaves of ‘Tianhong 2/Jizhen 2’ saplings under different Zn concentrations处理 Treatment 吲哚乙酸 IAA 赤霉素 GA3 玉米素核苷 ZR Zn0 34.71±0.03 c 121.90±0.38 c 11.48±0.67 b Zn2 43.92±0.08 b 148.55±0.09 b 19.30±2.74 a Zn4 72.57±0.35 a 240.38±0.97 a 9.49±2.31 b 注：同列数据后不同小写字母表示处理间差异显著 (P<0.05)。
Note: Values followed by different lowercase letters in a column indicate significant difference among treatments (P<0.05).2.6 缺锌胁迫对‘天红2号/冀砧2号’幼树叶绿素合成降解相关基因相对表达量的影响
如图2所示，叶绿素合成基因MdHEMA1和叶绿素降解基因MdPAO均在Zn0处理下表达量最高，而Zn4和Zn2处理的MdHEMA1和MdPAO表达量无显著差异。Zn0处理的MdHEMA1表达量分别是Zn2和Zn4的2.80、2.67倍，MdPAO表达量分别是Zn2和Zn4的3.64、3.33倍。
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图 1 不同锌浓度处理下‘天红2号/冀砧2号’幼树Figure 1. ‘ Tianhong 2/Jizhen 2 ’ saplings under different Zn concentrations![]()
图 2 缺锌胁迫对MdHEMA1和MdPAO相对表达量的影响注：柱上不同小写字母表示处理间差异显著 (P<0.05)Figure 2. Effects of Zn deficiency on the relative expression levels of MdHEMA1 and MdPAONote: Different lowercase letters above the bars indicat significant difference among treatments (P<0.05)2.7 缺锌胁迫对‘天红2号/冀砧2号’幼树IAA合成相关基因相对表达量的影响
如图3所示，锌供应不足显著降低苹果幼树叶片中MdYUCCA4a和MdYUCCA6a的表达量。Zn4处理的MdYUCCA4a表达量分别是Zn0和Zn2处理的6.17、1.76倍；Zn2处理的MdYUCCA4a表达量也显著高于Zn0处理，是Zn0处理的3.50倍。Zn4处理的MdYUCCA6a表达量同样显著高于Zn0和Zn2处理，分别是Zn0和Zn2处理的2.94、2.20倍。
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图 3 缺锌胁迫对MdYUCCA4a和MdYUCCA6a相对表达量的影响注：柱上不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)Figure 3. Effects of Zn deficiency on the relative expression levels of MdYUCCA4a and MdYUCCA6aNote: Different lowercase letters above the bars indicat significant difference among treatments (P<0.05)3. 讨论
形态特征和生理变化是植物响应外界环境所做出的重要改变，可以反映植物的生长状况[18]。本研究结果表明，缺锌严重影响了‘天红2号/冀砧2号’幼树新梢生长和叶片发育，使树体生长受到抑制。范晓丹等[19] 通过对8种苹果砧木进行耐缺锌能力综合评价，发现耐缺锌能力最强的为小金海棠，其次为火焰海棠，山定子、锡金海棠、八棱海棠和平邑甜茶的耐缺锌能力较弱，丽江山定子和新疆野苹果的耐缺锌能力最弱。其中锡金海棠叶片锌含量在缺锌和对照下分别为16.7、39.2 mg/kg，缺锌较对照锌含量下降57.40%，平邑甜茶叶片锌含量在缺锌和对照下分别为9.9、18.5 mg/kg，缺锌较对照锌含量下降46.48%，经比较分析，本研究中，‘天红2号/冀砧2号’苹果幼树叶片锌含量在Zn0处理下较Zn4处理下降了52.94%，与耐缺锌能力较弱的平邑甜茶和锡金海棠相似，因此生产上应注意对该砧穗组合的锌元素供应，避免由于缺锌引起生长与生理障碍。
激素作为信号分子在时间和空间上调控植物发育的诸多过程[20]。植物可以通过若干途径合成IAA，其中吲哚-3-丙酮酸途径是目前公认植物体内IAA合成的最主要途径[21]。该途径由色氨酸转氨酶(TAAs)通过转氨基将色氨酸转变为吲哚-3-丙酮酸(IPA)，后者被核黄素单加氧酶(YUCs)进一步催化成吲哚-3-乙酸(IAA)。而锌是色氨酸合成所必需的。本研究中，不同锌浓度下，‘天红2号/冀砧2号’苹果幼树叶片的IAA和GA3含量差异显著。叶片中生长素合成基因MdYUCCA4a和MdYUCCA6a表达量在Zn0处理下均显著降低。由此推断，缺锌可能首先导致叶片中色氨酸含量下降，继而引起吲哚-3-丙酮酸(IPA)含量下降，YUC家族催化的底物浓度降低导致YUCCA4a和YUCCA6a相对表达量降低，IAA合成受阻进而引起叶片IAA含量降低。有研究表明，生长素可通过调节赤霉素合成基因的表达来影响赤霉素的生成[22-23]。本研究中，缺锌胁迫下苹果叶片GA3含量下降可能是由于IAA含量的下降影响了GA3的合成，其具体调控机制有待进一步研究。IAA和GA3对植物生长有直接促进作用[24]，两者含量的下降是导致缺锌胁迫下‘天红2号/冀砧2号’苹果幼树新梢和叶片发育缓慢的间接原因。
光合作用是果树生长和结果的基础，构成果树根、茎、叶、花、果实的90%以上的干物质来自叶片的光合产物[25]。导致植物叶片光合作用降低的因素，主要包括气孔的部分关闭导致的气孔限制和叶肉细胞光合活性的下降导致的非气孔限制两类[26]。气孔因素是指由于气孔关闭，造成Ci和Gs降低，此时Pn的下降主要由气孔因素引起；相反，叶片Pn的降低伴随着Ci的升高，此时光合作用的主要限制因素是非气孔因素[27]。本研究中，Zn0和Zn2处理的Pn、Tr、Gs的下降伴随着Ci值的上升，因此缺锌造成Pn下降的原因为非气孔限制因素，这与前人在马铃薯[28]、灰杨[29] 等植物上的研究结果一致。叶绿体是光合作用的重要细胞器，叶绿体中所含的叶绿素是最主要的光合色素[30]。本研究表明，苹果幼树叶片叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素含量在Zn0处理下显著降低，叶绿素a/b值上升。叶绿素a/b可以反映捕光色素复合体Ⅱ在含有叶绿素的结构中的比重，叶绿素a/b高对光能的捕获减少，叶绿素a/b低预示着叶片对光能的捕获增多[31-32]。本研究中，缺锌胁迫致使叶绿素a/b值升高，表明树体锌营养不足造成叶片对光能的捕获减少, 降低可能由缺锌导致光合机构遭受破坏的风险。脱镁叶绿酸a加氧酶(PAO)通过破坏叶绿素的卟啉环结构而导致绿色的丧失，是叶绿素降解代谢的关键酶，相关研究[33-34]表明，一些植物激素尤其是GA3，可以通过抑制 PAO基因的表达，从而延迟叶绿素含量的降低。本试验结果表明，MdPAO相对表达量在Zn0处理下显著上升，推测可能是由于苹果幼树在缺锌胁迫下，叶片中GA3含量下降，不能有效抑制叶绿素降解关键酶基因MdPAO的表达，迫使其表达量升高，引起叶绿素降解代谢加快。被子植物叶绿素合成由15个步骤组成，由L-谷氨酰-tRNA到5-氨基乙酰丙酸( ALA) 的生物合成过程是整个叶绿素合成的重要组成部分，ALA合成上游的一个关键酶谷氨酰-tRNA还原酶是由HEMA1基因编码。在本研究中，MdHEMA1相对表达量在Zn0处理下显著上升，可能是由于苹果叶片首先在极度缺锌的条件下叶绿素降解代谢加快，引起植物产生反馈调节机制诱导叶绿素合成代谢途径中的关键酶基因即MdHEMA1表达量升高，但所合成的叶绿素依然不能补偿由缺锌所造成的叶绿素降解损失。
叶绿素荧光参数分析有助于探明光合机构受逆境胁迫伤害的程度[35]。本研究结果表明，‘天红2号/冀砧2号’苹果幼树在锌供应不足条件下Fo显著上升，Fv/Fm、ΦPSⅡ、qP及ETR显著下降。Fo是判断PSⅡ反应中心运转情况的重要指标，暗适应下，Fv/Fm降低的同时，若伴随有Fo的升高，则可明确PSⅡ反应中心已经遭到破坏[36]。Fv/Fm作为反映PSⅡ活性中心的光能转换效率参数，只有在发生光抑制时才会降低。结合本研究结果，‘天红2号/冀砧2号’幼树在缺锌胁迫下发生了明显光抑制，PSⅡ反应中心遭到破坏；ΦPSⅡ、qP及ETR的下降说明幼树叶绿体中的光合原初电子传递受到抑制，阻碍了光能向化学能的转化，降低了碳的同化能力，最终表现为Pn的下降；而NPQ在缺锌胁迫下的显著上升，说明苹果自身保护其在缺锌胁迫下通过热耗散的方式耗散过剩的光能，这是Pn下降的又一重要因素[37]。
4. 结论
缺锌胁迫下，‘天红2号/冀砧2号’幼树叶片生长素合成基因MdYUCCA4a和MdYUCCA6a相对表达量显著降低，IAA合成受阻，导致IAA和GA3含量降低，进而影响树体生长。PSⅡ反应中心和PSⅡ氧化传递链在缺锌胁迫下受到一定损伤，造成PSⅡ活性下降，并加剧叶绿素降解，导致光合作用降低；同时叶绿素降解基因MdPAO的高表达引起树体产生反馈调节机制来进行自我保护，诱导叶绿素合成代谢途径中的关键酶基因MdHEMA1表达量升高，但所合成的叶绿素依然不能补偿由缺锌所造成的叶绿素降解损失。
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图 1 不同锌浓度处理下‘天红2号/冀砧2号’幼树
Figure 1. ‘ Tianhong 2/Jizhen 2 ’ saplings under different Zn concentrations
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图 2 缺锌胁迫对MdHEMA1和MdPAO相对表达量的影响
注：柱上不同小写字母表示处理间差异显著 (P<0.05)
Figure 2. Effects of Zn deficiency on the relative expression levels of MdHEMA1 and MdPAO
Note: Different lowercase letters above the bars indicat significant difference among treatments (P<0.05)
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图 3 缺锌胁迫对MdYUCCA4a和MdYUCCA6a相对表达量的影响
注：柱上不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)
Figure 3. Effects of Zn deficiency on the relative expression levels of MdYUCCA4a and MdYUCCA6a
Note: Different lowercase letters above the bars indicat significant difference among treatments (P<0.05)
表 1 实时荧光定量PCR基因引物序列
Table 1 Primer sequences for the real-time PCR quantification
基因 Gene 引物序列 Primer sequences (5'−3') F 引物序列 Primer sequences (5'−3') R β-Actin GGATTTGCTGGTGATGATGCT AGTTGCTCACTATGCCGTGCT MdHEMA1 GAACATGCACGCTCTTAAC CGAGTTGAAGATTACACCAG MdPAO CAAATGAAGGCAACCCACGG AGTCTTCCCTGGTGCCATTG MdYUCCA4a TAGGCAACACAGACCAATTAGG ACAATGCTCCAACATCAAGAAC MdYUCCA6a GGACTACTTGGTGCCTCAATGGA ATGATGGTGGTGATGATGATGATAGTG 
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表 2 缺锌胁迫对‘天红2号/冀砧2号’幼树生长和锌含量的影响
Table 2 Effects of zinc deficiency on the growth and zinc content of ‘Tianhong 2/Jizhen 2’ saplings
处理
Treatment新梢生长量
Shoot length
(cm)叶面积
Leaf area
(cm2)锌含量
Zn content
(mg/kg)Zn0 11.00±1.73 c 13.57±2.85 c 10.47±0.45 c Zn2 16.67±1.15 b 20.73±3.50 b 17.27±0.53 b Zn4 23.00±3.61 a 27.75±1.41 a 22.25±0.29 a 注：同列数据后不同小写字母表示处理间差异显著 (P<0.05)。
Note: Values followed by different lowercase letters in a column indicate significant difference among treatments (P<0.05).
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表 3 缺锌胁迫对‘天红2号/冀砧2号’幼树叶片叶绿素含量的影响
Table 3 Chlorophyll content in leaves of ‘Tianhong 2/Jizhen 2’ saplings under different Zn concentrations
处理
Treatment叶绿素a (mg/g)
Chlorophyll a叶绿素b (mg/g)
Chlorophyll b总叶绿素 (mg/g)
Total chlorophyll叶绿素a/b
chlorophyll a/bZn0 1.06±0.02 c 0.36±0.01 c 1.42±0.03 c 2.91±0.02 a Zn2 1.76±0.13 b 0.67±0.08 b 2.44±0.21 b 2.64±0.14 b Zn4 2.08±0.09 a 1.02±0.07 a 3.11±0.06 a 2.15±0.03 c 注：同列数据后不同小写字母表示处理间差异显著 (P<0.05)。
Note: Values followed by different lowercase letters in a column indicate significant difference among treatments (P<0.05).
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表 4 缺锌胁迫对‘天红2号/冀砧2号’幼树光合参数的影响
Table 4 Photosynthetic parameters of ‘Tianhong 2 / Jizhen 2’ saplings under different Zn concentrations
处理
Treatment净光合速率 [µmol/(m2·s)]
Pn蒸腾速率 [mmol/(m2·s)]
Tr气孔导度 [mmol/(m2·s)]
Gs胞间CO2浓度 [µmol/mol]
CiZn0 9.60±0.17 c 12.45±0.37 c 247.04±17.63 c 363.40±5.07 a Zn2 10.90±0.41 b 16.59±0.52 b 342.51±10.74 b 348.28±8.27 b Zn4 12.53±0.34 a 19.63±0.54 a 416.95±5.64 a 329.41±5.95 c 注：同列数据后不同小写字母表示处理间差异显著 (P<0.05)。
Note: Values followed by different lowercase letters in a column indicate significant difference among treatments (P<0.05).
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表 5 缺锌胁迫对‘天红2号/冀砧2号’幼树叶片叶绿素荧光参数的影响
Table 5 Chlorophyll fluorescence parameters of the leaves of ‘Tianhong 2/Jizhen 2’ saplings under different Zn concentrations
处理
Treatment初始荧光
FoPSⅡ最大光化学效率
Fv/FmPSⅡ实际光化学效率
ΦPSⅡ光化学猝灭系数
qP表观光合电子传递效率
ETR非光化学猝灭系数
NPQZn0 347.67±4.04 a 0.78±0.01 c 0.20±0.01 c 0.24±0.03 c 72.19±11.28 c 0.57±0.03 a Zn2 335.00±5.51 b 0.81±0.01 b 0.24±0.01 b 0.34±0.02 b 85.79±1.61 b 0.43±0.04 b Zn4 311.33±7.23 c 0.83±0.01 a 0.31±0.01 a 0.43±0.03 a 102.63±5.97 a 0.24±0.07 c 注：同列数据后不同小写字母表示处理间差异显著 (P<0.05)。
Note: Values followed by different lowercase letters in a column indicate significant difference among treatments (P<0.05).
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表 6 缺锌胁迫下‘天红2号/冀砧2号’幼树叶片内源激素的含量 (ng/g)
Table 6 Content of endogenous hormones in the leaves of ‘Tianhong 2/Jizhen 2’ saplings under different Zn concentrations
处理 Treatment 吲哚乙酸 IAA 赤霉素 GA3 玉米素核苷 ZR Zn0 34.71±0.03 c 121.90±0.38 c 11.48±0.67 b Zn2 43.92±0.08 b 148.55±0.09 b 19.30±2.74 a Zn4 72.57±0.35 a 240.38±0.97 a 9.49±2.31 b 注：同列数据后不同小写字母表示处理间差异显著 (P<0.05)。
Note: Values followed by different lowercase letters in a column indicate significant difference among treatments (P<0.05).
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期刊类型引用(1)
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